Ch6 生物酶工程

1、Ch6 生物酶工程生物酶工程（Biological Enzyme Engineering）： 是指在基因水平上，對(duì)酶蛋白分子進(jìn)行修飾、改造，改進(jìn)酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白質(zhì)特性等。本章主要介紹 核酶、進(jìn)化酶、雜合酶和抗體酶的有關(guān)基本概念和基本知識(shí)。1Ch6-1 核酶(Ribozyme)到目前為止，除了我們傳統(tǒng)概念的酶蛋白質(zhì)外，還發(fā)現(xiàn)另一類具有催化活性的物質(zhì)核酸。這里的核酶要和核酸酶（Nuclease）的概念區(qū)別開來，前者是酶的化學(xué)本質(zhì)是核酸；后者是指催化核酸水解的酶，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)；1981年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲的核糖體前體RNA可以在沒有酶蛋白存在的情況下，自身催化切除內(nèi)涵子，完成加

2、工過程；發(fā)現(xiàn)了具有催化活性的RNA，從而提出了核酶這個(gè)概念。由于核酶具有很多與酶蛋白截然不同的特點(diǎn)，尤其在醫(yī)學(xué)界的優(yōu)勢更為突出，用于基因治療可以克服一直困擾人們的免疫問題。所以近些年來引起了酶工程研究領(lǐng)域的極大熱情。 到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然核酶的作用底物都是核酸，按其催化反應(yīng)可分兩類：剪切型核酶：這類核酶主要催化自身或異體RNA的切割，相當(dāng)于核酸內(nèi)切酶的作用。目前發(fā)現(xiàn)的剪切型核酶包括三種： 錘頭型核酶 R. Symons研究一些植物病毒RNA的自身剪切功能后，提出了錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)模型； 發(fā)卡型核酶 發(fā)卡型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)象一個(gè)發(fā)卡裝，由50個(gè)堿基組成，它和底物的14個(gè)堿基共同構(gòu)成一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)

3、，識(shí)別順序是NGUC，在N-G之間切割。 蛋白質(zhì)RNA 復(fù)合酶 由蛋白質(zhì)和M1RNA兩個(gè)部分構(gòu)成，其中蛋白質(zhì)的分子量2000Da，RNA部分函377個(gè)堿基。催化活性完全有RNA部分完成，蛋白質(zhì)部分只是維護(hù)RNA的構(gòu)象，主要功能是剪切修飾tRNA。剪接型核酶：這類核酶主要催化mRNA前體的修飾加工，切除內(nèi)含子，并完成片段的拼接； 主要包括組內(nèi)含子和組內(nèi)含子。Cech 研究發(fā)現(xiàn)四膜蟲的核糖體RNA前體，具有自身切除413 堿基的intron，并進(jìn)行片段的拼接功能，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其Intron 本身具有催化RNA前體剪輯功能。脫氧核酶： 前述核酶的化學(xué)本質(zhì)是RNA，在發(fā)現(xiàn)RNA核酶后，很快就發(fā)現(xiàn)了

4、切割RNA和DNA的DNA核酶。1994年，Breaker 利用體外選擇技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)了切割RNA的DNA分子，命名為脫氧核酶（DNAzyme）關(guān)于核酶的應(yīng)用前景關(guān)于核酶的研究，主要目標(biāo)是將其應(yīng)用于基因治療，總體上講，目前處于研究階段。開發(fā)公司治療對(duì)象研究階段American CyanamidColumbia UniversityGene ShearsInnovirOsaka UniversityRibozyme Ph. Inc.Tokyo UniversityB細(xì)胞白血病-淋巴瘤人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒乙肝病毒，丙肝病毒乙肝病毒，丙肝病毒丙肝病毒人免疫缺陷病毒血管生長因子丙肝病毒臨床前期

5、臨床前期一、二期臨床臨床前期臨床前期臨床前期一、二期臨床臨床前期臨床前期關(guān)于核酶用于基因治療研究存在的主要問題 體內(nèi)運(yùn)輸與細(xì)胞吸收及殘留問題： 切割位點(diǎn)的特異性選擇問題： 自身穩(wěn)定性問題： 毒性和免疫原性問題：2Ch6-2 酶分子的定向進(jìn)化（Directed Evilution）酶分子的定向進(jìn)化是指在分子水平上，人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），對(duì)酶基因進(jìn)行改造，并進(jìn)行定向選擇，篩選出所需性質(zhì)的酶蛋白。對(duì)酶蛋白分子的改造，主要包括兩個(gè)方面，即酶分子改造的合理化設(shè)計(jì)（Rational Design）和非合理設(shè)計(jì)（Irrational Design）合理化

6、設(shè)計(jì)：主要指事先已經(jīng)搞清楚了酶蛋白的結(jié)構(gòu)，有明確的修飾目標(biāo)，定點(diǎn)改造某一結(jié)構(gòu)活某氨基酸而設(shè)計(jì)的改造修飾方案，如酶蛋白的化學(xué)修飾、酶蛋白基因的定點(diǎn)突變等；非合理設(shè)計(jì)： 事先不必確定基因的改造修飾目標(biāo)，設(shè)計(jì)酶蛋白基因改造技術(shù)和方法，設(shè)計(jì)基因改造方案，然后按照預(yù)定目標(biāo)要求，進(jìn)行篩選。酶分子的定向進(jìn)化就屬于非合理設(shè)計(jì)。 1. 酶分子定向進(jìn)化方法： 目前已經(jīng)研究成功的酶蛋白分子定向進(jìn)化方法只要包括一下幾個(gè)方面： 易錯(cuò)PCR方法； DNA改組方法； 基因家族之間的同源重組方法； 易錯(cuò)PCR法：易錯(cuò)PCR是在利用PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)在Taq聚合酶的催化下，對(duì)目的基

7、因進(jìn)行擴(kuò)增，通過調(diào)整反應(yīng)條件（提高M(jìn)g 2濃度、加入Mn 2 改變反應(yīng)體系中四種dNTP的比例濃度等） ，改變Taq酶催化的目的基因擴(kuò)增中的突變頻率，以一定的頻率隨機(jī)構(gòu)件了基因突變庫，然后選擇或篩選符合需要的突變體。易錯(cuò)PCR的關(guān)鍵在于一下兩點(diǎn)控制： 每個(gè)目的基因的突變堿基數(shù)要嚴(yán)格控制：突變率不應(yīng)太高，太高時(shí)酶的基因突變太大，酶固有活力不易保持，太低不易實(shí)現(xiàn)酶分子的有效進(jìn)化，一般理論上講每個(gè)靶基因?qū)氲耐蛔儔A基數(shù)控制在1.55個(gè)； 一般一次突變很難獲得有用突變，所以在設(shè)計(jì)易錯(cuò)PCR時(shí)，是設(shè)計(jì)連續(xù)易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增，連續(xù)進(jìn)行隨機(jī)突變，從而獲得符合進(jìn)化目的的突變體。易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化的應(yīng)用實(shí)例：利用

8、易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化L天冬氨酸酶實(shí)例設(shè)計(jì)工作程序：易錯(cuò)PCR篩選突變體（優(yōu)勢突變重組篩選）；研究結(jié)果： 獲得了一株酶活力提高28倍的突變體；并且進(jìn)化酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于原始酶。進(jìn)一步測序研究表明進(jìn)化后的突變體共發(fā)生了7個(gè)堿基突變，其中3個(gè)突變位點(diǎn)引起了氨基酸的改變Asn217Lys； Thr233 Arg； Val367 Gly3Ch6-2 酶分子的定向進(jìn)化（Directed Evilution）DNA改組技術(shù)DNA改組技術(shù)是在易錯(cuò)PCR方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，設(shè)想經(jīng)過易錯(cuò)PCR獲得的兩個(gè)或兩個(gè)以上的正突變的突變體，如果將這些正突變的突變部位整合到一個(gè)突變體上，會(huì)獲得更為突出的定向進(jìn)

