總RNA的提取-電泳鑒定及RT-PCR

1、實驗二、實驗二、 RNA提取及提取及RT-PCR1、小鼠肝臟組織總、小鼠肝臟組織總RNA的提取的提取2、RNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳3、以、以RNA為模板進行為模板進行RT-PCR4、 PCR產物的電泳及回收產物的電泳及回收實驗一實驗一. . 提取小鼠肝臟組織的提取小鼠肝臟組織的RNARNA 1、mRNA: 1-5% 5鳥嘌呤鳥嘌呤7位甲基化位甲基化CH3修飾。修飾。 1）免受核酸酶破壞，）免受核酸酶破壞， 2）起始、促進蛋白質合成。）起始、促進蛋白質合成。 3poly(A)尾巴結構尾巴結構 20-200個個A. 翻譯所必需。翻譯所必需。 起始密碼：起始密碼：AUG 終止密碼：終止密

2、碼：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亞基小亞基40S: 18S=1874nt RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實驗器材表面。酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實驗器材表面。 生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。 1、 盡量避免外源性盡量避免外源性RNase 污染污染 A. 操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。 B. 用新開封的化學試劑。（試劑應該專用）用新開封的化學試劑。（試劑應該專用） C.

3、 一次性塑料器材最好是新開封，一次性塑料器材最好是新開封， (DEPC水處理后）高壓滅菌。水處理后）高壓滅菌。 D. 玻璃器材、水都應該經過去玻璃器材、水都應該經過去RNase 處理。處理。 對玻璃器材還應該進行高溫烘烤。對玻璃器材還應該進行高溫烘烤。 2、抑制內源性、抑制內源性RNase 活性：活性： RNase 抑制劑抑制劑。 1)1)發(fā)放口罩，帽子，每個組來一個人領取。發(fā)放口罩，帽子，每個組來一個人領取。 將將1 mL Trizol 1 mL Trizol 試劑移入試劑移入EppendorfEppendorf管中。管中。2)2)實驗教師操作實驗教師操作: : 取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊取

4、新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過大不宜過大, , 放在玻片上立即研磨放在玻片上立即研磨, ,研磨要徹底研磨要徹底。 3)3)將研磨后的組織將研磨后的組織( (小米粒大小小米粒大小) )轉移至轉移至1 mL Trizol 1 mL Trizol 試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合2 min2 min以上。以上。使組織細胞充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾使組織細胞充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀。濁狀。 4)4)室溫孵育室溫孵育10 min10 min。播放有聲課件播放有聲課件1: RNA提取方法及注意事項提取方法及注意事項1 1、異硫氰酸胍法：、異硫氰酸胍法： G

5、uSCN GuSCN 是一種強的蛋白質變性劑，能夠裂解是一種強的蛋白質變性劑，能夠裂解細胞的同時，還能有效地抑制內源性細胞的同時，還能有效地抑制內源性 RnaseRnase的活性，的活性，通過有機溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總通過有機溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總RNARNA。 特點：需低溫操作，但價格經濟。特點：需低溫操作，但價格經濟。3 3、mRNAmRNA提取試劑盒提取試劑盒 真核細胞真核細胞mRNAmRNA的的3 3末端有末端有ploy(A)ploy(A)尾，利用寡聚尾，利用寡聚 dTdT纖維素結合纖維素結合mRNAmRNA，將其從細胞總，將其從細胞總RNARNA中分離

6、出來。中分離出來。RNA提取的幾種方法提取的幾種方法室溫孵育室溫孵育10 min介紹介紹RNase抑制劑抑制劑1、DEPC ( 二乙基焦炭酸鹽二乙基焦炭酸鹽) 最常用的最常用的RNase抑制劑抑制劑: 與蛋白質中的組氨酸結合，與蛋白質中的組氨酸結合， 使蛋白質變性。使蛋白質變性。 有效濃度：有效濃度：0.05%-0.1%(DEPC水水)，室溫磁力攪拌，室溫磁力攪拌20分鐘。分鐘。用于浸泡各種器材。用于浸泡各種器材。滅活條件：高壓。滅活條件：高壓。 在在Tris溶液中半衰期為溶液中半衰期為1.25min。 試劑的配制試劑的配制:無無RNase的溶液的溶液(用用DEPC水配制水配制, 高壓高壓)

7、儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。，或液氮中。2、肝素：、肝素： 使用濃度：使用濃度：0.110mg/ml 效效 果果: 37 C 時，可抑制時，可抑制95%的的RNase 活力?；盍?。 如果與如果與DEPC聯合應用，聯合應用， 具有極強的抑制效果。具有極強的抑制效果。5)加入加入200 l氯仿，震蕩混勻氯仿，震蕩混勻20-30 s，室溫放置室溫放置5 min （此期間液體開始分層，不（此期間液體開始分層，不要輕易攪動液體）。要輕易攪動液體）。6)10000 rpm， 離心離心 5 minRNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein7)將清澈透

