HPLC高效液相色譜

1、Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）是）是20世紀(jì)世紀(jì)60年年代末代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。 它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈

2、敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：進(jìn)行比較： Tanghui.pha.shzu HPLC優(yōu)點(diǎn)：高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。優(yōu)點(diǎn)：高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。 高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá) 10cm3min-1. 如分離苯的羥基化合物

3、，如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需個(gè)組分只需1min就可完成。就可完成。 對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約170cm，柱徑，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度為，流動(dòng)相速度為30cm3h-1，需用，需用20多小時(shí)才能分離出多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用種氨基酸；而用HPLC，只需，只需lh之內(nèi)即可完成。之內(nèi)即可完成。 又如用又如用25cm0.46cm的的LichrosorbODS(5)的柱，采的柱，采用梯度洗脫，可在不到用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分個(gè)組分. Tanghui.pha.shzu (1)GC分析對(duì)象只限于分析氣體和

4、沸點(diǎn)較低的化合物，它分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的們僅占有機(jī)物總數(shù)的20。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80的的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用要采用HPLC進(jìn)行分離和分析。進(jìn)行分離和分析。 (2)GC采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒(méi)有親和力，即采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒(méi)有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而HPLC中流動(dòng)相中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，

5、并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。極大方便。Tanghui.pha.shzu(3)GC一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而HPLC法則經(jīng)常可法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。在室溫條件下工作。 總之，總之，HPLC是吸取了是吸取了GC與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目并用現(xiàn)代化手段

6、加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前前HPLC已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類(lèi)、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分多糖類(lèi)、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。離和分析。 HPLC主要缺點(diǎn)：儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格。主要缺點(diǎn)：儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格。Tanghui.pha.shzu 和和GC一樣，一樣，LC分離系統(tǒng)也由固定相和流動(dòng)相組成。分離系統(tǒng)也由固定相和流動(dòng)相組成。其固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體其固定相可以是吸附

7、劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹(shù)脂或多孔性凝膠；流動(dòng)表面涂上一層液膜）、離子交換樹(shù)脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。 色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱(chēng)溶質(zhì)）與溶色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱(chēng)溶質(zhì)）與溶劑劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間

8、的作用，作用力的大小，決定色譜過(guò)程的保留行為。的大小，決定色譜過(guò)程的保留行為。 根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類(lèi)型。阻色譜等類(lèi)型。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)

9、帶入色譜柱進(jìn)行分流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。此得到液相色譜圖。 Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 此外還配有自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。此外還配有自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。 Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸動(dòng)相阻力很大

10、，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。液系統(tǒng)。 它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由、等組成。等組成。 核心部件核心部件。壓力：壓力：150350105 Pa。 應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。 Tanghui.pha.shzu 常用的輸液泵分為常用的輸液泵分為恒流泵恒流泵和和恒壓泵恒壓泵兩種。兩種。 恒流泵特點(diǎn)：恒流泵特點(diǎn)：在一定操作條件下，輸出流量保持恒定在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變

11、化無(wú)關(guān)；而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)； 恒壓泵特點(diǎn)：恒壓泵特點(diǎn)：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。 它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱(chēng)機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，流泵又稱(chēng)機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。Tanghui.pha.shzu輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類(lèi)。機(jī)械泵輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類(lèi)。機(jī)械泵中又有中又有螺旋傳動(dòng)

12、注射泵螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)泵單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵雙活塞往復(fù)泵和和往復(fù)式隔膜泵往復(fù)式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能見(jiàn)下表。幾種輸液泵的基本性能見(jiàn)下表。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu雙活塞往復(fù)泵：雙活塞往復(fù)泵： 如下如下圖圖a所示，雙活塞往復(fù)泵有一個(gè)精心設(shè)計(jì)的偏所示，雙活塞往復(fù)泵有一個(gè)精心設(shè)計(jì)的偏心凸輪，用同步電機(jī)或變速直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)偏心凸輪，心凸輪，用同步電機(jī)或變速直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)偏心凸輪，偏心凸輪再推動(dòng)兩活塞作往復(fù)運(yùn)動(dòng)。偏心凸輪短半徑偏心凸輪再推動(dòng)兩活塞作往復(fù)運(yùn)動(dòng)。偏心凸輪短半徑端所對(duì)應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的下單向閥打開(kāi)吸端所對(duì)應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的

13、下單向閥打開(kāi)吸入流動(dòng)相，與此同時(shí)，偏心凸輪的長(zhǎng)半徑端所對(duì)應(yīng)的入流動(dòng)相，與此同時(shí)，偏心凸輪的長(zhǎng)半徑端所對(duì)應(yīng)的另一活塞被推入，使其上單向閥打開(kāi)，并將流動(dòng)相送另一活塞被推入，使其上單向閥打開(kāi)，并將流動(dòng)相送至色譜柱。于是，兩活塞交替伸縮，往復(fù)運(yùn)動(dòng)，獲得至色譜柱。于是，兩活塞交替伸縮，往復(fù)運(yùn)動(dòng)，獲得的排液特性如的排液特性如圖圖b所示，即具有穩(wěn)定的輸出流量，這所示，即具有穩(wěn)定的輸出流量，這樣就能避免單活塞泵液流脈沖的問(wèn)題。樣就能避免單活塞泵液流脈沖的問(wèn)題。Tanghui.pha.shzu 雙活塞往復(fù)泵的輸液雙活塞往復(fù)泵的輸液流量比單活塞泵小得多。流量比單活塞泵小得多。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 不必使用消除脈沖的不必

14、使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗。的壓力消耗。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 設(shè)備成本較高，流量設(shè)備成本較高，流量調(diào)節(jié)也比單活塞泵復(fù)雜。調(diào)節(jié)也比單活塞泵復(fù)雜。雙活塞往復(fù)泵的構(gòu)造和排液特性雙活塞往復(fù)泵的構(gòu)造和排液特性Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu單流路真空脫氣裝置的原理單流路真空脫氣裝置的原理Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu高壓梯度裝置結(jié)構(gòu)Tanghui.pha.shzu四元低壓梯度系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Tanghui.pha.shzu 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，利用兩臺(tái)

15、高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。混合后進(jìn)入色譜柱。 一臺(tái)高壓泵一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。入高壓泵中混合。Tanghui.pha.shzu HPLC柱比柱比GC柱短得多（約柱短得多（約530cm），所以柱外），所以柱外展寬（又稱(chēng)柱外效應(yīng)）較突出。展寬（又稱(chēng)柱外效應(yīng)）較突出。 柱外展寬柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)

16、器中存在死體積。要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。 柱外展寬可分柱外展寬可分柱前柱前和和柱后柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此展寬的主要因素，因此HPLC法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。進(jìn)樣裝置。 結(jié)構(gòu)如圖所示：結(jié)構(gòu)如圖所示：Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管柱管與與固定相固定相兩部分。兩部分。 柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、

17、銅及內(nèi)襯光滑的聚合柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。 一般色譜柱長(zhǎng)一般色譜柱長(zhǎng)530cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜，凝膠色譜柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑312mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。以上。 一般在分離前備有一個(gè)一般在分離前備有一個(gè)前置柱前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，的固定相飽和，使它在流

18、過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。保證分離柱的性能不受影響。 Tanghui.pha.shzu 柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。 一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢(shì)是

19、減小填料粒度和柱徑以提高柱效。Tanghui.pha.shzu Tanghui.pha.shzu 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。其特點(diǎn)：有響應(yīng)。其特點(diǎn)： 靈敏度高；靈敏度高； 線形范圍高；線形范圍高； 流通池可做的很?。魍ǔ乜勺龅暮苄。?mm 10mm ，容積，容積 8L）；）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作；波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。可用于梯度洗脫。 Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：光電二

20、極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu二極管陣列檢測(cè)器（二極管陣列檢測(cè)器（優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：Tanghui.pha.shzu Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 高靈敏度、高選擇性；高靈敏度、高選擇性； 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物霉素、

21、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)；、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)；Tanghui.pha.shzu測(cè)量溶劑電導(dǎo)率，特別適合于離子溶液。測(cè)量溶劑電導(dǎo)率，特別適合于離子溶液。Tanghui.pha.shzu 由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測(cè)器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。光源和光檢測(cè)器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。Tanghui.pha.shzu 色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過(guò)加熱漂移管時(shí)，或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過(guò)加熱漂移管時(shí)，流動(dòng)相中的溶

22、劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在流動(dòng)相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，所以無(wú)關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。 適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光的檢測(cè)。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫

23、度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測(cè)器相比，它的基源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測(cè)器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu。 。 Tanghui.pha.shzu 液液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相。固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相。 吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。表面存在吸附中心。 液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行

24、分離的。不同來(lái)進(jìn)行分離的。固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是用的是510m的硅膠吸附劑；的硅膠吸附劑； 各種不同極性的一元或多元溶劑。各種不同極性的一元或多元溶劑。Tanghui.pha.shzu 當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋１涣鲃?dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑，于是在留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃?/p>

25、附的流動(dòng)相溶劑，于是在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附: X + nSad = Xad + nSTanghui.pha.shzu達(dá)平衡時(shí)達(dá)平衡時(shí),有有 nadnadadSXSXK 其中其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小值小,則保留值弱，易于洗脫。則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過(guò)吸附等溫線值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。數(shù)據(jù)求出。 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異

26、構(gòu)體有較高選擇性；具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；Tanghui.pha.shzu Tanghui.pha.shzu Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 在液在液-液色譜中液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體（互不相流動(dòng)相和固定相都是液體（互不相溶）。它能適用于各種樣品類(lèi)型的分離和分析，無(wú)論是極溶）。它能適用于各種樣品類(lèi)型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。型的化合物。 液液分配色譜的分離原

27、理基本與液液萃取相同，都是液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。同的分配系數(shù)。 liquid- liquid partition chromatographyTanghui.pha.shzu 所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。 由于液液色譜中流動(dòng)相參

28、與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液可解決分離問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液，氧二丙睛氧二丙睛，中等極性的，中等極性的聚乙二醇聚乙二醇，非極性的，非極性的角鯊?fù)榻酋復(fù)榈取５取?Tanghui.pha.shzu Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu chemical bonded partition chromatographyTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui

29、.pha.shzu,它是最先用于液它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)： SiOHROHSiORH20由于這類(lèi)鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好由于這類(lèi)鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性的傳質(zhì)特性,但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相。定，因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相。 制備反應(yīng)如下制備反應(yīng)如下 Tanghui.pha.shzu 共價(jià)鍵健合固定相不易水解，且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。共價(jià)鍵健合固定相不易水解，且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。 缺點(diǎn)是格

30、氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在在48范圍內(nèi)范圍內(nèi).OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2Tanghui.pha.shzu制備反應(yīng)如下：制備反應(yīng)如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl 這類(lèi)鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有這類(lèi)鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70以下，以下，pH=28范圍內(nèi)正常工范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛作，應(yīng)用較廣泛. Tanghui.pha.shzu 此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，

31、如硅此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠膠C18H37、硅膠苯基等；硅膠苯基等； 流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙腈、水和流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙腈、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；合物； 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；也可用于分離極性化合物； 若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類(lèi)等。易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)

32、堿、酚類(lèi)等。 反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。的優(yōu)點(diǎn)。 Tanghui.pha.shzu Tanghui.pha.shzu關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作疏溶劑作用理論用理論來(lái)解釋。來(lái)解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，這種這種“分子毛分子毛”有較強(qiáng)有較強(qiáng)的疏水特性。的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離含有極性官能