9、化效果。具體方法是將多個(gè)正突變的突變體混合，然后用脫氧核糖核酸酶進(jìn)行隨機(jī)切割，得到隨機(jī)DNA片段，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時(shí)隨機(jī)DNA片段互為模版（Template）或引物（Primer），直到獲得全長基因片段后，進(jìn)行分離和篩選，以獲得高效突變體?；蚣易逯g的同源重組本定向進(jìn)化方法是利用自然界中天然存在的基因家族出發(fā)，利用它們之間的同源順序進(jìn)行重組，這種方法獲得高效突變的幾率較大，并且盲目性小，容易獲得理想的進(jìn)化效果。研究報(bào)道實(shí)例：Stemmer等利用來自4種微生物編碼頭孢菌素酶的基因進(jìn)行同源重組進(jìn)化研究，獲得了進(jìn)化重組體的產(chǎn)酶活性提高了270倍。2.酶分子定向進(jìn)化的酶工程意義酶分子定向進(jìn)化研

10、究實(shí)踐表明， 在改造、修飾酶蛋白分子方面主要體現(xiàn)以下幾點(diǎn)： 提高酶分子的催化活力 提高酶的催化活力始終是酶工程研究的最實(shí)際、最有價(jià)值的研究熱點(diǎn)之一。關(guān)于定向進(jìn)化提高酶催化活力的實(shí)例前已列舉，這里提高酶催化活力和提高產(chǎn)酶菌株的產(chǎn)酶活力的概念要加以區(qū)別，酶分子的定向進(jìn)化是通過對(duì)酶蛋白分子進(jìn)行改造來實(shí)現(xiàn)的酶活力提高；但傳統(tǒng)的在酶工程研究領(lǐng)域，對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行誘變育種、培育，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶活力的提高，后者不排除有導(dǎo)致酶蛋白分子發(fā)生改變的可能，但更重要的是通過點(diǎn)突變，改變細(xì)胞的代謝調(diào)控機(jī)制而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶活力的提高。 改善酶蛋白的穩(wěn)定性：提高酶蛋白的穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定性提高，是酶工程研究的另一研究熱點(diǎn)。因?yàn)樵陉P(guān)于生

11、產(chǎn)中，提高反應(yīng)溫度，可以提高底物的溶解度、降低反應(yīng)介質(zhì)的黏度，提高酶的催化活力，特別是防止在生產(chǎn)過程中的微生物污染。Zhao H 等在對(duì)枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行定向進(jìn)化研究中，取得了很大成功，他們利用易錯(cuò)PCR 和突變體的DNA 改組方法，并進(jìn)行提高溫度的篩選條件進(jìn)行重組體的篩選，使枯草桿菌蛋白酶的最適催化溫度提高了17（65） 在最適溫度下的半衰期增加了200倍。 改善酶蛋白的底物專一性 根據(jù)酶蛋白在生產(chǎn)中的應(yīng)用特點(diǎn)，可以有目標(biāo)地通過分子定向進(jìn)化，提高或降低底物專一性。通過定向進(jìn)化，降低Km值的實(shí)例很多，通過對(duì)進(jìn)化酶蛋白的動(dòng)力學(xué)研究，證明很多通過催化效率的進(jìn)化酶的Km值大大降低。 通過酶蛋白分子對(duì)

12、應(yīng)用環(huán)境的適應(yīng)能力 許多酶蛋白催化適應(yīng)環(huán)境是在長期生物體內(nèi)的催化環(huán)境進(jìn)化形成的，而在使用中，很難模擬體內(nèi)的催化環(huán)境，通過定向進(jìn)化，可以提高酶蛋白對(duì)催化環(huán)境的適應(yīng)能力。如：在洗滌劑生產(chǎn)中，添加枯草桿菌蛋白酶，以增加洗滌劑去污能力，添加去脂肪酶增加去油漬的能力，而這些酶需要有特定的金屬離子作為配基時(shí)，才能發(fā)揮良好的催化活性，而在洗滌過程中，往往在洗滌劑中都加有去離子熬合劑，對(duì)酶蛋白不利，利用定向進(jìn)化改造酶蛋白的適應(yīng)環(huán)境極為必要。Bryant報(bào)道利用定向進(jìn)化方法，對(duì)枯草桿菌蛋白酶改造，去除了結(jié)合Ca的環(huán)突結(jié)構(gòu)，獲得了一株產(chǎn)不依賴Ca蛋白酶的枯草桿菌菌株。4Ch6-3 酶基因的定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變是對(duì)已知

