@薄層色譜法(TLC)講稿(xin)

1、薄層色譜法(TLC)的規(guī)范化技術(shù)要求 1.什么是薄層色譜法？系將適宜的固定相(吸附劑或載體)涂布于玻璃板、塑料或鋁基上，使成一均勻薄層，待點(diǎn)樣、展開(kāi)后，與適宜的對(duì)照物按同法在同板上所得的色譜圖對(duì)比，并可用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定的方法。薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱(chēng)薄層層析，屬于固液吸附色譜。是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01g）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500mg的

2、樣品。因此又可用來(lái)精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外，。 TLC與與HPLC相比，一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就相比，一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就是流動(dòng)相的選擇具有更大的靈活性，流是流動(dòng)相的選擇具有更大的靈活性，流動(dòng)相的選擇的目的是使絕大部分樣品的動(dòng)相的選擇的目的是使絕大部分樣品的Rf值位于值位于0.10.7之間并達(dá)到較好的分之間并達(dá)到較好的分離，與此對(duì)應(yīng)的是流動(dòng)相要有適當(dāng)?shù)膹?qiáng)離，與此對(duì)應(yīng)的是流動(dòng)相要有適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和組成。流動(dòng)相強(qiáng)度越大，溶質(zhì)度和組成。流動(dòng)相強(qiáng)度越大，溶質(zhì)Rf值值越大，但很可能降低分離能力；另外單越大，但很可能降低分離能力；另外單一溶劑很難分離較復(fù)雜

3、的混合物、根據(jù)一溶劑很難分離較復(fù)雜的混合物、根據(jù)相似相溶原理，要使用多元溶劑體系。相似相溶原理，要使用多元溶劑體系。薄層色譜的特點(diǎn)： 靈敏度及分辨率高、分離快速、操作方便、同時(shí)分離多個(gè)樣品、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單。由于這些特點(diǎn)，薄層色譜在實(shí)際工作中的應(yīng)用十分廣泛。 一般展開(kāi)劑體系選擇如下：根據(jù)分離樣一般展開(kāi)劑體系選擇如下：根據(jù)分離樣品性質(zhì)、薄層色譜板性質(zhì)選擇一個(gè)二元品性質(zhì)、薄層色譜板性質(zhì)選擇一個(gè)二元溶劑體系，通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑比例以尋求適溶劑體系，通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑比例以尋求適合合Rf值，適合的值，適合的Rf值找到后，再尋求極值找到后，再尋求極性參數(shù)相同的二元溶劑體系兩個(gè)，以這性參數(shù)相同的二元溶劑體系兩

4、個(gè)，以這三個(gè)組成為三點(diǎn)組成一個(gè)三角形，則可三個(gè)組成為三點(diǎn)組成一個(gè)三角形，則可看到：三角形頂點(diǎn)是二元體系，邊是三看到：三角形頂點(diǎn)是二元體系，邊是三元體系，三角形內(nèi)是四元體系，并且極元體系，三角形內(nèi)是四元體系，并且極性一致，可根據(jù)幾何原理得出任一點(diǎn)組性一致，可根據(jù)幾何原理得出任一點(diǎn)組成，這種方法較為直觀，也較簡(jiǎn)單。成，這種方法較為直觀，也較簡(jiǎn)單。I0I2I1前沿原點(diǎn) 薄層板示意圖比移值 ：Rf=組分移動(dòng)距離溶劑前沿移動(dòng)距離Rx=樣品Rf值參照物的Rf值相對(duì)比移值 ： 2.儀器與材料薄層板點(diǎn)樣器展開(kāi)容器顯色設(shè)備色譜檢視裝置 2.1薄層板2.1.1薄層板分類(lèi)預(yù)制薄層板和自制薄層板(制備方法)普通薄層板

5、和高效薄層板(分離效果)正相薄層板和反相薄層板(流動(dòng)相極性)硅膠、硅膠F254、氧化鋁、纖維素、聚酰胺薄層板和C18鍵合相、氨基鍵合相、腈基鍵合相、二醇基鍵合相薄層板(固定相類(lèi)型分類(lèi)) 2.1薄層板2.1.2自制薄層板: 須能保證色譜質(zhì)量；對(duì)薄層板需特別處理和化學(xué)改性可用；節(jié)約成本。玻璃板要求：表面光潔、平整，厚1-2mm，潔凈。規(guī)格：10cm10cm、10 cm15cm、10 cm20cm、20 cm20cm2.1薄層板最常用固定相：硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254；氧化鋁；硅澡土；纖維素；聚酰胺等。吸附劑直徑10-40m黏合劑：10%-15%煅石膏、0.2%-0.5%羧甲基纖

