基因工程的基本操作程序(非常全面)

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟有了目的基因，我們才有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用遺傳、表達和發(fā)揮作用 載體進入受體細胞穩(wěn)定載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生表達，才能

2、實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。中的轉(zhuǎn)化。 才能確定目的基因是否才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。遺傳和正確表達。1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 （一）、（一）、目的基因主要是指目的基因主要是指 編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因供體生物細胞供體生物細胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：將需要的基因從供體生物細胞內(nèi)提取出來即：將需要的基因從供體生物細胞內(nèi)提取出來目前被廣泛提取使目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、云金桿菌抗蟲基因

3、、植物抗病基因植物抗病基因人胰島人胰島素基因等。也可以是素基因等。也可以是一些具有調(diào)控作用的一些具有調(diào)控作用的因子因子l從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因l 利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因l 人工合成人工合成 1、從基因文庫中直接獲取、從基因文庫中直接獲?。?）基因文庫）基因文庫將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（2）基因文庫的分類基因文庫的分類種種類類基因組文庫：

4、基因組文庫：部分基因文庫：部分基因文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文庫文庫某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補單鏈互補DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶cDNAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解基因組文庫和部分基因組文庫基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫文庫)比較比較依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。（課本）依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。（課本）如：根據(jù)如：

5、根據(jù)基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性?；虻谋磉_產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。（4 4）獲取目的基因的根據(jù)）獲取目的基因的根據(jù)（3）構(gòu)建構(gòu)建基因文庫的目的基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。目的基因。 （1）概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段（2）原理：原理

6、：DNADNA復(fù)制復(fù)制2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因一段已知目的基因的核苷酸序列，一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成以便根據(jù)這一序列合成引物。引物。（3 3）引物：引物：是一小段單是一小段單鏈鏈DNADNA（或（或RNARNA），），作為作為DNADNA復(fù)制的起始復(fù)制的起始點，一般所說引物，點，一般所說引物，指指DNADNA引物。引物。 何為引物？（4）過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-

7、65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端端延伸，合成與模板互補延伸，合成與模板互補 的的_ _。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈（5）方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴為擴增循環(huán)的次數(shù)）增循環(huán)的次數(shù)）（6）結(jié)果：結(jié)果：指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 具體過程具體過程PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))（8）

8、PCR技術(shù)擴增與技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點點原理原理原料原料條件條件不不同同點點解旋解旋方式方式場所場所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補配對堿基互補配對四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細胞核內(nèi)細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶細胞內(nèi)的細胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整個形成整個DNA分子分子3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時

9、使目的基因能夠表以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。達和發(fā)揮作用。 核心核心二、基因表達載體的構(gòu)建二、基因表達載體的構(gòu)建1、目的：、目的：（1 1）用一定的用一定的_切切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。（2 2）用用_切斷切斷目的基因，使其產(chǎn)生目的基因，使其產(chǎn)生_ _。 核心核心（3 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量處，再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNA DNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADN

10、A連接酶連接酶相同相同二、基因表達載體的構(gòu)建二、基因表達載體的構(gòu)建質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒） 核心核心同一種同一種二、基因表達載體的構(gòu)建二、基因表達載體的構(gòu)建2 2、過程、過程: : 科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，插入載體質(zhì)粒中，然后導入

11、棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有沒有表達。表達。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子插入啟動子( (抗蟲基因抗蟲基因首端首端) )，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲沒有抗蟲能力能力?？茖W家?？茖W家又又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止插入終止子子( (抗蟲基因末端抗蟲基因末端) )，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了有了抗蟲能力。抗蟲能力。 問題：基因表達載體需要有什么才能表達？問題：基因表達載體需要有

12、什么才能表達？a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標記基因、標記基因啟動子：終止子：（見課本）二者都屬于基因表達載體的一部分。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： 目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且內(nèi)，并且在受在受體細體細胞內(nèi)維持胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達（二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎? 1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

13、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力子葉植物沒有感染能力原理：農(nóng)桿菌的原理：農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的色體的DNA上。上。過程：過程：優(yōu)點：經(jīng)濟有效優(yōu)點：經(jīng)濟有效（2）基因槍法基因槍法- -適合單子葉植物適合單子葉植物（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎?、將目的基因?qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（

14、受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?Ca2+法）法）原核生物特點：原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 用用Ca2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載表達載體與感受態(tài)細胞混合體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNA分子分子三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

15、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法Ca2+處理法處理法四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功（一）、檢測（一）、檢測1 1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 ( (關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟) ).首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作標記等作標記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示若顯示出雜交帶出雜交帶,表明染色體已

16、插入染色體表明染色體已插入染色體DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:歸納步驟（二）、鑒定（個體生物學水平）（二）、鑒定（個體生物學水平）2 2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA3 3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法: :分分 子子 雜雜 交交方法方法: :抗原抗體雜交抗原抗體雜交過程過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRN

17、A原核細胞的基因結(jié)構(gòu)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)： 能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)：非編碼區(qū)： 不編碼蛋白質(zhì)不編碼蛋白質(zhì), ,能調(diào)控遺傳信息表達能調(diào)控遺傳信息表達真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點編碼區(qū)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：外顯

18、子： 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 能編碼蛋白質(zhì)的序列能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列1）以下說法正確的是）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C C2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是 A、能復(fù)

19、制、能復(fù)制 （ ） B、有多個限制酶切點、有多個限制酶切點 C、具有標記基因、具有標記基因 D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNA3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用、限制酶只在獲得目的基

20、因時才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運載體、質(zhì)粒都可作為運載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料資料5）基因工程是在）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是堿基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結(jié)合、目的基因與運載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、目的基因的檢測和表達、目的基因的檢測和表達2 2、下列屬于獲取目的

21、基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.1 1、 在基因工程中，把選出的目的基在基因工程中，把選出的目的基因（共因（共10001000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是脫氧核苷酸是460460個）放入個）放入DNADNA擴增儀中擴擴增儀中擴增增4 4代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧

22、核苷酸的個數(shù)是（脫氧核苷酸的個數(shù)是（ ）個）個A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 75603.細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B B有利于對目的基因是否導入進行檢測有利于對目的基因是否導入進行檢測C C增加質(zhì)粒分子的分子量增加質(zhì)粒分子的分子量D D便于與外源基因連接便于與外源基因連接4.4. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是有關(guān)基因工程的敘述正確的是A A限制酶只在獲得目的基因時才用限制酶只在獲得目的基

23、因時才用B B重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的C C質(zhì)粒都可作為運載體質(zhì)粒都可作為運載體 D D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料5.哪項不是基因表達載體的組成部分哪項不是基因表達載體的組成部分( ) A.啟動子啟動子 B.終止密碼終止密碼 C.標記基因標記基因 D.目的基因目的基因6. (2008,6. (2008,全國高考全國高考) )已知某種限制酶在一線性已知某種限制酶在一線性DNADNA分子上有分子上有3 3個酶切位點。如果該線性個酶切位點。如果該線性DNADNA分子在分子在3 3個個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a a、b b、c c、d d四種不同長度的四種不同長度的DNADNA片段?，F(xiàn)有多個上述線性片段?，F(xiàn)有多個上述線性DNADNA分子，若在每個分子，若在每個DNADNA分子上至少有分子上至少有1 1個酶切位點被個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶酶切后，這些該酶切斷，則從理論上講