8、明的將清澈透明的上層水相上層水相 轉移至另一離心管中。轉移至另一離心管中。有聲課件有聲課件2: RNA干燥及溶解技巧干燥及溶解技巧8) 沉淀沉淀RNA： 加加0.5 ml異丙醇異丙醇，上下顛倒混勻，室溫，上下顛倒混勻，室溫10 min。 10, 000 rpm，4 C，離心，離心10 min棄上清。棄上清。) 加加1ml 75%乙醇乙醇洗滌管壁。洗滌管壁。 (注意貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉注意貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉淀淀)10) 7500rpm，4 C 離心離心 1 min，棄上清，棄上清 再離心幾秒鐘，再離心幾秒鐘， 將管壁液體（用加樣器）完全移凈。將管壁液體（用加

9、樣器）完全移凈。用用TriZol試劑提取總試劑提取總RNA時，全程均在室溫進行。時，全程均在室溫進行。當當RNA沉淀用水溶解后，應該注意在冰上操作，操作要迅速。沉淀用水溶解后，應該注意在冰上操作，操作要迅速。11)11)室溫室溫干燥干燥3 35 min5 min （根據（根據RNARNA沉淀大小決定，干燥后的沉淀應該是無沉淀大小決定，干燥后的沉淀應該是無色膠樣透明狀，避免過分干燥色膠樣透明狀，避免過分干燥, ,此此步驟非常關鍵步驟非常關鍵。）。）注意事項注意事項：RNA:避免放在避免放在37 C孵箱中過度干燥以防無孵箱中過度干燥以防無法溶解。法溶解。RNA沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，沉淀必

10、須絕對干燥，微量乙醇殘留，容易造成容易造成RT的失敗，但過分干燥又是造成的失敗，但過分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因 。判斷判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉錄成功的關鍵環(huán)節(jié)。分干燥是逆轉錄成功的關鍵環(huán)節(jié)。RNA pellet：透明膠樣：透明膠樣干燥后應該無色透明干燥后應該無色透明1212） RNARNA的溶解：用加樣器吸取冰冷的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-HDEPC-H2 2O 13.5 O 13.5 l l，加到，加到RNARNA上，進行吹打溶解上，進行吹打溶解RNA RNA 沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA應置冰上保存應

11、置冰上保存。13) 13) 吸出吸出 4.5 4.5 l l溶液放到冰上備用溶液放到冰上備用( (將用于電泳將用于電泳).).14) 14) 剩余剩余 9 9 l l溶液溶液, ,放到冰上備用（將用于放到冰上備用（將用于RTRTPCRPCR）. .v注意：注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心沉淀的溶解一定要耐心充分，充分，一定一定要用加樣器要用加樣器反復反復多次吹打方多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出可。但由于溶液體積非常小，要避免出現氣泡影響現氣泡影響RNA的溶解。的溶解。避免氣泡的方法：避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體每次吹打都不要打出氣體判斷

12、溶解程度：判斷溶解程度：吹打時液體流動不拐彎吹打時液體流動不拐彎為止。為止。實驗二實驗二. RNA 的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳 基本過程同基本過程同DNA電泳一樣，但應明確一點的是，電泳一樣，但應明確一點的是，因為因為RNA分子對分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必酶的作用非常敏感，因此必須用對須用對RNA酶有抑制作用酶有抑制作用DEPC水水來配置所有溶來配置所有溶液，所有與液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少以盡量減少RNA酶對樣品的降解酶對樣品的降解RNA 的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳 RNA樣品：樣品： 4.5 l 上樣緩沖液：上樣

13、緩沖液： 1 l 混勻后，混勻后， 5.5 l 直接電泳上樣（直接電泳上樣（100伏，伏，1030分鐘）分鐘） 上樣前預電泳上樣前預電泳5min。 注意注意: 電泳槽的清潔！電泳槽的清潔！所有試劑、器材、溶液需要滅所有試劑、器材、溶液需要滅RNA酶處理。酶處理。 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！瓊脂糖凝膠要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結果紫外透射儀觀察電泳結果RNA的電泳上樣的電泳上樣： RNA電泳結果電泳結果 rRNA rRNA可以作為內部可以作為內部MarkerMarker分子，通過觀察分子，通過觀察rRNArRNA的兩條帶的兩條帶（28S28S和和18S18S）的比）的比例例，可以判斷所提取，可

14、以判斷所提取mRNAmRNA是是否存在降解。否存在降解。 RNARNA電泳并不能判斷電泳并不能判斷mRNAmRNA是否提取成功，也不作為鑒是否提取成功，也不作為鑒定定RNARNA提取質量的常規(guī)方法，提取質量的常規(guī)方法，因為因為在電泳過程中在電泳過程中RNARNA可能發(fā)可能發(fā)生降解生降解。 分析本次實驗結果：分析本次實驗結果：28S、 18S和和5S的比例。的比例。RNA電泳結果分析電泳結果分析實驗三：逆轉錄反應及實驗三：逆轉錄反應及PCR（RT-PCR)逆轉錄酶：逆轉錄酶： 存在于逆轉錄病毒體內。存在于逆轉錄病毒體內。 常見有哺乳動物型常見有哺乳動物型37oC，禽類，禽類型型42oC 。 以以