6、維素鈉、淀粉、有機(jī)高分子聚合 物、特殊要求可用緩沖液、稀堿液等。2.2點(diǎn)樣器毛細(xì)管微量注射器半自動(dòng)及全自動(dòng)點(diǎn)樣器2.3展開(kāi)容器專(zhuān)用平底或雙槽展開(kāi)缸、蓋能密閉特殊水平展開(kāi)缸2.4顯色設(shè)備噴霧顯色：玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，用壓縮氣體可使試劑呈均勻細(xì)霧狀噴出浸漬顯色蒸氣熏蒸顯色2.5色譜檢視裝置可見(jiàn)紫外三用儀裝置可見(jiàn)紫外光源及相應(yīng)濾光片的暗箱拍攝圖像的設(shè)備3.操作方法3.1薄層板制備 自制方法：硅膠：1份固定相加3份水-研磨混合-涂布-晾干-活化-備用；纖維素：與水1：5或6；聚酰胺：與水1：4，或與甲醇1：3薄層板活化：硅膠、氧化鋁、硅澡土：110、30分鐘；纖維素：105 、30分鐘；聚酰胺：6

7、080、30分鐘用涂布器制板的要點(diǎn)：玻璃板要清潔；調(diào)漿要均勻；涂布后的薄層板應(yīng)低溫緩慢干燥。自制薄板要求：表面均勻、平整、光滑，無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損、無(wú)污染。薄層厚薄對(duì)Rf值影響：硅膠G板當(dāng)厚低于150m時(shí)， Rf值隨薄層的減低而增大，可變性大；板厚250 m ， Rf改變不顯著。薄層層析操作要點(diǎn)鋪板用的勻漿不宜薄層層析操作要點(diǎn)鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水水=1：23，硅膠，硅膠G:羧甲基纖維素羧甲基纖維

8、素鈉水溶液鈉水溶液=1:2。 研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。勻下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過(guò)載；涂層厚，顯色不那么薄，點(diǎn)樣易過(guò)載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開(kāi)劑的配響不是很大，影響最大的是展開(kāi)劑的配制和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和。制和展

9、開(kāi)系統(tǒng)的飽和。 3.2點(diǎn)樣形狀：圓點(diǎn)狀、窄細(xì)條狀點(diǎn)樣位置：距底邊1-1.5cm、點(diǎn)與點(diǎn)以不影響檢出為宜一般不少于0.8cm、圓點(diǎn)直徑不大于0.3cm、條帶寬0.5-1.0cm高效板間距可適當(dāng)縮小點(diǎn)樣點(diǎn)樣盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠如果有足夠的耐性，最好只用的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙般是無(wú)水乙

10、醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。吹干或放入干燥器里晾干。 3.3展開(kāi)以直立展開(kāi)為多展開(kāi)劑用量：展開(kāi)后仍留有三分之二以上體積為宜；浸入展開(kāi)劑的深度以距原點(diǎn)0.5cm為宜；展開(kāi)距離：8-15cm溶劑蒸氣預(yù)飽和：15-30分鐘展開(kāi)劑配制展開(kāi)劑配制選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為置，如果分層，取用體積大的一層作為展開(kāi)劑。絕對(duì)不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開(kāi)劑。絕對(duì)不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開(kāi)缸，振

11、搖展開(kāi)缸來(lái)配制展開(kāi)劑?；煺归_(kāi)缸，振搖展開(kāi)缸來(lái)配制展開(kāi)劑?；旌喜痪鶆蚝蜎](méi)有分液的展開(kāi)劑，會(huì)造成合不均勻和沒(méi)有分液的展開(kāi)劑，會(huì)造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對(duì)不同的分析任務(wù)有不同的要求，確度對(duì)不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。 混合展開(kāi)劑通常不能重復(fù)使用：低沸點(diǎn)物質(zhì)蒸發(fā)比高沸點(diǎn)多低沸點(diǎn)物質(zhì)蒸發(fā)比高沸點(diǎn)多濕度變化