13、序列的基因(或DNA)中任意指定位置進(jìn)行突變的技術(shù)，它又可以分為寡核苷酸誘導(dǎo)和寡核苷酸置換兩大類。分別適用于不同類型的預(yù)先確定突變氨基酸位置的突變實(shí)驗(yàn)。5Ch6-3 酶基因的定點(diǎn)突變1.寡聚核苷酸誘導(dǎo)的定點(diǎn)突變這項(xiàng)技術(shù)主要是利用帶有預(yù)定突變序列的寡核苷酸單鏈引物，在體外與原基因序列退火，誘導(dǎo)合成少量完整的突變基因，然后，通過體內(nèi)增殖得到大量的突變基因。這類技術(shù)的最早應(yīng)用是Hutehison和Razill等人，分別用合成的寡核苷酸引物誘導(dǎo)了X174單鏈?zhǔn)删wDNA嘌吟點(diǎn)突變。后來，逐漸改用M13單鏈?zhǔn)删wDNA作為基因載體，突變技術(shù)也日趨成熟。 定點(diǎn)突變的基本操作程序： (1)將酶基因(包括結(jié)構(gòu)

14、基因和起動(dòng)基因)克隆到M13(一種單鏈DNA噬菌體)上(或質(zhì)粒上)，由此得到模板(以下稱“正鏈”)。 (2)化學(xué)合成含有所需突變順序的寡核苷酸引物，這段“突變引物”的核苷酸順序，除預(yù)定突變的部位外，其余的順序與“正鏈”互補(bǔ)。 (3)合成含突變順序的雙鏈M13 DNA，即是將合成的突變引物5端磷酸化后，與“正鏈”DNA退火，這時(shí)突變引物與“正鏈”的欲突變部位，形成含錯(cuò)誤配對(duì)的雙鏈，然后加入DNA聚合酶(常用大腸桿菌DNA聚合酶I)和四種dNTP，將引物延伸，合成全部互補(bǔ)的雙鏈、并由T4噬菌體DNA連接酶封口，得到共價(jià)閉環(huán)雙鏈DNA(cccDNA)。并用超離心或凝膠過濾等技術(shù)分離純化雙鏈DNA。

15、(4) 將雙鏈DNA轉(zhuǎn)染受體菌(例如大腸桿菌F株)使其擴(kuò)增。從所得到的噬菌斑分離單鏈DNA。經(jīng)印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，把上述突變引物標(biāo)記532P作為探針，進(jìn)行雜交(退火)，此時(shí)突變型單鏈DNA與探針全部互補(bǔ)，而野生型(未突變者)與探針之間，存在錯(cuò)誤配對(duì)，在高溫洗滌時(shí)，這種互補(bǔ)鏈，易解鏈，探針被洗掉，因而留下來的互補(bǔ)鏈，可能是突變酶基因的鏈。 (5)由篩選到的含突變酶基因的受體菌株，進(jìn)一步純化，分離DNA，測定突變部位的順序，與預(yù)定序列相符者，即為所要求的突變酶基因。 (6)將含有突變酶基因的M13，轉(zhuǎn)化高效表達(dá)體菌、溶菌后即可收得大量的突變酶。這個(gè)方法有許多重要的優(yōu)點(diǎn): 它可以精確地在基因

