目的基因與克隆載體的體外重組新

1、會計學(xué)1目的基因與克隆載體的體外重組新目的基因與克隆載體的體外重組新基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢連接方式同聚物加尾加人工接頭加DNA銜接物粘性末端連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接（同種酶）5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRI粘性末端連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接（同

2、尾酶）BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclITGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT粘性末端連接雙酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA ligaseGA

3、ATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGEcoRIGGACTTCCTGAABamBam平末端連接HpaI5 5GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5GTTCAA AACTTG5 5 CCCGGG5 GGG CCC3 T4-DNA ligaseCCCAACGGGTTG5 5GTTGGGCAACCC5 CCCGGGGGGCCC5 StuI3 平末端連接-不同粘性末端的平端連接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-

4、DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平5 CG5 GCKlenow補平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC粘性末端的更換BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow補平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5 5PstICTGCAGGACGTCPstI linker5 p3 HOOH

5、3 p 5 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴 Poly（dA）末端延伸連接同聚物加尾C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱GTCATTTTTTTTTGAA

6、AAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸連接同聚物加尾 （平齊末端）末端延伸連接同聚物加尾 （3突出末端）CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGG

7、GGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I末端延伸連接同聚物加尾 （5突出末端）5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow補平Klenow補平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTT

8、AAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCC CCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amH IBamH IEcoR IBamH I末端延伸連接人工接頭加尾CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCC5 EcoR I末端延伸連接人工接頭加尾55 GCT

9、TAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5T4-DNA ligase5CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCCEcoR ICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火EcoR IEcoR IEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCC末端延伸連接DNA銜接物加尾CCG5 GGCTTAA5 EcoR I AATTCGG5 GCC5 EcoR I重組率重組率的定義： 重組率 = 含有外源DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) （在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25 - 75%） 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要

10、指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。重組率提高重組率的方法：提高外源DNA片段與載體的分子比：5 : 1 10 : 1 載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO堿性磷酸酶5 GAATTCCTTAAG5 重組率提高重組率的方法：人工構(gòu)建粘性末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3 C5C3 GTACG

11、T4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火C3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢粘性末端連接單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接（同種酶）5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火

12、GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRI粘性末端連接雙酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGEcoRIGGA