核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用

1、核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用衛(wèi)生部臨檢中心深圳市血液中心血液病毒核酸檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室葉賢林2022-7-52核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的建立n人員n場(chǎng)地n檢測(cè)方法選擇n實(shí)施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)）2022-7-53核酸實(shí)驗(yàn)室人員要求n資質(zhì):經(jīng)過(guò)臨檢中心PCR培訓(xùn)班培訓(xùn)并取得上崗證；通過(guò)血站核酸實(shí)驗(yàn)室崗前培訓(xùn)考試合格。n 培訓(xùn):無(wú)”核酸”的概念形成, 防污染的概念良好工作習(xí)慣的培養(yǎng). 報(bào)告的正確發(fā)放.n后備人員的培養(yǎng).2022-7-54試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)樣本離心交接區(qū)報(bào)告發(fā)放區(qū)核酸實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地

2、2022-7-55 方法選擇: TMA與PCRTMAPCR擴(kuò)增原理擴(kuò)增原理模擬自然模擬自然 DNA 轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄成 mRNA 的過(guò)程的過(guò)程模擬自然模擬自然DNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程靶目標(biāo)靶目標(biāo)RNADNA酶酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶反應(yīng)體系反應(yīng)體系兩種酶，兩條引物，兩種酶，兩條引物，dNTP, NTP一種酶，一對(duì)引物，一種酶，一對(duì)引物，dNTP溫度條件溫度條件恒溫（恒溫（41.5 ）循環(huán)導(dǎo)熱循環(huán)導(dǎo)熱（變性，退火，延伸）（變性，退火，延伸）擴(kuò)增儀器擴(kuò)增儀器水浴箱或者加熱塊水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀熱循環(huán)儀擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物RNADNA擴(kuò)增速度擴(kuò)增速度每個(gè)

3、循環(huán)可以生成每個(gè)循環(huán)可以生成100-1000個(gè)復(fù)制物，個(gè)復(fù)制物，在在15-30分鐘內(nèi)可增加分鐘內(nèi)可增加10億倍復(fù)制物億倍復(fù)制物以以2n擴(kuò)增，擴(kuò)增，23 h就能將待就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大10億倍億倍2022-7-56 TMA的優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)自自動(dòng)動(dòng)化程度高化程度高靈靈敏度高敏度高擴(kuò)擴(kuò)增效率高：增效率高：10n 不能不能絕對(duì)絕對(duì)定量定量2022-7-57 PCR的優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)易于自易于自動(dòng)動(dòng)化化靈靈敏度高敏度高 擴(kuò)擴(kuò)增效率高增效率高匯匯集拆分集拆分過(guò)過(guò)程繁程繁瑣瑣 拆分可拆分可減減低非反低非反應(yīng)應(yīng)性比率性比率2022-7-58核酸試劑質(zhì)控核酸試劑質(zhì)控n試劑的確認(rèn) 試劑運(yùn)輸過(guò)程的控制

4、(溫度條件時(shí)限) 靈敏度的要求 內(nèi)標(biāo)的要求n試劑涵蓋的基因型 2022-7-59檢測(cè)流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標(biāo)本檢測(cè)流程2022-7-510檢測(cè)流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標(biāo)本檢測(cè)流程2022-7-511檢測(cè)流程(3):平行檢測(cè)流程樣本清點(diǎn)交接核酸單份檢測(cè)常規(guī)檢測(cè)合格標(biāo)本不合格標(biāo)本陰性標(biāo)本反應(yīng)性標(biāo)本合格標(biāo)本發(fā)布結(jié)果單項(xiàng)目反應(yīng)性無(wú)反應(yīng)性 陽(yáng)性或可疑結(jié)果淘汰 陽(yáng)性或可疑結(jié)果淘汰2022-7-512標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫(xiě)n核酸實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與管理規(guī)范n核酸實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測(cè)流程n核酸實(shí)驗(yàn)室崗位職責(zé)n核酸實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范n核酸實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備管理規(guī)范n核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)本管理規(guī)范n核酸實(shí)驗(yàn)室室間