16、的預(yù)定位置導(dǎo)入任何所需的突變，并有有效的篩選手段取得突變基因； 它對(duì)目的基因本身的結(jié)構(gòu)沒有任何附加要求(如要求它在某處具有某種限制位點(diǎn)之類)，可以直接地用于各種需要突變的基因； 這個(gè)方法步驟比較簡單、技術(shù)比較成熟，因此，目前在蛋白質(zhì)工程研究中得到了廣泛的應(yīng)用。這個(gè)方法也有一些缺點(diǎn)，最突出的一個(gè)缺點(diǎn)是突變基因產(chǎn)率較低，噬菌體后代帶有所需突變的比率常常遠(yuǎn)低于理論值(50)。在某些場合，尤其當(dāng)需要進(jìn)行較多突變工作時(shí)，突變率低是很不利的，近年來，針對(duì)這一缺點(diǎn)，提出了許多改進(jìn)方案。6Ch6-3 酶基因的定點(diǎn)突變2.寡聚核苷酸置換的定點(diǎn)突變 寡核苷酸誘導(dǎo)的定點(diǎn)突變法，只適用于將蛋白質(zhì)中的某一氨基酸，轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

17、預(yù)定的另一種氨基酸。但如果事先不能確定轉(zhuǎn)變產(chǎn)物，需將每一種可能代替的氨基酸逐一實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，就要同時(shí)進(jìn)行某一位點(diǎn)的多種突變。適合這類要求的突變方法，就是寡核苷酸置換的定點(diǎn)突變法。 這類方法的特點(diǎn)是，用帶有各種所需突變序列的寡核苷酸，在體外直接置換目的基因中欲變部位而實(shí)現(xiàn)突變。因?yàn)槭侵苯又脫Q，所以不需要進(jìn)行退火和誘導(dǎo)合成。然而置換過程需要限制性酶切和連接酶連接，所以必須在雙鏈DNA之間進(jìn)行。寡核苷酸是雙鏈，目的基因及其載體(質(zhì)粒或 Phage M13)也是雙鏈。盒式突變(Cassette mutagenesis) 本方法是這類技術(shù)的代表。所謂盒(Cassette)就是指與目的基因欲變部位相應(yīng)的化學(xué)

18、合成的一系列雙鏈寡核苷酸，它們帶有各種能選用的突變序列。當(dāng)進(jìn)行突變處理時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要把各種突變“盒”插入目的基因中，猶如把盒式錄音帶插入錄音機(jī)一樣，非常靈活方便，用此技術(shù)可使蛋白質(zhì)中某種氨基酸殘基一次分別為多種氨基酸取代。實(shí)例： 枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)的活性中心涉及Ser-221殘基，與其鄰近的是Met-222。由于Met-222的存在，使該酶易被氧化失活。因?yàn)槭孪葻o法確定哪種氨基酸取代Met-222后會(huì)既改善對(duì)氧化的穩(wěn)定性，又不致劇烈降低酶的活力，故采用這種盒式突變技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行修飾。完整的枯草桿菌蛋白酶的基因在質(zhì)粒PS4.5的一個(gè)1.5Kb的EcoR I-BamHI消化片

19、段中。 將此片段連接到噬菌體M13mp9上，構(gòu)成一個(gè)單鏈重組噬菌體DNA(M13mp9 SUBT)。 合成一個(gè)38體寡聚脫氧核苷酸引物，該引物缺失包括Met-222在內(nèi)的10個(gè)核苷酸，并在其兩側(cè)分別創(chuàng)造了限制酶Kpn I和Pst I的新切點(diǎn)。 以此核苷酸為引物，以M13mp9SUBT為模板，在DNA聚合酶I(Klenow)和T4 DNA連接酶催化下體外復(fù)制成新的突變DNA分子。 用EcoRI-BamH I 消化后獲得的DNA片段，再克隆到穿梭質(zhì)粒pBS42上，獲得質(zhì)粒p222。 用限制酶Kpn I和Pst I消化這個(gè)質(zhì)粒，形成切口，將5種雙鏈25體寡核苷酸混合物(庫)在連接酶催化下插入切口，形成五種不同的重組質(zhì)粒。 用此混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。分離單菌落的質(zhì)粒DNA，測定DNA序