12、濕度變化其中一種溶劑被優(yōu)先吸附其中一種溶劑被優(yōu)先吸附各組分間可能發(fā)生相互作用各組分間可能發(fā)生相互作用吸附劑中雜質(zhì)不斷流出引起組吸附劑中雜質(zhì)不斷流出引起組成改變成改變展開(kāi)系統(tǒng)的飽和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和 一般使用的是雙槽的展開(kāi)缸，一槽用來(lái)一般使用的是雙槽的展開(kāi)缸，一槽用來(lái)放展開(kāi)劑，另一槽可加入氨水或硫酸。放展開(kāi)劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開(kāi)的板放入兩槽間的平臺(tái)，斜架把待展開(kāi)的板放入兩槽間的平臺(tái)，斜架著，蓋上展開(kāi)缸的蓋子。讓展開(kāi)劑的蒸著，蓋上展開(kāi)缸的蓋子。讓展開(kāi)劑的蒸氣充滿展開(kāi)缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)氣充滿展開(kāi)缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在半到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在

13、半個(gè)小時(shí)左右。展開(kāi)時(shí)難免要打開(kāi)蓋子把個(gè)小時(shí)左右。展開(kāi)時(shí)難免要打開(kāi)蓋子把薄層板放入展開(kāi)劑中，不過(guò)對(duì)薄層板與薄層板放入展開(kāi)劑中，不過(guò)對(duì)薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動(dòng)作應(yīng)蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動(dòng)作應(yīng)該盡量輕、快該盡量輕、快 溫濕度的控制溫濕度的控制 溫濕度對(duì)薄層影響都很大。不凍結(jié)的前不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確

14、定。溫度變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過(guò)在另一展開(kāi)槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。過(guò)在另一展開(kāi)槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。 3.4顯色與檢視有色物：可直接日光下檢視熒光物：365nm紫外燈下觀察熒光色譜無(wú)色物：噴霧顯色劑、或進(jìn)行適宜處理顯色紫外吸收物：用熒光板在254nm紫外燈下觀察熒光淬滅物形成色譜由于通常用薄層色譜分析法進(jìn)行定量分析的過(guò)程中，薄層掃描儀是最為重要的，因此對(duì)它進(jìn)行略詳?shù)慕榻B。薄層掃描儀的基本結(jié)構(gòu)及主要功能基本是相同的，每臺(tái)儀器都包括光源、分光器、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理及信號(hào)輸出幾個(gè)部分。 典型的檢測(cè)方法是吸收檢測(cè)法，其基本測(cè)定

15、原理為，用一束長(zhǎng)寬可以調(diào)節(jié)的一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行整個(gè)斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束，根據(jù)光束被斑點(diǎn)吸收后強(qiáng)度的變化來(lái)確定組分的含量。 薄層色譜法的優(yōu)點(diǎn)特別適合我國(guó)國(guó)情，已成為許多實(shí)驗(yàn)室不可缺少的分離手段。該方法在科研、教學(xué)、臨床、生產(chǎn)等各個(gè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，分離對(duì)象也無(wú)所不包。 顯色劑的要求：至少可以把微克級(jí)的被分離物質(zhì)顯示出來(lái)；能給出一個(gè)確定的顯示區(qū)域；顯示區(qū)域有一定的穩(wěn)定 性。顯色劑可以分成兩大類(lèi)：一類(lèi)是檢查一般有機(jī)化合物的通用顯色劑；另一類(lèi)是根據(jù)化合物分類(lèi)或特殊官能團(tuán)設(shè)計(jì)的專(zhuān)屬性顯色劑。 常用通用顯色劑：硫酸常用的有四種溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)

16、溶液；1.5molL硫酸溶液與0.5-1.5molL硫酸銨溶液，噴后110oC烤15min，不同有機(jī)化合物顯不同顏色。 常用通用顯色劑： 0.5碘的氯仿溶液 對(duì)很多化合物顯黃棕色。 中性0.05高錳酸鉀溶液 易還原性化合物在淡紅背景上顯黃色。常用通用顯色劑：堿性高錳酸鉀試劑 還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色。溶液I：1高錳酸鉀溶液；溶液：5碳酸鈉溶液；溶液I和溶液等量混合應(yīng)用。 常用通用顯色劑：酸性高錳酸鉀試劑 噴1.6高錳酸鉀濃硫酸溶液(溶解時(shí)注意防止爆炸)，噴后薄層于180oC加熱1520min。 常用通用顯色劑：酸性重鉻酸鉀試劑 噴5重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時(shí)150oC烤薄層。 5磷鉬酸