5、質(zhì)量評(píng)價(jià)規(guī)范n核酸實(shí)驗(yàn)室記錄管理制度n核酸實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)規(guī)范n核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者追蹤規(guī)程n核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)急措施2022-7-513標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫(xiě)n核酸標(biāo)本離心交接操作規(guī)程n核酸標(biāo)本提取及匯集操作規(guī)程(科華) n核酸標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)操作規(guī)程（科華）n核酸標(biāo)本全自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）n核酸標(biāo)本檢測(cè)報(bào)告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）n核酸標(biāo)本檢測(cè)復(fù)檢操作規(guī)程n生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程n可移動(dòng)紫外線燈標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程n低溫高速離心機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程nABI 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 2022-7-514 核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施污染措施n主要的污染源n擴(kuò)增產(chǎn)物n標(biāo)本之間產(chǎn)生的氣

6、溶膠n操作人員n手n衣服2022-7-515核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施污染措施n要有獨(dú)立的空氣處理系統(tǒng).n各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通n實(shí)驗(yàn)室保持合理的通風(fēng)n對(duì)各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進(jìn)行標(biāo)示，專(zhuān)區(qū)專(zhuān)用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）n空氣：試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)n試劑陽(yáng)性對(duì)照儲(chǔ)存在標(biāo)本制備區(qū)n使用帶濾芯的吸頭 2022-7-516核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施污染措施n使用外排式的生物安全柜n自配試劑應(yīng)分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應(yīng)廢棄n使用次氯酸鈉溶液消毒（臺(tái)面、地面）n使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）n使用紫外線照射（空氣和臺(tái)面）n使用無(wú)水乙醇溶液（空氣噴霧）2022-

7、7-517核酸實(shí)驗(yàn)室污染后措施污染后措施n實(shí)驗(yàn)室污染后，如何處理？n通風(fēng)n次氯酸鈉溶液（擴(kuò)增區(qū)不宜使用）nHCL溶液（吸頭）n紫外線（固定、移動(dòng)）n酒精噴灑（空氣）n應(yīng)設(shè)計(jì)有備用實(shí)驗(yàn)室 : 如開(kāi)設(shè)獨(dú)立的報(bào)告發(fā)放區(qū)作為備用 2022-7-518中心理念：監(jiān)測(cè)全程的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過(guò)程的效率。血篩核酸檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)的作用血篩核酸檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)的作用內(nèi)標(biāo)的作用質(zhì)控整個(gè)反應(yīng)。提示假陰性檢測(cè)結(jié)果。監(jiān)控反應(yīng)的外部條件內(nèi)標(biāo)濃度要合適保持適度的內(nèi)標(biāo)失控.( ChiSq Intercept 1 -4.6852 1.5659 -7.7542 -1.6161 8.95 0.0028log10(Dose

8、) 1 4.8000 1.4699 1.9190 7.6810 10.66 0.0011 應(yīng)用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果2022-7-522 Probit Analysis on Dose Probability Dose 95% Fiducial Limits 0.50 9.57017 5.12038 15.55110 0.55 10.63175 6.02869 17.84047 0.60 11.83113 7.02737 20.77334 0.65 13.21316 8.12392 24.64098 0.70 14.84467 9.33581 29.90750 0.75 16.8

9、3205 10.69944 37.36963 0.80 19.35973 12.28641 48.54111 0.85 22.78900 14.24179 66.74000 0.90 27.97953 16.90417 101.07479 0.91 29.40116 17.58727 111.93157 0.92 31.02755 18.34915 125.13015 0.93 32.91988 19.21204 141.54165 0.94 35.17006 20.20878 162.54851 0.95 37.92474 21.39086 190.498222022-7-5232022-7

10、-524陽(yáng)性獻(xiàn)血者的追蹤n溝通原則:專(zhuān)業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。n溝通方式：電話、面談n溝通技巧：表?yè)P(yáng)和鼓勵(lì)、合理解釋、知情、適當(dāng)?shù)膯?wèn)候2022-7-525獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)不合格解釋 n由于核酸檢測(cè)方法目前尚不能排除假陽(yáng)性，對(duì)由于核酸檢測(cè)方法目前尚不能排除假陽(yáng)性，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進(jìn)入實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進(jìn)入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測(cè)不合格血液僅表示該血液臨床，因此核酸檢測(cè)不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不能用于臨床輸血。n不作為獻(xiàn)血者健康體檢指標(biāo)。不作為獻(xiàn)血者健康體檢指標(biāo)。n更

