綠色熒光蛋白GFP基因的克隆及表達(dá)

1、-PAGE . z.分子生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)論文題 目:綠色熒光蛋白(GFP)的基因克隆及表達(dá)中國2010年12月 綠色熒光蛋白GFP基因的克隆與表達(dá)胡麗丹師學(xué)院生命科學(xué)院0803班 43500摘要：綠色熒光蛋白GFP是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體的生物發(fā)光蛋白。用堿裂解法提取的的質(zhì)粒pEGFP-N3和pET-28經(jīng)過BamHI和Not I雙酶切連接后，得到pET-28-pEGFP-N3重組質(zhì)粒。取局部的重組質(zhì)粒做酶切實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證重組質(zhì)粒的存在性，剩下的重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌E. coLiBL-21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。重組有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1L/mL的卡納霉素

2、的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。當(dāng)A600到達(dá)0.7時，用終濃度為0.8mM的異丙基硫代-D-半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時，離心得到下層綠藍(lán)色沉淀物即可。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白 GFP 基因的克隆 熒光蛋白 水母CLoning and E*pression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight,College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent prote

3、inGFP,one kind of bioluminenscent proteins ,has been found e*isting in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process e*traction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids w

4、ithBamHIand Not I,the rebinant plasmid,namely pET-28-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis.Taking slight rebinant plasmid proves that rebinant plasmid does e*ist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The rebinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21th

5、e petent cells. E. coLi BL-21containing rebinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 L/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL -D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key wo

6、rds:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 目錄TOC o 1-3 h z uHYPERLINK l _Toc2800485551.前言： PAGEREF _Toc280048555 h 1HYPERLINK l _Toc2800485561.1綠色熒光蛋白green fluorescent protein，GFP PAGEREF _Toc280048556 h 1HYPERLINK l _Toc2800485571.1.1 GFP研究背景 PAGEREF _Toc280048557 h 1HYPERLI

7、NK l _Toc2800485581.1.2 GFP研究應(yīng)用 PAGEREF _Toc280048558 h 2HYPERLINK l _Toc2800485591.2基因的克隆與表達(dá) PAGEREF _Toc280048559 h 3HYPERLINK l _Toc2800485602.實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)儀器： PAGEREF _Toc280048560 h 5HYPERLINK l _Toc2800485612.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料： PAGEREF _Toc280048561 h 6HYPERLINK l _Toc2800485622.2實(shí)驗(yàn)儀器： PAGEREF _Toc280048562

8、h 7HYPERLINK l _Toc2800485633.實(shí)驗(yàn)方法 PAGEREF _Toc280048563 h 7HYPERLINK l _Toc2800485643.1質(zhì)粒提取方法: PAGEREF _Toc280048564 h 7HYPERLINK l _Toc2800485653.2瓊脂糖凝膠電泳及回收: PAGEREF _Toc280048565 h 9HYPERLINK l _Toc2800485663.3酶切及連接： PAGEREF _Toc280048566 h 11HYPERLINK l _Toc2800485673.4E. coLi DH5或E. coLi BL21感

9、受態(tài)制備及轉(zhuǎn)入： PAGEREF _Toc280048567 h 12HYPERLINK l _Toc2800485683.5酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒： PAGEREF _Toc280048568 h 13HYPERLINK l _Toc2800485693.6GFP基因的表達(dá) PAGEREF _Toc280048569 h 14HYPERLINK l _Toc2800485703.6.1活化菌種 PAGEREF _Toc280048570 h 14HYPERLINK l _Toc2800485713.6.2擴(kuò)大培養(yǎng) PAGEREF _Toc280048571 h 14HYPERLINK l _Toc

10、2800485723.6.3 IPTG誘導(dǎo)GFP基因的表達(dá) PAGEREF _Toc280048572 h 14HYPERLINK l _Toc2800485734.結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc280048573 h 14HYPERLINK l _Toc2800485744.1質(zhì)粒提取過程中現(xiàn)象與結(jié)果： PAGEREF _Toc280048574 h 14HYPERLINK l _Toc2800485754.2瓊脂糖凝膠電泳 PAGEREF _Toc280048575 h 15HYPERLINK l _Toc2800485764.3E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態(tài)

11、制備及轉(zhuǎn)入結(jié)果 ： PAGEREF _Toc280048576 h 16HYPERLINK l _Toc2800485774.4酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒 PAGEREF _Toc280048577 h 16HYPERLINK l _Toc2800485784.5 GFP基因的表達(dá)結(jié)果： PAGEREF _Toc280048578 h 17HYPERLINK l _Toc2800485815.討論： PAGEREF _Toc280048581 h 18HYPERLINK l _Toc2800485825.1提取質(zhì)粒出現(xiàn)圖六的原因是： PAGEREF _Toc280048582 h 18HYPERLINK

12、 l _Toc2800485835.2瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)圖七、圖八原因： PAGEREF _Toc280048583 h 18HYPERLINK l _Toc2800485845.3 E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)入出現(xiàn)圖九、十原因: PAGEREF _Toc280048584 h 19HYPERLINK l _Toc2800485855.4酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒出現(xiàn)圖十一原因：19HYPERLINK l _Toc2800485865.5 GFP基因的表達(dá)結(jié)果如圖十二、十三原因：19HYPERLINK l _Toc2800485876.參考文獻(xiàn)20-. z.前言：1.

13、1綠色熒光蛋白green fluorescent protein，GFP1.1.1 GFP研究背景綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時，GFP 發(fā)射綠色熒光1。日本科學(xué)家下村修 1962年第一次從一種水母中發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白, 如圖一所示。這種蛋白在紫外線光中呈現(xiàn)綠色, 這種水母體含有一種生物發(fā)光蛋白質(zhì)aequorin，但它本身發(fā)藍(lán)光,通過對光譜的研究, 下村修提出了發(fā)光景水母所發(fā)的綠光是因激發(fā)的水母素向綠色熒光蛋白圖一：夜晚水母體內(nèi)GFP顯色4 Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night

14、4 發(fā)生的熒光能量轉(zhuǎn)移所致。即水母素作為一種能量供體, 而綠色熒光蛋白成為能量受體。水母素和綠色熒光蛋白都有重要的應(yīng)用, 但水母素是熒光酶的一種, 它需要有熒光素底物, 經(jīng)過酶促反響后發(fā)光。GFP能把這種光轉(zhuǎn)變成綠色，也就是當(dāng)水母容光煥發(fā)的時候我們實(shí)際看到的顏色。其在下呈綠色、 鎢絲下呈黃色、 紫外光下呈現(xiàn)強(qiáng)烈綠色2。1987年，道格拉斯普萊沙Douglas Prasher克隆出了GFP的基因序列。1993年，在普萊沙的根底上，馬丁沙爾菲Martin Chalfie成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物如大腸桿菌等也能產(chǎn)生GFP，這不僅證實(shí)了GFP與活體生物的相容性，還建立了利用GF

15、P研究基因表達(dá)的根本方法，而許多現(xiàn)代重大疾病都與基因表達(dá)的異常有關(guān)。至此，生物醫(yī)學(xué)研究的一場綠色革命揭開了序幕。此后，爾蓋路基亞諾夫Sergey A. Lukyanov又從一種珊瑚中別離出了與綠熒光蛋白類似，但能發(fā)出紅色光的熒光蛋白，預(yù)示著熒光蛋白可以有不同的顏色。美籍華人錢永健Roger Y. Tsien系統(tǒng)地研究了綠熒光蛋白的工作原理，。錢永健還對綠色熒光蛋白進(jìn)展了顏色突變。不同顏色可以同時在同一個細(xì)胞或組織標(biāo)記多種蛋白或構(gòu)造。多種顏色的綠色熒光蛋白的出現(xiàn), 為研究蛋白之間的相互作用、蛋白分解等提供了無限的可能性?，F(xiàn)在世界各地實(shí)驗(yàn)室使用的 GFP , 都是經(jīng)過改造優(yōu)化了的, 而錢永健是這方

16、面的先驅(qū)和領(lǐng)先人物2。1996 年GFP 的晶體構(gòu)造被解出，蛋白質(zhì)中央是一個圓柱形水桶樣構(gòu)造，如圖二. 長420 nm，寬240 nm，由11 個圍繞中心螺旋的反平行折疊組成，熒光基團(tuán)的形成就是從這個螺旋開場的，桶的頂部由3 個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔。發(fā)色團(tuán)是由其蛋白質(zhì)部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身環(huán)化和氧化形成2。-. z.-. z.圖二：GFP晶體構(gòu)造 圖三: 質(zhì)粒pEGFP-N35Figure2 Crystal structure of GFP Figure3 pEGFP-N352001年1月11日，美國科學(xué)家宣布

17、培育成世界上首只轉(zhuǎn)基因猴, 這是世界上首次培育成功轉(zhuǎn)基因靈長類動物. 添加在這只名為安迪的猴子體的就是這種標(biāo)志基因。1.1.2 GFP研究應(yīng)用在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們更多的是利用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體的標(biāo)記。將這種熒光分子通過化學(xué)方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的局部就變得可見了。生物學(xué)家一直利用這種標(biāo)記方法，把原本透明的細(xì)胞或細(xì)胞器從黑暗的顯微鏡視場中糾出來。但傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記在發(fā)光的同時，會產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)至被觀察的細(xì)胞死亡，這叫做光毒性。因此，在GFP發(fā)現(xiàn)以前，科學(xué)家們只能通過熒光標(biāo)記來研究死亡細(xì)胞靜態(tài)構(gòu)造。相反，綠色熒光蛋白對生物體無毒無害, 分子量小, 方

18、便構(gòu)建載體, 同時在多種非水母的生物體中均可穩(wěn)定表達(dá)并易于檢測, 所以, 作為一種生物分子標(biāo)記, 具有廣泛的應(yīng)用前景 3。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能, 是一種現(xiàn)成的熒光蛋白質(zhì)，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反響底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比較的。本實(shí)驗(yàn)是利用實(shí)驗(yàn)室提供的質(zhì)粒pEGFP-N3,其構(gòu)造如圖三所示.其上有所用酶的酶切位點(diǎn)。1.2基因的克隆與表達(dá)基因克隆分子克隆molecular cloning通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增形成大量子代分子的過程。如以下圖四所示:所需元件:限制性切酶

19、:BamH I和Not IBamH I的切點(diǎn)為：5-GGACC-3 Not I的切點(diǎn)為 5-GCGGCCGC-33-CCTAGG-5 3-CGCCGGCG-5載體: E. coLi DH5a1.易于接納外源DNA。 2.無特異的源性核酸切酶 3.載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻 4.與質(zhì)粒有互補(bǔ)性)受體細(xì)胞: E. coLi BL-211.易于接納外源DNA。 2.無特異的源性核酸切酶 3.載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻 4.與載體有互補(bǔ)性目的基因:pEGFP-N3選擇標(biāo)記基因：pET-28同時含有抗kana的基因有助于后面選擇，和-半乳糖苷酶基因可被異丙基硫代-D-半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的基因GFP連接：平末

20、端連接一樣酶切產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，再通過堿基互補(bǔ)配對連接圖四：基因克隆的過程Figure4 Process of gene cloning原核基因表達(dá)系統(tǒng)Gene E*pression： 由于目前對原核生物基因構(gòu)造了解的要透徹一些，所以一般將目的基因?qū)氲皆松镏?。將外源基因引入原核?xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。如圖五所示。為提高GFP表達(dá)的效率，我們一般可從以下三個方面考慮：1.基因水平上:盡量選用受體細(xì)菌細(xì)胞的偏愛性密碼子62.載體水平上:通過核外質(zhì)粒構(gòu)建適宜的操縱子、增強(qiáng)子6,如本實(shí)驗(yàn)的-半乳糖苷酶操縱子基因,故通過異丙基硫代-D-半乳糖苷IPT

21、G誘導(dǎo)表達(dá)目的基因GFP表達(dá)3.作為受體細(xì)胞上:根據(jù)DH5a和E. coLi BL-21構(gòu)造特點(diǎn)不同,前者對外援質(zhì)粒擴(kuò)增阻礙作用很小,故作為克隆菌;后者易于外源基因表達(dá),應(yīng)選用表達(dá)菌。圖五：基因克隆與表達(dá)Figure5 Gene cloning & e*pression本實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用已學(xué)過的分子知識和查閱一些參考文獻(xiàn)，來設(shè)計教師給定的實(shí)驗(yàn)課題。第一，是學(xué)習(xí)運(yùn)用科學(xué)理論知識指導(dǎo)設(shè)計實(shí)驗(yàn)使用方法；第二，學(xué)習(xí)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作；第三，查閱文獻(xiàn)了解并學(xué)習(xí)了綠色熒光蛋白基因GFP相關(guān)特性和研究進(jìn)展，穩(wěn)固理論知識的同時也開拓了我們的視野。本實(shí)驗(yàn)我們做了以下工作：將綠色熒光蛋白基因GFP插入pET-28構(gòu)建p

22、ET-28- pEGFP-N3重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coLi DH5擴(kuò)增，用堿法提取質(zhì)粒。核酸電泳檢測質(zhì)粒是否成功導(dǎo)入大腸桿菌，再酶切鑒定所提取質(zhì)粒是否為重組質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒導(dǎo)入E. coLi BL-21感受態(tài)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光蛋白Green fluorescent protein,GFP 。本試驗(yàn)通過做實(shí)驗(yàn)過程中，王教師細(xì)心地指導(dǎo)及斧正以及同組同學(xué)的協(xié)商配合，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果大抵讓人滿意。在表達(dá)菌E. coLi BL-21中表達(dá)了我們期望的結(jié)果綠色熒光蛋白Green fluorescent protein,GFP 。但此試驗(yàn)在LB培養(yǎng)基平板上生長效果不是很好，酶

23、切效果也不是那樣完美，在以后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計中要進(jìn)一步完善這兩局部的工作。2.實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)儀器：2.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料：1.克隆菌株EcoLi DH5(8311實(shí)驗(yàn)室提供)2.表達(dá)菌株EcoLi BL21(8311實(shí)驗(yàn)室提供)3.LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉，溶于950 mL中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，補(bǔ)加蒸餾水至總體積為1 L，分裝后高壓蒸汽滅菌。對于固體培養(yǎng)基參加10-15 g瓊脂粉后再加熱滅菌4.溶液: 50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCL(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0。1 M Tris-HCL(pH 8.012.5 mL，

24、0.5 M EDTApH 8.010 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 Lbf/in2高壓滅菌15 min ，貯存于4 。5.溶液：0.2 M NaOH，1% SDS。2 M NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL。使用前臨時配置。6.溶液：醋酸鉀KAc緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4 保存?zhèn)溆谩?.TE：10mM Tris-HCL(pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)。1 M Tris-HCLpH 8.01 mL，0.5 M EDTApH 8.00

25、.2 mL，加ddH2O至100 mL。15 Lbf/in2高壓濕熱滅菌20 min，4 保存?zhèn)溆谩?.氯仿1:19.乙醇無水乙醇、70%乙醇10.50TAE：Tris 堿54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na22H2O 4.65 g，加ddH2O 至1000 mL。15 Lbf/in2高壓濕熱滅菌20 min，4 保存?zhèn)溆谩?1.溴化乙錠EB：10 mg/mL12.RNase ARNA酶A：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10 mg/mL，TE配制，沸水加熱15 min，分裝后貯存于-20。13. 6Loading buffer上樣緩沖液：0.25% 溴酚藍(lán)，0.2

26、5% 二甲苯青FF，40%W/V蔗糖水溶液。14.0.8% 瓊脂糖凝膠：稱取0.4 g瓊脂糖于三角燒瓶中，加50 mL 1TAE，電熱套加熱至完全溶化，冷卻至60 左右，輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30 min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中電泳緩沖液1TAE，即可上樣。15.雙酶切體系：DNA sampLe 8 L, BamHI 0.5mL寶生物公司提供, Not I 0.5mL寶生物公司提供,BufferH 2 mL,Trio*-100(0.1%) 1uL,BSA(0.1%) 1 L, ddH2O 6 L16.10Buffer H：100 mM Tris-H

27、CL PH7.5,100 mM MgCL2,10 mM Dithiothreiol500 mM NaCL17.0.1 M CacL218.IPTG，kana固體粉末2.2實(shí)驗(yàn)儀器：ORION pH計公司,HD-3紫外檢測儀日本GL-2M型冷凍離心機(jī)星科儀器雪山制冰機(jī)長洋科學(xué)儀器公司超純水機(jī)AYJ1-0501-U頤洋企業(yè)開展電泳儀DYY-5市六一儀器廠電子天平TE412-L，TE2101-L，CP64德國Satorins公司BS-1E振蕩培養(yǎng)箱(省金壇市億通電子儀器廠)高壓滅菌鍋Y*Q-LS-50S博迅，手持式紫外燈雙面紫外超凈工作臺凈化設(shè)備,電熱套3.實(shí)驗(yàn)方法3.1質(zhì)粒提取方法:方法分別有以下

28、幾種：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)展處理及用加熱處理。所有別離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個根本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；別離質(zhì)粒DNA(有時還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。對于本實(shí)驗(yàn)要求提出大量的質(zhì)粒，且為使操作簡便應(yīng)選用SDS堿裂解法。其根本原理：1當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)參加中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白

