基因工程4PPT教案

1、會計學1基因工程基因工程42第一節(jié) 細菌的基因轉移和重組Bacterial Gene Transfer and Recombination1.接合作用（conjugation） 當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA就可從一個細胞（細菌）轉移到另一個細胞（細菌），這種類型的DNA轉移稱為接合作用。質粒 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子一、細菌的基因轉移第1頁/共80頁3F factor: 含有細菌性鞭毛蛋白的編碼基因.F-F+F+F+F+F-接合轉移F+第2頁/共80頁4 通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用。 例：溶菌時，裂

2、解的DNA片段被另一細菌攝取。溶溶菌菌攝取重組第3頁/共80頁5溶菌生長途徑(lysis pathway)： 噬菌體感染宿主時，噬菌體DNA在宿主內迅速增殖，產生新的病毒顆粒，溶解細菌，釋放出新生噬菌體。 溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑(lysogenic pathway)： 噬菌體感染宿主時，噬菌體DNA整合進宿主染色上，隨宿主復制而復制。 當遇到DNA損傷時，噬菌體（原噬菌體）從宿主菌（溶原菌）染色體上脫下來，進入溶菌生長途徑。溶菌感染重組溶菌細菌噬菌體3. 轉導作用（transduction）第4頁/共80頁63. 轉導作用（轉導作用（transduction） 當病毒從被感染的（供體）細

3、胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用。感染感染重組溶菌細菌第5頁/共80頁7二、二、 DNA重組重組 ( DNA recombination)同源重組 (homologous recombination)特異位點重組 (site-specific recombination)定義：不同DNA分子間發(fā)生的共價連接或DNA分子內較大片段的交換稱為重組或重排。轉座重組 (transposition recombination) 自然界的基因轉移和重組第6頁/共80頁8發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recom

4、bination)，它通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換，又稱為基本重組。 是最基本的DNA重組方式:以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制。（一）同源重組（一）同源重組第7頁/共80頁9 內切酶內切酶 (RecBCD)DNA侵擾侵擾(RecA)分支遷移分支遷移 (RecA) 內切酶內切酶(RecBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3

5、第8頁/共80頁10Holiday中間體中間體5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內切酶內切酶(RuvC)內切酶內切酶(RuvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體5 3 5 3 5 3 5 3 ABCDC5 5 5 5 3 3 3 3 ABD5 5 5 5 3 3 3 3 ACBD第9頁/共80頁11片段重組體(patch recombinant) 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體(splice recombinant) 切開

6、的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。 第10頁/共80頁12（二）位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。整合酶(intergrase, Int)： 是噬菌體DNA編碼的產物，是一種DNA結合蛋白，對噬菌體的的重組位點attP有強的結合力，催化attP和細菌重組位點attB之間的重組。整合宿主因子(intergration host factor, IHF):細菌編碼的產物。切離酶(Xis): 噬菌DNA編碼的產物.1. 噬菌體DNA的整合第11頁/共80頁13噬菌體

7、噬菌體DNA細菌細菌DNAPOPBOBattPattBIntIHFPOPBOBBOPPOBIntIHF，Xis噬噬菌菌體體DNADNA的的整整合合第12頁/共80頁142.細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位導致鞭毛相轉變導致H1抗原和H2抗原的交替表達H2H1rH1PPPhixhixhinPH2 鞭毛蛋白 阻遏蛋白H2H1rH1PPPhixhixhinPH1 鞭毛蛋白H片段片段H片段片段第13頁/共80頁15 H片段有兩個特異重組位點（hix） 為反向重復序列 H片段上有兩個啟動子P 其一驅動hin基因表達 H片段可在Hin和Fis控制下進行特異位點 重組(倒位)。 另一正向時驅動H2和rH

8、1基因表達 rH1為H1的阻遏蛋白基因。 H片段反向(倒位)時H2和rH1不表達，H1表達。H片段倒位導致鞭毛相轉變要點 第14頁/共80頁163.3.免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C RSSRSSRSS第15頁/共80頁17重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側均存在保守的重組信號序列(recombi

9、nation signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個，分別產生蛋白質RAG1和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重組信號序列切割位點(RAG2)RAG1位點第16頁/共80頁18V片段片段J片段片段RSSRSS間插DNAOHOH單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應分子內轉酯反應單鏈切開單鏈切開轉移核苷酸轉移核苷酸修復、連接修復、連接免疫球蛋白基因重排過程目目 錄錄V片段片段J片段片段第17頁/共80頁19（三）轉座重組(tra

10、nsposition recombination)定義：由插入序列(insertion sequences,IS）和轉座子(transposons)介導的基因轉移或重組。（1）IS轉座 IS轉座發(fā)生形式： 保守性轉座：IS由原位到新位。 復制性轉座：IS復制后，復制本遷到新位到， 另一個留在原位。 IS特征：IS兩側有二個分離的反向重復序列(inverted repeats, IR) 一個轉座酶（transposase)編碼基因 IS插入靶位點的兩側產生正向重復序列（derect repeat, DR） IRTransposase GeneIRDRDR第18頁/共80頁20ISATGCATAC

