分子生物學(xué)研究方法-PCRppt課件

1、 分子生物學(xué)研討方法 .PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用.一.多聚酶鏈反響(Polymerase Chain Reaciton,PCR)一原理熱變性94度引物退火55度延伸72度DNA聚合酶dNTP.變性退火引物.經(jīng)2530次循環(huán)，目的DNA添加166-7.二。PCR反響的主要成分和作用1。DNA聚合酶：PCR反響運(yùn)用的是耐熱DNA聚合酶。 比如：Taq DNA聚合酶。 可分為兩大類：1具有校正功能的有35核酸酶活性比如：Vent,pfu,pwo等2不具有校正功能的 無35核酸酶活性比如：普通的Taq DNA聚合酶2。引物1引物長(zhǎng)度以1530個(gè)bp為宜。引物過短會(huì)使特異性降低， 過長(zhǎng)時(shí)那么本錢添加，且

2、也會(huì)降低特異性。.2引物堿基盡能夠隨機(jī)分布，防止出現(xiàn)嘌呤，嘧啶堆積景象， 引物G+C含量宜在4555%左右。3引物內(nèi)部不應(yīng)構(gòu)成二級(jí)構(gòu)造，兩個(gè)引物之間尤其在3末端不應(yīng) 有互補(bǔ)鏈存在。4引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí) 進(jìn)展輔助檢索分析。5引物3末端堿基：原那么上要求引物3末端與模板DNA一定要配對(duì)。 另外引物3末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研討闡明，引物3末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)，不同堿基 的引發(fā)效率存在很大差別。當(dāng)末位堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情 況下，也能引發(fā)鏈的合成。而末位堿基為T時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)效率 大大降低。G,C居于中間，所以3末端

3、的末位堿基最好選T,G,C而 不選A.(6) 引物5末端堿基：PCR反響物5末端堿基并沒有嚴(yán)厲限制， 只需與 模板DNA結(jié)合的引物程度足夠，其5末端堿基可以不 與模板DNA匹 配，而呈游離形狀。這樣引物設(shè)計(jì)時(shí)可以在5末端加上限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)或其他短的序列?？梢约覣TG起始密碼，可以加錯(cuò)配堿基造 成突變。.3。PCR反響緩沖液：組成50mM KCl10mM Tris.Cl (pH 8.4)1.5mM MgCl2Mg+是Taq酶活性所必需的金屬離子。 Mg+濃度的高低能影響反響的特異性和擴(kuò)增片斷的產(chǎn)率。1.52.0mM Mg+是比較適宜的。 Mg+過量能添加非特異性擴(kuò)增并影響產(chǎn)率。4。底物dNT

4、P濃度在PCR反響中，dNTP濃度應(yīng)在20200uM, dNTP濃度過高可加快反響速度。同時(shí)，還可添加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)本錢。反之，低濃度的dNTP會(huì)導(dǎo)致反響速度的下降，但可提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。此外，由于dNTP能夠與Mg+ 結(jié)合，因此應(yīng)留意Mg+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。.三怎樣提高PCR的特異性1熱啟動(dòng)hot-start) 比如1將Taq酶與其它反響體系經(jīng)過石蠟分隔開 2利用Taq酶的單克隆抗體抑制其活性。2. Touchdown 先在高于退火溫度下進(jìn)展幾輪PCR循環(huán)，然后再在 退火溫度下進(jìn)展大量擴(kuò)增。3. Nested PCR 先在要擴(kuò)增片斷的外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)展PCR，然后以此

5、PCR產(chǎn)物為模板，再在內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增出我們所要的目的片斷。.二 PCR的運(yùn)用一未知DNA片斷的克隆 1，基因組DNA步移法 1 2 3 4 5知DNA序列接頭接頭PCR.2，Inverse PCR限制酶切點(diǎn)X限制酶切點(diǎn)X知序列限制酶X酶切銜接引物2引物1PCR.(二利用PCR對(duì)基因功能進(jìn)展 分析和改造. (三 基因拼接.四In vitro evolution of gene- coding protein.DNA Shuffle根本過程1Preparation of genes to be shuffled2Fragmentation with DNase I3Reassembly by

6、 thermocycling in the presence of a DNA polymerase4Amplification of reassembled products by a conventional PCR.怎樣提高高保真的重組體1在步驟2運(yùn)用Mn2+而不是Mg2+2在PCR步驟運(yùn)用高保真的耐熱DNA聚合酶.PCR Random Mutagenesis1提高PCR反響體系中Mn2+的濃度可到640uM2在堅(jiān)持Mn2+濃度的根底上，升高dGTP濃度可進(jìn)一步提高突變率.怎樣獲得理想的突變率 每1000bp含2-6個(gè)突變堿基是理想的突變率1選擇緩沖液.2突變偏向mutational bias)評(píng)價(jià)方法：1transition/transversion Transition： 嘌呤突變?yōu)猷堰剩奏ね蛔優(yōu)猷奏?Transversion: 嘌呤突變?yōu)猷奏?2A或T轉(zhuǎn)變?yōu)镚或C的程度，或者是反過來 AT GC/GC AT. 五基因表達(dá)及其調(diào)控的分析.1. RT-PCR方法根本步驟：AAAAmRNA分別mRNA反轉(zhuǎn)錄酶和基因特異引物AAAAmRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR第一輪PCR合成雙