11、不宜作為疾病診療指標(biāo)。更不宜作為疾病診療指標(biāo)。n獻(xiàn)血者獻(xiàn)血權(quán)利仍保留。獻(xiàn)血者獻(xiàn)血權(quán)利仍保留。2022-7-526關(guān)于核酸檢測(cè)的解釋n匯集結(jié)果成反應(yīng)性,拆分結(jié)果為陰性.n內(nèi)標(biāo)失敗.nELISA(+),核酸結(jié)果為(-)nELISA(-),核酸結(jié)果為(+)n核酸單檢結(jié)果反應(yīng)性與血液發(fā)放.n化學(xué)發(fā)光法與核酸檢測(cè).2022-7-5271.1.靈敏度：匯集池大小要滿(mǎn)足靈敏度要求。靈敏度：匯集池大小要滿(mǎn)足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻(xiàn)血者漏檢。靈敏度太低，病毒低載量獻(xiàn)血者漏檢。HBV DNA HBV DNA 靈敏度宜靈敏度宜5050拷貝拷貝/ml./ml.2.2.引物是否有效性引物是否有效性, ,能否

12、檢測(cè)亞型和突變株感染。能否檢測(cè)亞型和突變株感染。3.3.假陽(yáng)性，防污染措施（血篩主要要防止假陽(yáng)性，防污染措施（血篩主要要防止RNARNA酶的酶的污染）。污染）。4.4.核酸提取效率與自動(dòng)化核酸提取效率與自動(dòng)化. .5.5.需要規(guī)范化場(chǎng)地和高素質(zhì)的操作人員需要規(guī)范化場(chǎng)地和高素質(zhì)的操作人員. .6.6.參加國(guó)際間室間質(zhì)控參加國(guó)際間室間質(zhì)控, ,提高檢測(cè)水準(zhǔn)提高檢測(cè)水準(zhǔn). .血液核酸篩查注意的問(wèn)題血液核酸篩查注意的問(wèn)題2022-7-528深圳血液中心核酸檢測(cè)概況n對(duì)161228人份酶免疫檢測(cè)結(jié)果陰性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，共檢出33例不相同HBV DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者，總比率為1：4885。n檢出anti-H

13、CV陰性、 HCV RNA陽(yáng)性1例，定量結(jié)果為1.2105IU/ml。3個(gè)月后追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。 2022-7-529項(xiàng)目項(xiàng)目科華（自動(dòng)化）科華（自動(dòng)化）科華（半自科華（半自動(dòng)化）動(dòng)化）美國(guó)羅氏美國(guó)羅氏上海浩源上海浩源凱榮凱榮（CHIROCHIRON N）方法學(xué)方法學(xué)全自動(dòng)提取全自動(dòng)提取+實(shí)實(shí)時(shí)熒光時(shí)熒光PCR病毒離心富病毒離心富集集+半自動(dòng)半自動(dòng)提取提取+實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光熒光PCR全自動(dòng)提全自動(dòng)提取取+ PCR-ELISA半自動(dòng)提半自動(dòng)提取取+ PCR+毛細(xì)管毛細(xì)管電泳分電泳分離離TMA匯集量匯集量 845ul8150ul2445ul5200ul

14、500 ul 單人單人份份檢測(cè)數(shù)檢測(cè)數(shù)6849637041315121412514603HBV DNA陽(yáng)陽(yáng)性數(shù)性數(shù)122838HBV陽(yáng)性比陽(yáng)性比率率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸檢測(cè)概況2022-7-530HBV DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤情況 n對(duì)17位HBV DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤，9位獻(xiàn)血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。n4例呈窗口期特征（或部分），n2例獻(xiàn)血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象n1例獻(xiàn)血者原為乙肝大三陽(yáng)患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻(xiàn)血，常規(guī)檢測(cè)為合格，核酸檢測(cè)HBV DNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛?yáng)性2022-7-5312022-7-53

15、22022-7-5332022-7-5342022-7-5352022-7-536 HBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤概況追蹤時(shí)間(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18+21241504528未檢出9126未檢出15631未檢出21429未檢出2022-7-537 1號(hào)獻(xiàn)血者在追蹤時(shí)表明曾經(jīng)是大三陽(yáng),治療轉(zhuǎn)陰后獻(xiàn)血,被核酸檢出陽(yáng)性,7天后 HBsAg 檢測(cè)(+). 2022-7-5382022-7-5391.Pooling by STAR processor2.Virus enrichment by centrfugation3. Extracted by KHB-10004. Amplified and detected by ABI73002022-7-5402022-7-5411.pooling and extraction by STAR LET2. Amplification and detection by ABI7300Automation process2022-7-5422022-7-5432022-7-5442