15、mRNA為模板的為模板的DNA聚聚合酶，形成與合酶，形成與RNA堿基相互補堿基相互補DNA鏈，后者稱為互補鏈，后者稱為互補DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉的活性：切掉DNA和和RNA雜合鏈上的雜合鏈上的RNA。逆轉錄反應原理逆轉錄反應原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h 逆轉錄逆轉錄有聲課件有聲課件3: RT 的原理和注意事項的原理和注意事項 總總RNA 9 l Oligo dT (0.05

16、 g/ml) 1 l (終：終：2.5 ng/ml) 輕彈管底混合，輕彈管底混合， 置置65水浴水浴10min， 立即冰浴立即冰浴2min（防止（防止RNA形成二級結構）。形成二級結構）。第一步：打開第一步：打開RNA鏈之間的二級結構，鏈之間的二級結構，使使Oligo dT 特異性地結合到特異性地結合到 PolyA 尾。尾。 5 RT-buffer 4 l RNasin (RNA酶抑制劑，酶抑制劑，40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV （逆轉錄酶）（逆轉錄酶） 1 l 輕彈管底混合。置輕彈管底混合。置42 oC 水浴水浴1h。第二步：向上述反應溶液中依次加入

17、下列試劑第二步：向上述反應溶液中依次加入下列試劑第三步：第三步：將上述反應移至將上述反應移至68 oC水浴水浴10min以滅活以滅活 RTase，并冰浴，保存?zhèn)溆?，并冰浴，保存?zhèn)溆梦缥?休休 PCR反應體系的建立反應體系的建立 PCR 反應的進行反應的進行 PCR產物的電泳產物的電泳 結果觀察與分析結果觀察與分析 PCR產物回收產物回收實驗操作內容實驗操作內容 有聲課件有聲課件（1）：）： PCR的基本原理的基本原理及反應體系的組成及反應體系的組成PCR反應動畫反應動畫（2）：PCR 反應條件的反應條件的確定及確定及PCR常見問題的解常見問題的解決方案決方案1）模板）模板DNA (上次課逆轉錄

18、的上次課逆轉錄的cDNA） 4 l2）加入下列試劑）加入下列試劑,，順序可以改變，順序可以改變 10X PCR buffer (含含MgCl2 ) 5 l dNTPs (10mM) 1 l 3 引物引物 (10 mol/L) 1 l 5 引物引物 (10 mol/L) 1 l 3）加）加去離子水去離子水 ，補足，補足50 l最終反應體系最終反應體系4）Taq DNA 聚合酶聚合酶(2U/ l) 1 l實驗操作一、建立實驗操作一、建立 PCR PCR 反應體系反應體系3. 輕彈管底混勻，然后放入離心機的套管內，用離心機甩一下；輕彈管底混勻，然后放入離心機的套管內，用離心機甩一下；4. 將將PCR

19、小管交給老師，老師統(tǒng)一將樣品放入小管交給老師，老師統(tǒng)一將樣品放入PCR儀。儀。取取 1 支支200 l 微量離心管（在第一組同學的實驗臺上方的平皿里）中，微量離心管（在第一組同學的實驗臺上方的平皿里）中，用用 Marker 筆筆 在管的在管的側面?zhèn)让?標記；標記；2. 依次加入下列試劑：依次加入下列試劑：注意：注意：（1） （2）加樣的體積要）加樣的體積要準確準確，1 l 的體積不的體積不應該應該超過白色槍頭的第一個格。超過白色槍頭的第一個格。 實驗操作二、實驗操作二、 PCR PCR 反應的進行反應的進行1 1、將樣品放入、將樣品放入 PCR PCR 儀中儀中2. PCR2. PCR反應條件

20、反應條件 94 30 S DNA變性變性 (Denaturation) 55 30 S 退火退火 (Annealing) 72 45 S 延伸延伸 (Extension) 上述溫度變化進行上述溫度變化進行 30 個循環(huán)個循環(huán) (cycles) 。 72 10 min (Further extension)。 3. 3. 將同學們分成三組，分別觀察將同學們分成三組，分別觀察PCRPCR的溫度循環(huán)。的溫度循環(huán)。 其它同學課間休息。其它同學課間休息。播放：有聲課件播放：有聲課件 （PCRPCR講解講解1 1）播放：有聲課件播放：有聲課件 （PCRPCR講解講解2 2）播放：播放：PCR PCR 動畫動畫實驗操作實驗操作 三、三、 PCRPCR產物的電泳產物的電泳1. 1. 教師指導學生將瓊脂糖凝膠（教師指導學生將瓊脂糖凝膠（1%1%）放入膠床上。）放入膠床上。2. 2. 樣品制備：樣品制備： 在在50 l PCRPCR產物中，加入產物中，加入 6 ul 上樣液上樣液，混勻。，混勻。 （上樣液上樣液：10Loading buffer 或 6Loading buffer） 3. 3. 上樣：上樣： 將上述樣品加入凝膠加樣孔中。將上述樣品加入凝膠加樣孔中。 注意：注意：DNA Marker。4. 4. 電泳：電泳：100 100 伏，伏，3030分鐘。分鐘。操作四、操作四、PCRPCR產物的