29、質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。2在一定電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型(相對分子質(zhì)量不同的DNA片段泳動速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因此，凝膠電泳不僅可別離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以別離相對分子質(zhì)量一樣，但構(gòu)型不同的DNA分子：其中超螺旋構(gòu)造泳動最快，其次為線性構(gòu)造，最慢的可能是復(fù)制中間體沒有復(fù)制完的兩個質(zhì)粒連在一起，而不是開環(huán)構(gòu)造用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)展瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣其具體操作步驟如下：1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接

30、種于20 mL LB含Kana1L /mL液體培養(yǎng)基中，37 、200rmp振蕩培養(yǎng)過夜約14h。2. 取1.5mL培養(yǎng)液倒入1.5 mL eppendorf管中，10000rmp離心1min。棄上清，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體盡可能流盡。3、菌體沉淀重懸浮于200 L溶液中, (需劇烈振蕩，使菌體分散混勻。)室溫下放置3 min。4、參加新配制的溶液300 L，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻容物(千萬不要振蕩)，冰浴3 min。5、參加200 L預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3min。 12000rmp離心3min。溶液為

31、中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。6、上清液500 L移入干凈eppendorf管中，參加等體積的酚/氯仿，振蕩混勻, 12000rmp離心10min。500 L的苯酚/氯仿/異戊醇。7、小心移出上清于一新微量離心管中，參加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心10000rmp2min。8、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，參加1mL 70乙醇洗沉淀一次，10000rmp離心10 min。9、 吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫枯燥。10、將沉淀溶于20 L TE緩沖液(pH

32、8.0儲于-20冰箱中。)3.2瓊脂糖凝膠電泳及回收:實(shí)驗(yàn)原理：瓊脂糖凝膠電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂別離制備的鏈狀多糖。其構(gòu)造單元是d-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素主要有：1DNA分子的大小 雙鏈DNA分子在凝膠基質(zhì)中遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)成反比。分子越大，遷移的越慢，因?yàn)槟Σ磷枇υ酱?，也因?yàn)榇蠓肿油ㄟ^凝膠孔徑的效率低于較小的分子。2瓊脂糖濃度 給定大小的線狀DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。在DNA電泳遷移速率的對數(shù)和凝膠濃度之間存在線性相關(guān)

33、。3DNA的構(gòu)象 超螺旋環(huán)狀型、切口環(huán)狀型和線狀型DNA在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。其相對遷移速率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，其次是電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度和型超螺旋絞緊的程度或密度。一些條件下，型DNA比型遷移得快；在另一些條件下，順序可能相反。4所用的電壓 低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強(qiáng)度升高時，高分子量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以，當(dāng)電壓增大時瓊脂糖凝膠別離的有效圍反而減小。要獲得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用電壓不應(yīng)高于5-8V/cm。5電泳緩沖液 DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子則電導(dǎo)率降低，DNA或者不動或者遷移

34、很慢。高離子強(qiáng)度時如10buffer，電導(dǎo)率升高，使得應(yīng)用適中的電壓也會產(chǎn)生大量的熱能，最嚴(yán)重時凝膠會熔化，DNA變性。具體操作步驟：1.0.8%瓊脂糖凝膠的配制：準(zhǔn)確稱取0.4 g瓊脂糖加到三角瓶中，加50 mL 1TAE緩沖液于三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，冷卻至60 左右，用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；輕輕旋轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；室溫下45分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽；向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；在DNA樣品中參加10體積的載樣緩

35、沖液Loading buffer，混勻后，用槍將樣品混合液緩慢參加被浸沒的凝膠加樣孔；接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般100V電壓，電泳40min即可；根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 同原質(zhì)粒一起瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收片段。根據(jù)亮度可以估計回收的量。待回收的DNA段經(jīng)電泳別離后，從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA段，放在1.5 mL EP管中；參加3 倍請準(zhǔn)確估量凝膠的體積體積的溶膠液以100 L 體積膠參加300 L溶膠

36、液為一次標(biāo)準(zhǔn)反響，室溫下放置5分鐘或50 保溫3分鐘，其間輕搖EP管幾次使膠完全融化；參加10 L玻璃奶玻璃奶使用前請充分搖勻，顛倒混勻，冰浴下放置10分鐘。每隔23分鐘混勻一次，12000rpm離心30秒，吸棄上清；加250 L漂洗液濃縮漂洗液使用前，按濃縮漂洗液：無水乙醇= 3：7配制成工作濃度，用加樣器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻，12000rpm離心30 秒，吸棄上清；重復(fù)步驟4盡量吸盡漂洗液。吸取完漂洗液后再離心10秒鐘，用Tip頭將最后一點(diǎn)兒漂洗液吸干凈。然后，放置于37烘箱枯燥直至沉淀呈白色，約1520分鐘；加適量洗脫緩沖液即無菌水20 L為一次標(biāo)準(zhǔn)反響，混勻，60 水浴5