17、乙醇溶液 噴后120oC烘烤，還原性化合物顯藍(lán)色，再用氨氣薰，則背景變?yōu)闊o(wú)色。鐵氰化鉀-三氯化鐵試劑 還原性物質(zhì)顯藍(lán)色，再噴2molL鹽酸溶液，則藍(lán)色加深。溶液I：1鐵氰化鉀溶液；溶液：2三氯化鐵溶液；臨用前將溶液I和溶液等量混合。 專(zhuān)屬性顯色劑專(zhuān)屬性顯色劑由于化合物種類(lèi)繁多，因此專(zhuān)屬性顯色劑也是很多的，現(xiàn)將在各類(lèi)化合物中最常用的顯色劑列舉如下： 烴類(lèi)烴類(lèi) 硝酸銀過(guò)氧化氫 檢出物：鹵代烴類(lèi)。 溶液：硝酸銀O.1g溶于水lml，加2-苯氧基乙醇lOOml，用丙酮稀釋至200ml，再加30過(guò)氧化氫1滴。 方法：噴后置未過(guò)濾的紫外光下照射； 結(jié)果：斑點(diǎn)呈暗黑色。 熒光素溴 檢出物：不飽和烴。 溶液：

18、I熒光素0.1g溶于乙醇lOOml；5溴的四氯化碳溶液。方法：先噴(I)，然后置含溴蒸氣容器內(nèi)，熒光素轉(zhuǎn)變?yōu)樗匿鍩晒馑?曙紅)，熒光消失，不飽和烴斑點(diǎn)由于溴的加成，阻止生成曙紅而保留熒光，多數(shù)不飽和烴在粉紅色背景上呈黃色。 四氯鄰苯二甲酸酐檢出物：芳香烴。 溶液：2四氯鄰苯二甲酸酐的丙酮與氯代苯(10：1)的溶液。方法：噴后置紫外光下觀察。甲醛硫酸 檢出物：多環(huán)芳烴。溶液：37甲醛溶液O.2ml溶于濃硫酸l0ml。 (2)醇類(lèi)醇類(lèi) 3，5一二硝基苯酰氯 檢出物：醇類(lèi)。 溶液：I2本品甲苯溶液；0.5氫氧化鈉溶液；O.002羅丹明溶液。方法：先噴(I)，在空氣中干燥過(guò)夜，用蒸氣薰2min，將紙或

19、薄層通過(guò)試液()30s，噴水洗，趁濕通過(guò)()15s，空氣干燥，紫外燈下觀察。 硝酸鈰銨 檢出物：醇類(lèi)。 溶液：I1硝酸鈰銨的0.2molL硝酸溶液；N,N-二甲基-對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.5g溶于甲醇、水與乙酸(128m1+25m1+15m1)混合液中，用前將(I)與()等量混合。噴板后于105oC加熱5min。 香草醛硫酸 檢出物：高級(jí)醇、酚、甾類(lèi)及精油。 溶液：香草醛1g溶于硫酸lOOml。 方法：噴后于120oC加熱至呈色最深。二苯基苦基偕肼 檢出物：醇類(lèi)、萜烯、羰基、酯與醚類(lèi)。 溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。 方法：噴后于110oC加熱5lOmin。 結(jié)果：紫色背景呈黃色斑點(diǎn)。 (3

20、)醛酮類(lèi)醛酮類(lèi)品紅亞硫酸 檢出物：醛基化合物。 溶液：I0.01%品紅溶液，通入二氧化硫直至無(wú)色；0.05molL氯化汞溶液；O.05molL硫酸溶液。方法：將I、以1：1：10混合，用水稀釋至l00ml。 鄰聯(lián)茴香胺 檢出物：醛類(lèi)、酮類(lèi)。 溶液：本品乙酸飽和溶液。 2，4-二硝基苯肼 檢出物：醛基、酮基及酮糖。溶液：I0.4本品的2molL鹽酸溶液； 本品O.1g溶于乙醇l00ml中，加濃鹽酸lml。 方法：噴溶液I或后，立即噴鐵氰化鉀的2molL鹽酸溶液。 結(jié)果：飽和酮立即呈藍(lán)色；飽和醛反應(yīng)慢，呈橄欖綠色；不飽和羰基化合物不顯色。 (4)含氮化合物含氮化合物 FCNP(硝普鈉鐵氰化物)試劑 檢出物：脂 肪族含氮化物，如氨基氰、胍、脲與硫脲及其衍生物，肌酸及肌酐。溶液：10氫氧化鈉溶液、10硝普鈉溶液、10鐵氰化鉀