11、GT靶位點靶位點粘性末端切割TACGTATGCAATGCATACGTATGCATACGTATGCATACGTIS和靶位點共價連接復制修復缺口形成DRIS保守性轉座IRIRIRIRDRDRIS第19頁/共80頁21插入序列的復制性轉座第20頁/共80頁22 可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基因（2）轉座子轉座第21頁/共80頁23第22頁/共80頁24重組DNA技術是對攜帶遺傳信息分子進行設計和改造的分子工程，包括基因重組、克隆和表達。也就是人工操作基因的過程。實現(xiàn)基因克隆所用

12、的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。第23頁/共80頁25一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。技術水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 細胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮┑?4頁/共80頁26 目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白） (DNA cloning)應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子復制子(rep

13、licon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 第25頁/共80頁27（二）工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDN

14、A第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第26頁/共80頁28限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)型酶 型酶識別位點與切割位點不一致；沒有固定的切割位點；不產生特異性片段；型酶識別位點是特異的；切割位點位于識別位點中或附近；產生特異性片段；是最常用的工具酶。功能：能特異水解雙鏈DNA的磷酸二酯鍵。有特異切割位點；切割位點在識別位點以外；第27頁/共80頁29第一個字母取自

15、產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株或型；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。Hind 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶限制性核酸內切酶命名第28頁/共80頁30限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)定義：是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。作用特點：識別序列有特異性； 大多數(shù)識別位點具有回文結構 酶解后產生特征性切口 平端切口 5末端突出粘性末端切口 3末端突出粘性末端切口第29頁/共80頁31形成特征性切口S

16、ma平端切口CCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCC53555333Bam HGCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G535553335末末端突出粘性末端CTGCAGCTGCAGGACGTC GACGTC 535553333末末端突出粘性末端Pst第30頁/共80頁321. 大多數(shù)酶是識別順序不同，切割方式也不同。2.同尾酶：有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端。Bam HBgl GGATCC CCTAGG GATCC GGCCTAG AGATCT TCTAGAATCTAG GATCT AGG

17、ATCTCCTAGAAGATCCTCTAGG第31頁/共80頁333.同功異源酶 來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst第32頁/共80頁344.有些酶識別順序相同，切割方式不同，產生不同的末端。CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCXma第33頁/共80頁35 感興趣的基因或DNA序列，又稱目的DNA（target DNA）或外源DNA.1. 化學合成法2. 基因組DNA文庫(genomic

18、 DNA library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)第34頁/共80頁36優(yōu)點：合成速度快、準確性極高 適用：PCR引物、寡核苷酸探針、 人工接頭、小基因片段合成。第35頁/共80頁37組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子每個細菌都含一個重組DNA分子的多個拷貝限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。2.從基因組DNA文庫獲取目的基因目目 錄錄第36頁/共80頁38限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos LR cosR c

19、os右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos基因文庫目 錄cos L左臂20 Kb 外源 DNA 片段 第37頁/共80頁393.從cDNA文庫獲取目的基因 mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉錄酶 載體 受體菌 復制逆轉錄酶AAAAAAA ATTTTTTTT AAAAAAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 TTTTTTTT第38頁/共80頁404.聚合酶鏈反應(PCR)94變性 5min55退火70引物延伸第一個循環(huán)第二循環(huán)25-30次循環(huán)后

20、目的DNA可擴大100萬倍template DNA第39頁/共80頁41（四）基因載體定義：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。常用載體：質粒DNA、病毒DNA、人工載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的克隆載體稱為表達載體。第40頁/共80頁421. 質粒 (plasmid)特點 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙

21、鏈DNA分子。第41頁/共80頁43載體的選擇標準第42頁/共80頁44是由一系列大腸桿菌質粒DNA經重組技術構建的克隆載體。1.有一個復制起點，能夠獨立復制；2.有很多單一酶切位點，可供目的基因插入；3.有選擇標記，氨芐和四環(huán)素的抗性基因；4.分子量小，4363bp，可以轉化進入宿主.第43頁/共80頁45 是由pBR322質粒與M13噬菌體的片段重組而成的dsDNA質粒， 是最常見的克隆載體。 a-互補：pUC質粒中的Lac Z基因編碼b-半乳糖苷酶N-端的a片段，與宿主細胞編碼的缺陷型b-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因互補，合成完整的b-半乳糖苷酶.第44頁/共80頁46 pUC質粒內來源于大腸桿菌

22、的Lac Z基因，此基因能編碼b-半乳糖苷酶N-端的a片段，可與宿主細胞縮編碼的缺陷型的b-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因互補（ a 互補）能分解5-溴-4-氯-3-吲哚b-D-半乳糖苷（X-gal），形成蘭色菌落。當外源基因插入Lac Z基因時，宿主細胞不能合成完整的b-半乳糖苷酶，不能分解底物，為陽性菌落為白色，插入失敗的為蘭色（陰性）。這種篩選陽性重組子的方法稱為藍白斑篩選藍白斑篩選第45頁/共80頁472.2.噬菌體噬菌體(phage) (phage) 頭部蛋白質頭部蛋白質 DNA+DNA+內部蛋白內部蛋白質質 尾尾環(huán)環(huán) 尾尾心心尾尾鞘鞘 尾尾盤盤 尾纖尾纖絲絲 第46頁/共80頁48插入型載體：

23、gt系列（適用cDNA克?。┲脫Q型載體：EMBL系列（適用基因組克?。┏Ｓ玫氖删w載體噬菌體DNA：是雙鏈DNA分子； 基因組48.6kb； 呈線狀排列； 兩端有單鏈互補末端； 進入宿主后環(huán)化。第47頁/共80頁49M13噬菌體： 是環(huán)狀單鏈DNA分子； 只感染帶有F-因子的細胞（JM101,JM103等） 在宿主內通過不對稱復制形成M13顆粒構建的M13噬菌體載體 M13mp系列pUC系列第48頁/共80頁50粘性質粒(cosmid)有噬菌體DNA的cos位點；有整個pBR322的DNA序列；可容納35-45kb的外源DNA；可以體外包裝成噬菌體；在宿主內復制同質粒。常用的粘性質粒PJ88、

24、PAC79、C2XB等第49頁/共80頁51酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他第50頁/共80頁52第51頁/共80頁53第52頁/共80頁54二、重組DNA技術基本原理及操作目的基因的獲取克隆載體的選擇和構建外源基因與載體的連接DNA導入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達第53頁/共80頁551. 粘性末端連接方式(1)同一限制酶切位點或配伍末端連接GAATTCCTTAAGGAATTCC

25、TTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG53AATTCGGCTTAA55AATTC GGCTTAA555533（三）外源基因與載體的連接外源基因經DNA連接酶催化形成嵌合DNA的過程。第54頁/共80頁Bam H切割 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶, 15CGATCC GGCCTAG目的基因用 Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體DNA用Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體GCCTAGGCCTAGGATCC

26、GGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接第55頁/共80頁(2)不同限制酶切位點的連接Eco R切割位點Bgl 切割位點EcoR+ Bgl 雙酶切Eco R+ Bgl 雙酶切T4 DNA連接酶, 15C重組體GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAATCTAGAATTCG第56頁/共80頁CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R（3）人工接頭連接 在平端載體或DNA片段加上新的酶切識別位點，

27、酶切后可產生新的粘性末端。（4）同聚物加尾連接 在末端轉移酶的作用下，在DNA末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，效率較高。第57頁/共80頁目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因自連載體(5)平端連接限制性內切酶切割產生的平端;粘端補齊或切平形成的平端，效率較低。第58頁/共80頁60受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導入方式轉化 (transformation)：外源DNA（質粒導入細菌的過程。轉染 (transfection)：以噬菌體為載體構建的重組子導入細胞的過程。（四）重組DNA導入受體菌第59頁/

28、共80頁61（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇(2) 標志補救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 2. 免疫學方法免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等如免疫化學方法及酶免檢測分析等第60頁/共80頁(插入失活法)抗藥性標記選擇目目 錄錄第61頁/共80頁組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成 DNADNA重組體標志補救標志補救第62頁/共80頁插入目的基因利用 互補原理篩選重組體含有 5-溴-4-氯-3-吲哚b-D-半乳糖苷（X-gal）和Lac 操縱子誘導劑的培養(yǎng)基b-半乳糖苷酶

29、N-端的a片段b-半乳糖苷酶C-端的a片段b-半乳糖苷酶C-端的a片段第63頁/共80頁65顯影或顯色將核酸固定到膜上分子雜交法菌落印跡原位雜交斑點印跡雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交將菌落或噬菌斑印跡到膜上提取DNA或RNA提取DNA提取RNA裂解細菌或噬菌體變性DNA或RNA瓊脂糖凝膠電泳變性DNA將核酸點到膜上將核酸轉移到膜上預雜交（消除非特異性吸附）加入標記的探針雜交第64頁/共80頁菌菌落落印印跡跡原原位位雜雜交交第65頁/共80頁SouthernSouthern印跡印跡第66頁/共80頁雞的肌球蛋白的克隆和檢出目目 錄錄免疫學方法第67頁/共80頁 以 質 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程第68頁/共80頁70重組DNA技術操作過程小 結分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉轉入受體菌 篩篩選重組體 第69頁/共80頁71重組重組DNADNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化轉染宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交