37、分鐘，12000rpm離心1分鐘，回收上清備用。重復(fù)步驟6，能提高回收率。3.3酶切及連接：實(shí)驗(yàn)原理：迄今已發(fā)現(xiàn)了3000多種限制性切酶。傳統(tǒng)上將限制性切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點(diǎn)、輔助因子等因素劃分為三大類。II型酶在其識別位點(diǎn)之中或臨近確實(shí)定位點(diǎn)特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段，因此是三類限制性切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I這樣在識別序列中進(jìn)展切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要局部。大局部這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的

38、是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列如EcoR I識別GAATTC；Hind III識別AAGCTT;Bam HI識別GGATCC; Not I識別GCGGCCGC；而另一些識別不連續(xù)的序列如BgL I識別GCNNNNGGC。限制性切酶酶切DNA后形成兩種類型的末端：(i)兩條鏈斷裂的位置是交織地，產(chǎn)生粘性末端，如EcoR I酶切后產(chǎn)生末端；(ii)兩條鏈的斷裂位置處在一個對稱構(gòu)造5-GGCC-33-CCGG-5。的中心，產(chǎn)生平末端，如Hae III酶切后產(chǎn)生Ligase5353DNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在

39、一條DNA鏈的3-末端具有一個游離的羥基-OH，和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個磷酸基團(tuán)-P。 反響體系選平衡液，依據(jù)查閱切酶供給商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表，如果有一種buffer能同時使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反響buffer。對于本實(shí)驗(yàn)所用的酶為BamHI和Not I在bufferH均有最高酶活性。 具體操作步驟：按如下雙酶切體系30 L混合 ：反響物L(fēng)pEGFP-N3 pET-28a質(zhì)粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10bufferH3 3 0.1%BSA緩沖液 3 3 1.離心10s，混勻。2

40、.37水浴酶切3h。3.配制1.0%M/V普通瓊脂糖凝膠30mL。4.適當(dāng)放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5.待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6.酶切樣品中參加5 L溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻，上樣。7.在1TAE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min8.回收連接好的目的基因，依次參加5 L回收純化的pET-28a質(zhì)粒,GFP基因片段12 L，T4連接酶1L，緩沖液102 L3.4E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)入：實(shí)驗(yàn)原理:感受態(tài)就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)，只有開展為感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定攝取外來的DNA分子。受體細(xì)胞經(jīng)過

41、一些特殊方法如：電擊法，CaCL2等化學(xué)試劑法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許帶有外源DNA的載體分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCL2 法，簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可參加占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCL2法為使用更廣泛。將正在生長的大腸桿菌細(xì)胞在0下參加到低滲的CaCL2溶液中，便會使細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時的細(xì)胞即呈現(xiàn)為感受態(tài)。這一方法可以用于批量制備感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化效率可到達(dá)5106-2107個轉(zhuǎn)化克隆子/g超螺旋質(zhì)粒DNA。制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞可在-70凍存。在

42、0下外源DNA可吸附到感受態(tài)細(xì)胞外表，短時間的熱刺激42，90s誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA。 轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌隨后在培養(yǎng)基中37培養(yǎng)1h，可使質(zhì)粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌細(xì)胞可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長，而沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法生長。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟：用槍頭挑一大腸桿菌E.coLi DH5或BL21單菌落放入2 mL LB液體培養(yǎng)基含Kana 1 L/mL，37 培養(yǎng)過夜?；罨竽c桿菌：取4mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基參加80 L的過夜菌，培養(yǎng)3個小時。將昨夜搖出來的E.coLi DH5或BL21培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10min,然后于4 下

43、4000rpm離心5min。 棄去上清,用預(yù)冷的0.1mol/L 的CaCL2溶液600L輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20 min, 4下4000rpm離心5min。 棄去上清,參加300 L預(yù)冷的0.1mol/L的CaCL2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置5min,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液，可-80長期保存。6 取2個無菌離心管，分別參加100 LDH5感受態(tài)細(xì)胞懸液，第1管加5 L無菌水，第2管參加質(zhì)粒DNA溶液5 L,輕輕搖勻,冰上放置30min。7 42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 8 分別向管中參加400 L LB液體培養(yǎng)基,混勻后在37振蕩培養(yǎng)60min。 9 從管1中取1