33、團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開(kāi)固定相，并減小其保留作用，見(jiàn)下圖。顯然，兩種它離開(kāi)固定相，并減小其保留作用，見(jiàn)下圖。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，此法是以極性的有機(jī)

34、基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類(lèi)）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙劑（如烴類(lèi)）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙臘等）為流動(dòng)相，分離極性化合物臘等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。 此時(shí)，此時(shí)，組分的分配比組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類(lèi)型的化合物?；衔铮貏e適用于分離不同類(lèi)型的化合物

35、。Tanghui.pha.shzu 當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H 一一CH2NH2、COOH、一、一CH2N（CH3）等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色）等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；譜的固定相； 流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交分離原理與離子交換色譜類(lèi)同。換色譜類(lèi)同。 Tanghui.pha.shzu鍵合相色譜的鍵合相色譜的最大優(yōu)點(diǎn)最大優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和種類(lèi)，可有效地分離各種通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和種類(lèi)，可有效地分離各種類(lèi)型化合物（非

36、極性、極性和離子型）。此外，由于鍵類(lèi)型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有80的分離問(wèn)題是用的分離問(wèn)題是用鍵合相色譜法解決。鍵合相色譜法解決。此法的此法的最大缺點(diǎn)最大缺點(diǎn)：不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系?；瘎┑木彌_溶液作流動(dòng)相的體系。如何根據(jù)樣品極性種類(lèi)來(lái)選擇化學(xué)鍵合的固定相，如何根據(jù)樣品極性種類(lèi)來(lái)選擇化學(xué)鍵合的固定相，見(jiàn)下表。見(jiàn)下表。Tanghui.pha.shzuTanghu

37、i.pha.shzu ion-exchange chromatography 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。 凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離。亦可用于有機(jī)物的分離。 例如氨基酸、核酸、蛋例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。應(yīng)用范圍較廣

38、。Tanghui.pha.shzu 離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下： 陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+ 陰離子交換：陰離子交換： RNR3+Cl

39、-+X-RNR3+X-+ Cl-一般形式：一般形式： RAB RBATanghui.pha.shzu 達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：的選擇系數(shù)）： 式中式中Ar，Br 分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子（分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（和試樣離子（B）的濃度，）的濃度，A、B則代表它們?cè)谌芤褐袆t代表它們?cè)谌芤褐械臐舛取ｋx子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見(jiàn)從表示試樣離子的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見(jiàn)從表示試樣離子B對(duì)于對(duì)于A型樹(shù)脂親和力的大小：型樹(shù)脂親和力的大?。篕B/A越大，說(shuō)明越大，說(shuō)明B離子交離子交換能力越大，越易保留而

40、難于洗脫。一般說(shuō)來(lái)，換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說(shuō)來(lái)，B離子離子電荷越大，水合離子半徑越小，電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。值就越大。rrABABABK/Tanghui.pha.shzu 對(duì)于典型的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一價(jià)離子的對(duì)于典型的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一價(jià)離子的KB/A值按以下順序：值按以下順序： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 二價(jià)離子的順序?yàn)椋憾r(jià)離子的順序?yàn)椋?Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+ 對(duì)于季鋁型強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性對(duì)于季鋁型強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋喉樞驗(yàn)椋?ClO4-I

41、-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOFTanghui.pha.shzu 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類(lèi)：作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類(lèi)：合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分。強(qiáng)弱之分。Tanghui.pha.shzu 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)

42、聚合物，直它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為徑約為520m，有微孔型和大孔型之分。，有微孔型和大孔型之分。 它是在直徑約對(duì)它是在直徑約對(duì)30m的固體情性核上，凝聚的固體情性核上，凝聚12m厚的樹(shù)脂層。厚的樹(shù)脂層。Tanghui.pha.shzu 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹(shù)脂。上面涂一層很薄的離子交換樹(shù)脂。 它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類(lèi)型。表面。它也分為兩種類(lèi)型。 一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種一種是鍵合薄殼型

43、，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，其載體是多孔微粒硅膠。是鍵合微粒載體型，其載體是多孔微粒硅膠。 后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)快速分離。快速分離。 Tanghui.pha.shzu 離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子的種類(lèi)、濃度和的種類(lèi)、濃度和pH值可控制值可控制k值，改變選擇性。值，改變選

44、擇性。 如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，各種陰離子滯留次序?yàn)椋簩?duì)于陰離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，各種陰離子滯留次序?yàn)椋簷幟仕犭x子檸檬酸離子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F- 所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。Tanghui.pha.shzu 陽(yáng)離子的滯留次序大為：陽(yáng)離子的滯留次序大為：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2

45、+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十十 但差別不如陰離子明顯。關(guān)于但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不值的影響，要視不同情況而定。同情況而定。 例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。值來(lái)控制。 增大增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少； 降低降低pH值，其結(jié)果相反。值，其結(jié)果相反。 但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。的保留增大。 Tanghui.

46、pha.shzuion pair chromatography 離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。它是離子對(duì)革取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。極好方法。它是離子對(duì)革取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在在20世紀(jì)世紀(jì)70年代中期，年代中期，Schill等人首先提出離子對(duì)色譜法，等人首先提出離子對(duì)色譜法，后來(lái)，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。后來(lái)，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。 離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱(chēng)對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，相反的離子（稱(chēng)對(duì)離子或反離子）加到

47、流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。行為的一種色譜法。Tanghui.pha.shzu 關(guān)于離子對(duì)色譜機(jī)理，至今仍不十分明確，已提出三關(guān)于離子對(duì)色譜機(jī)理，至今仍不十分明確，已提出三種機(jī)理：種機(jī)理： 離子對(duì)形成機(jī)理；離子對(duì)形成機(jī)理； 離子交換機(jī)理；離子交換機(jī)理； 離子相互作用機(jī)理。離子相互作用機(jī)理。 現(xiàn)以離子對(duì)形成機(jī)理說(shuō)明之。假如有一離子對(duì)色譜現(xiàn)以離子對(duì)形成機(jī)理說(shuō)明之。假如有一離子對(duì)色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，并在其體系，固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，并在其中加入一種電

48、荷與組分離子中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子相反的離子B+，B+離子由于離子由于靜電引力與帶負(fù)電的人組分離子生成離子對(duì)化合物靜電引力與帶負(fù)電的人組分離子生成離子對(duì)化合物A-B+。離子對(duì)生成反應(yīng)式離子對(duì)生成反應(yīng)式 Tanghui.pha.shzu 由于離子對(duì)化合物由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。固定相（有機(jī)相）提取。 組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的能力組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的能力大小不同以及形成的離子對(duì)流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離大小不同以及形成的離子對(duì)流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不

49、同，因而出峰先后不同。子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同。 這就是離子對(duì)色譜法分離的基本原理。這就是離子對(duì)色譜法分離的基本原理。KABA-水相 +A-B+有機(jī)相B+有機(jī)相Tanghui.pha.shzu 離子對(duì)色譜法類(lèi)型很多，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的極性離子對(duì)色譜法類(lèi)型很多，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的極性可分為可分為反相離子對(duì)反相離子對(duì)和和正相離于對(duì)正相離于對(duì)色譜法。色譜法。 其中以鍵合相離子對(duì)色譜法最重要。這種色譜法的固其中以鍵合相離子對(duì)色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相如十八烷基鍵合相（定相采用非極性的疏水鍵合相如十八烷基鍵合相（ODS）等，流動(dòng)相為加有平衡離子（反離子）

50、的極性溶液（如等，流動(dòng)相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇甲醇-水或乙睛水或乙睛-水）。水）。 根據(jù)離子對(duì)生成反應(yīng)式，平衡常數(shù)根據(jù)離子對(duì)生成反應(yīng)式，平衡常數(shù) KAB可表示為可表示為水相水相有機(jī)相BABAKABTanghui.pha.shzu根據(jù)上兩式，有根據(jù)上兩式，有 式中式中為相比率為相比率。容量因子。容量因子k隨隨KAB和和B+水相水相的增大的增大而增大。而增大。 鍵合相反相離子對(duì)色譜法操作簡(jiǎn)便，只要改變流動(dòng)鍵合相反相離子對(duì)色譜法操作簡(jiǎn)便，只要改變流動(dòng)相的相的pH值、平衡離子的濃度和種類(lèi)，就可在較大范圍內(nèi)值、平衡離子的濃度和種類(lèi)，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混

51、合物的分離問(wèn)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問(wèn)題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛.1水相BKVVKkABMS 根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù)根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù) 水相水相有機(jī)相BKABAKABTanghui.pha.shzu 常采用烷基銨類(lèi)，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六常采用烷基銨類(lèi)，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；烷基三甲銨作為對(duì)離子； 常采用烷基磺酸類(lèi)，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；常采用烷基磺酸類(lèi)，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；Tanghui.pha.shzusize- exclusion chromatography 尺寸排阻色譜法又稱(chēng)尺寸排阻色

52、譜法又稱(chēng)凝膠色譜法凝膠色譜法，主要用于較大分子，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。 尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。Tanghui.pha.shzu（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息

53、。的某些信息。（2）保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低）保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器的檢測(cè)器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于別必須大于10才能得以分離。才能得以分離。Tanghui.pha.shzu 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)方法。其固定

54、相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)凝膠，它類(lèi)似于凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。 體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；被淋洗出來(lái)； 中等體積的分子部分滲透；中等體積的分子部分滲透； 小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。 這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過(guò)程模型見(jiàn)圖。中流出。其滲透過(guò)程模型見(jiàn)圖。 Tanghui.pha.shzuTanghui.p

55、ha.shzu分類(lèi)：分類(lèi)：凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾色譜（ gel filtration chromatography , GFC ） ： 以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。法。主要適合于水溶性高分子的分離。凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜（ gel permeation chromatography , GPC ）：）： 以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用

56、主要用于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。Tanghui.pha.shzu 排阻色譜固定相種類(lèi)很多，一般可分為軟性、半剛排阻色譜固定相種類(lèi)很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類(lèi)。性和剛性凝膠三類(lèi)。 凝膠：指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于凝膠：指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。聚體。 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹

57、到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 Tanghui.pha.shzu 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。效液相色譜時(shí)，流速不宜大。 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流

58、動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速，流速1cm3s-1；否則將影；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。響凝膠孔徑，造成不良分離。Tanghui.pha.shzu 排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時(shí)，溶劑也必須膠時(shí)，溶劑也必須能溶脹凝膠能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，。另外，溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。

59、因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。 選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動(dòng)相有四選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。Tanghui.pha.shzu Affinity chromatograph 定義：定義：利用蛋

60、白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生利用蛋白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生物活性配位體之間的特異親和力進(jìn)行分離的液相色譜方法。物活性配位體之間的特異親和力進(jìn)行分離的液相色譜方法。 固定相：固定相：將具有生物活性的配位體以共價(jià)鍵結(jié)合到不將具有生物活性的配位體以共價(jià)鍵結(jié)合到不溶性固體基質(zhì)上制得。溶性固體基質(zhì)上制得。 生物活性配位體生物活性配位體：常用的有酶（如底物及其類(lèi)似物）、：常用的有酶（如底物及其類(lèi)似物）、輔酶（如類(lèi)固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多輔酶（如類(lèi)固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。糖）、抗生素（核苷酸）等。 基質(zhì)：基質(zhì)：通常為凝膠，許多無(wú)機(jī)和有