細(xì)胞因子電泳純度非還原型SDSPAGE測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、.細(xì)胞因子電泳純度非還原型SDSPAGE測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程依據(jù)：中華人民XX國(guó)藥典2005年版第三部。X圍：適用于細(xì)胞因子純度的檢測(cè)。目的：檢測(cè)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)純度。原理：蛋白質(zhì)具有不同的電荷和分子量，在經(jīng)過(guò)陰離子去污劑SDS處理后，蛋白質(zhì)分子上的電荷被中和，在聚丙稀酰胺凝膠電泳時(shí)，不同的蛋白質(zhì)按照其分子量大小進(jìn)行分布，電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。由于不連續(xù)的PH梯度作用，樣品被壓縮成一條狹窄區(qū)帶，采用染色液染色，經(jīng)掃描儀掃描膠片可及時(shí)觀察結(jié)果。內(nèi)容：1 材料11樣品：經(jīng)二人復(fù)核批號(hào)無(wú)誤后檢測(cè)12試劑甲醇 CH3OH分析純無(wú)水乙醇 CH3CH2OH分析純濃鹽酸 HCl分析純甘油 C3H8O3

2、 分析純硝酸銀 AgNO3 分析純重鉻酸鉀 K2Cr2O7分析純正丁醇 C4H9OH 分析純甲醛 HCHO分析純丙烯酰胺 CH2CHCONH2 分析純甲叉雙丙烯酰胺（CH2CHCONH2）2CH2 分析純過(guò)硫酸銨 （NH4）2S2O8 分析純TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析純甘氨酸 C2H5NO2 分析純SDS（十二烷基硫酸鈉）C12H25O4SNa 分析純乙酸 CH3COOH 分析純碳酸鈉 Na2CO3 分析純溴酚藍(lán) C19H10Br4O5S 分析純13注射用水：符合中華人民XX國(guó)藥典2005年版要求。14設(shè)備141扭力天平 XX第二天平儀器廠142垂

3、直板狀電泳槽東方儀器廠143恒溫恒流電泳儀法瑪西亞公司144快速電泳槽BIORADUSA145全自動(dòng)掃描儀CS-930日本島津146TS-1型搖床15器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平皿、1000ml燒杯、80ml燒杯，以上器皿經(jīng)本室洗刷組處理。2 方法21準(zhǔn)備工作211工作環(huán)境：控制區(qū)，確認(rèn)場(chǎng)地清場(chǎng)合格，摘下“清場(chǎng)合格”標(biāo)志牌，掛上“使用中”標(biāo)志牌。212調(diào)試儀器設(shè)備2121恒溫恒流電泳儀工作狀態(tài)良好，已經(jīng)掛“備用”標(biāo)志牌。2122全自動(dòng)掃描儀工作狀態(tài)良好，已掛“備用” 標(biāo)志牌。2123扭力天平工作狀態(tài)良好，已掛“備用” 標(biāo)志牌。213摘下扭

4、力天平“備用” 標(biāo)志牌，掛“運(yùn)行中” 標(biāo)志牌。214配液：以下溶液的配制完成后，均需經(jīng)二人復(fù)核無(wú)誤后，在瓶外貼標(biāo)簽，注明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)及配制日期。2141聚丙烯酰胺凝膠母液 100ml用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取丙烯酰胺30g, 甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，過(guò)濾，置于棕色瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，4冰箱放置。一般不超過(guò)12個(gè)月。2142分離膠緩沖液 100ml用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH8.8，補(bǔ)加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人復(fù)核，貼簽

5、，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，4冰箱放置。2143濃縮膠緩沖液 100ml用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加濃鹽酸調(diào)pH6.8，補(bǔ)加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，4冰箱放置。2144 1%SDS 50ml 用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取SDS 0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫保存。2145 1% TEMED 50ml用吸管準(zhǔn)確吸取TEMED0.5ml，溶于50ml注射用水中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明

6、溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，4冰箱放置。2146 1% 過(guò)硫酸銨 50ml 用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取過(guò)硫酸銨0.5g，溶于50ml注射用水中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，4冰箱放置。2147電極緩沖液 3000ml 用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取Tris9g、甘氨酸43.2g、SDS3g，溶于2000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫貯存。2148固定液 500ml 用量筒準(zhǔn)確量取甲醇250ml，乙酸50ml，補(bǔ)加注射用水至500ml，置于500ml瓶中，二人復(fù)核，貼簽

7、，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫貯存。2149洗液 3000ml 用量筒準(zhǔn)確量取無(wú)水乙醇300ml，乙酸150ml，補(bǔ)加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫貯存。21410重鉻酸鉀溶液 200ml用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取重鉻酸鉀10g，加注射用水至200ml；加濃HNO32ml搖勻溶解，置于棕色瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫保存。21411硝酸銀溶液 200ml用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取硝酸銀0.4g，加注射用水至200ml，置于棕色瓶中，避光保存，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液

8、的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，限當(dāng)次試驗(yàn)使用。21412顯色液 3000ml 用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取Na2CO318g，加注射用水至3000ml，溶解后，加0.6ml甲醛，置于3000ml三角瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫貯存。21413終止液 500ml 用吸管準(zhǔn)確吸取乙酸5ml，溶于500ml注射用水中，置于500ml瓶中，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，常溫貯存。21414樣品處理液（非還原型） 10ml用扭力天平準(zhǔn)確稱(chēng)取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚藍(lán)0.189g，溶于2ml注射用水中，加入甘油4ml，濃

9、HCl0.189ml，加注射用水定容至10ml，二人復(fù)核，貼簽，標(biāo)明溶液的名稱(chēng)、濃度、體積、批號(hào)、配制日期，4冰箱放置。4貯存。215樣品準(zhǔn)備：將樣品自冰箱內(nèi)拿出，放置室溫融化后，將樣品與樣品處理液按3：1（V/V）的比例混勻，沸水處理35分鐘，待用。22操作過(guò)程2211分離膠（13.5%）制備聚丙烯酰胺膠母液14.4ml, 分離膠緩沖液8ml,1%SDS3.2ml，注射用水 3.2ml，1%過(guò)硫酸銨1.6ml，1%TEMED1.6ml，制成膠量32ml。2212濃縮膠(4.5%)的制備聚丙烯酰胺凝膠母液2.4ml, 濃縮膠緩沖液4ml, 注射用水4.8ml，1%SDS 1.6ml，1%過(guò)硫酸

10、銨1.6ml，1%TEMED1.6ml，pH6.8，成膠量16ml。2213灌膠灌膠時(shí)先將電泳槽陽(yáng)極側(cè)用透析紙包上，在電泳槽內(nèi)加滿水，靠水壓封住陽(yáng)極側(cè)縫隙，以免膠溶液漏出；在兩玻璃板間加分離膠，加膠完畢后，用注射器沿玻璃板在液面上覆蓋一層（約0.3cm高）正丁醇；待膠凝固后，將電泳槽內(nèi)注射用水及膠表面的正丁醇倒掉，并用濾紙吸干；向電泳槽內(nèi)加入電極緩沖液、在濃縮膠位置插上梳子，在分離膠上加濃縮膠，待膠凝固后抽去梳子。222加樣:將處理后樣品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入樣品槽內(nèi).223電泳: 打開(kāi)電泳儀，摘下“備用”標(biāo)志牌，掛“運(yùn)行”標(biāo)志牌，調(diào)定電流，起始電流15mA，待指示線跑至分離膠處，改

11、電流為25 mA，電泳時(shí)間約為2.5小時(shí)，待指示劑至底線處，停止電泳,關(guān)閉電泳儀，摘下“運(yùn)行”標(biāo)志牌,掛“備用”標(biāo)志牌。224染色電泳完畢后取下膠片，置于5倍膠體積的固定液內(nèi)12h（或室溫振蕩30分鐘）；洗液洗三次，每次10分鐘，37搖床內(nèi)振蕩；取5ml重鉻酸鉀母液加入200ml注射用水中，將膠片置其中,避光,振蕩10分鐘；用注射用水洗數(shù)次至黃色本底變白；加入新配制的0.2 %AgNO3溶液白熾燈下照射30分鐘；水洗五次；顯色液500ml中加甲醛0.35ml，待樣品蛋白帶及分子量蛋白帶清晰后棄去顯色液加入終止液。225掃描2251打開(kāi)掃描儀,摘下“備用”標(biāo)志牌,掛上“運(yùn)行”標(biāo)志牌。2252對(duì)膠

12、片進(jìn)行掃描,同時(shí)記錄下掃描結(jié)果。2253關(guān)閉掃描儀,摘下“運(yùn)行”標(biāo)志牌,掛“備用”標(biāo)志牌。226摘下場(chǎng)地“使用中”標(biāo)志牌,掛“待處理”標(biāo)志牌。 3 結(jié)果判定31判定標(biāo)準(zhǔn):染色后膠片經(jīng)掃描儀掃描，樣品蛋白帶含量應(yīng)在95%以上，二聚體量不超過(guò)5%。32判定結(jié)果填寫(xiě)記錄。4 清場(chǎng)41需要低溫貯存的液體放入冰箱，避光的液體放入陰暗處。42稱(chēng)藥之后將藥品瓶蓋蓋緊，放回藥品柜。43關(guān)閉扭力天平，清潔干凈后放回原處，掛“備用”標(biāo)志牌。44清潔工作臺(tái)面，用專(zhuān)用抹布擦凈，地面用專(zhuān)用拖布拖凈。45用過(guò)的玻璃器皿用純化水沖洗干凈后返回洗刷組。46填寫(xiě)清場(chǎng)記錄。47清場(chǎng)后由車(chē)間工序負(fù)責(zé)人或質(zhì)量監(jiān)督員檢查合格后,摘下“

13、待處理”標(biāo)志牌,掛“清場(chǎng)合格”標(biāo)志牌。5 注意事項(xiàng)51本實(shí)驗(yàn)所用SDS需高純度SDS,如不純需重結(jié)晶。52樣品必須經(jīng)沸水處理3-5分鐘,以免有亞穩(wěn)聚合物存在。 附:SDS-PAGE(快速電泳)準(zhǔn)備工作同前。1 制膠11分離膠制備：（13.5%）聚丙烯酰胺凝膠母液7.2ml, 分離膠緩沖液4ml,1%SDS3.2ml，注射用水 1.6ml，1%過(guò)硫酸銨0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成膠量16ml。12濃縮膠的制備(4.5%)聚丙烯酰胺凝膠母液1.2ml, 濃縮膠緩沖液2ml,注射用水2.4ml，1%SDS0.8ml，1%過(guò)硫酸銨0.8ml，1%TEMED0.8ml，pH6.8，成膠量8ml。13灌膠：先