44、00 L涂布于含抗生素,從管2中取100 L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)14小時。3.5酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒：原理：經(jīng)同種酶切后BamH I和Not I，重組質(zhì)粒從新被切開，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外分析儀下看其跑過的膠圖，進(jìn)展分析。實(shí)驗(yàn)步驟：按如下雙酶切體系20 L混合 ：提取E.coLi DH5中的重組質(zhì)粒，在以下體系下反響反響物L(fēng)pET-28-pEGFP-N3質(zhì)粒8BamH I500Not I50010bufferH20000.1%BSA緩沖液3Trio*-100(0.1%) 1BSA(0.1%) 1ddH2O6水浴2h后，經(jīng)過

45、瓊脂糖凝膠電泳。3.6GFP基因的表達(dá)3.6.1活化菌種用黃色槍頭蘸取表達(dá)菌E.coLi BL21種單菌落，連同槍頭一起垂直放入裝有2 mL的LB液體培養(yǎng)基的試管含有卡那青霉素，其工作濃度為1L /mL中。于37 搖床振蕩培養(yǎng)14小時。3.6.2擴(kuò)大培養(yǎng)將試管中活化的80L菌液接種到4 mL LB培養(yǎng)基，同時參加卡那青霉素終濃度1L /mL培養(yǎng)基于37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時。3.6.3 IPTG誘導(dǎo)GFP基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中在不同的培養(yǎng)時間用OD值表征菌體密度參加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD=0.8時，加的 IPTG至終濃度為0.8mM時GFP的表達(dá)量到達(dá)最大4.結(jié)果與分析4.1質(zhì)粒提取過程中現(xiàn)

46、象與結(jié)果：階段溶 液I溶 液溶 液:氯 仿現(xiàn) 象EP管中溶液為混濁液。EP管中出現(xiàn)上層變澄清，下層沉淀EP管中溶液溶液有絮狀物產(chǎn)生參加氯仿離心后溶液分層圖表六 3- SEQ 圖表一 * ARABIC 1堿法提質(zhì)粒過程中的現(xiàn)象Figure6 sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process e*traction結(jié)果分析:參加溶液的作用是維持細(xì)胞滲透壓，使細(xì)胞懸浮在溶液中，故呈現(xiàn)渾濁；參加溶液作用使細(xì)胞裂解，釋放涵物，含物溶于溶液，故上層變澄清；參加溶液作用是時變性的質(zhì)粒在酸鹽環(huán)境下從新復(fù)性，但大量基因組DNA不能復(fù)性，在PDS作用下產(chǎn)生絮狀沉淀。參加氯仿破壞

47、了蛋白質(zhì)，使其變性沉淀。4.2瓊脂糖凝膠電泳如圖七所示電泳結(jié)果圖可以看到，第一孔道和第九孔道跑的帶在紫外分析儀下,明顯跑帶量少,效果不如其余七條帶。中間幾條帶總共出現(xiàn)五條帶如圖八，條帶1 最為明亮，說明第一條帶出所含的核酸物質(zhì)最多。大腸桿菌中RNA的拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，而核酸電泳分析過程的實(shí)驗(yàn)操作過程中沒有參加RNase降解所制樣品中含有較多的RNA，所以判斷該條帶一定為RNA。提取的質(zhì)粒多數(shù)以超螺旋型存在，超螺旋的質(zhì)粒DNA中一個螺旋由10個堿基組成，當(dāng)分子上有一個缺刻時，分子會立即松弛，形成開環(huán)分子。如果質(zhì)粒的雙鏈配對處都斷裂則形成線性質(zhì)粒。分子量一樣的情況下，可以判定：條帶2

48、為超螺旋DNA，條帶3為線性DNA，條帶4為開環(huán)DNA，條帶5可能為線性DNA，超螺旋DNA，開環(huán)DNA中的兩者或是三者纏在一起未得到別離。-. z.圖七：瓊脂糖凝膠電泳九條孔道電泳Figure7 All channels in Agarose Gel El ectrophoresis圖八：瓊脂糖凝膠電泳中間七條孔道電泳圖Figure8 Seven channels amid Agarose Gel Electrophoresis-PAGE . z.4.3E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)入結(jié)果 ：管1中取100 L無菌水涂布于含抗生素LB平板結(jié)果如圖九為：LB平板

49、未生長任何菌落;管2中取100 L重組質(zhì)粒涂布于含抗生素的平板上結(jié)果如圖十為：生長少量菌落;分析：管1做空白對照，說明在含抗生素的培養(yǎng)基上無法生存任何自然條件菌落；管2實(shí)驗(yàn)組，說明重組質(zhì)粒能表達(dá)*種蛋白物質(zhì)，使重組均在此環(huán)境能生存。-. z.圖九：空白對照管 SEQ 圖十：空白對照 * ARABIC 1Figure9 Negative contrast 圖十：實(shí)驗(yàn)組管2Figure 10 E*perimental group-PAGE . z.4.4酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒如圖十一所示所有孔道，其中第七八孔道是濃度不同的Maker蛋白。其余九條孔道為實(shí)驗(yàn)酶切的帶。兩條Maker蛋白明顯可見六條帶，而實(shí)

50、驗(yàn)組的帶型都很模糊。pEGFP-N3的分子量為4700bp,而pET-28a分子量為5369 bp，故在一樣的構(gòu)型下，pEGFP-N3應(yīng)比pET-28a跑的快一些。圖中所示的六條帶，有上述原理可以判斷為：條帶1 pEGFP-N3超螺旋DNA，條帶6pET-28開環(huán)DNA，剩下帶2、3、4、5難以準(zhǔn)確判斷，但線性pEGFP-N3肯定在環(huán)形 pEGFP-N3之前，超螺旋pET-28也肯定在線性pET-28之前的。圖十一：酶切驗(yàn)證質(zhì)粒Figure11 Validate plasmid via enzyme-cutting4.5 GFP基因的表達(dá)結(jié)果：參加IPTG誘導(dǎo)后，可觀察到菌體細(xì)胞呈現(xiàn)綠色如圖十

51、二所示，說明目的基因在表達(dá)菌E. coLi BL21中表達(dá)。如圖十三所示在紫外光下可以觀察到菌體細(xì)胞發(fā)綠色熒光。-PAGE . z.圖十二：GFP基因在表達(dá)菌表達(dá)Figure12 GFP gene e*pression inE. coLi BL21圖十三：GFP在紫外光照射下Figure13 GFP e*hibites green fluorescentunder ultraviolet light-PAGE . z.5.討論：5.1提取質(zhì)粒出現(xiàn)圖六的原因是：參加溶液的作用是制備菌懸液，參加葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部，所以觀察到得溶液呈乳白渾濁狀；參加溶液的作用是

52、使細(xì)胞破裂，蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁沉淀，質(zhì)粒溶出，NaOH是最正確的溶解細(xì)胞的試劑，它使細(xì)胞膜發(fā)生了從biLayer雙層膜構(gòu)造向miceLLe微囊構(gòu)造的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解，因此觀察到有大量白色絮狀沉淀；參加溶液的作用是使大腸桿菌基因組DNA沉淀，SDS遇到鉀離子后變成PDS，而PDS是水不溶的，基因組DNA較長因此發(fā)生了沉淀，因此觀察溶液較為澄清；氯仿為有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)一步除去初提質(zhì)粒中的蛋白質(zhì)沉淀，氯仿不溶于水，所以觀察到分層現(xiàn)象5.2瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)圖七、圖八原因：核酸電泳圖譜中凝膠的最前端條帶較亮，說明該處有較多的核酸物質(zhì)，而在質(zhì)粒提取分析過程的實(shí)驗(yàn)操作過程中沒有參加RNase降解所制樣品中含有較多的RNA由E. coLi DH5a轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，所以判斷該條帶一定為RNA，但是由于電泳的時間不夠，導(dǎo)致不同大小的RNA未分開。第一孔道和第九孔道條帶沒有其他孔道的核酸物質(zhì)得多，條帶不明顯。分析可能的原因是，第一孔道最先上樣，而總共有九個道操作時間過長導(dǎo)致開場電泳時孔道中的樣品已經(jīng)發(fā)生擴(kuò)散，所以導(dǎo)致電泳時條帶不明顯，而第九孔道上樣是樣品還未來得及在重力作用下進(jìn)入孔道，電源就一接通，致使局部質(zhì)粒樣品在緩沖液分子的作用下，擴(kuò)散到緩沖液中，所以導(dǎo)致電泳時條帶不明顯第一孔道由于樣品時間放置過長后擴(kuò)散，僅僅觀察1條帶，