《基因工程》課件第二章 基因工程工具酶

1、第二章 分子克隆工具酶及其應(yīng)用分子克隆工具酶及其應(yīng)用限制性內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸連接酶用于DNA和RNA的連接 核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾 其它酶類-用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。第一節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶 一 . 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 1.細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) Werner Arber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)，1968年分離到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的發(fā)現(xiàn) HOSmith 和Wilox 于1970年首次從流感嗜血桿菌（

2、H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindII限制酶。 3. SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制 D. Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。 寄主的限制與修飾現(xiàn)象限制(restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。限制作用:實際就是限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。二 . 限制修飾系統(tǒng)的種類1.I型：由三個基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specif

3、icity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在. coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.III型：修飾酶與型酶相同，hsd與hsd基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。 上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。 限制性核酸內(nèi)切酶的分類據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型三類。主要特性型型型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識別序列切割位點多功能異源三聚體ATP Mg2+ SAM距識別序列1kb處隨機(jī)性切割單

4、功能同源三聚體Mg2+ 4-6bp回文序列識別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能異源二聚體ATP Mg2+距識別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割 三. 限制性內(nèi)切酶的定義、命名 1. 定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：Hind前三個字母來自于菌種名稱H. influenzae，“”表示菌系為型血清型；“”表示分離到的第三個限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I

5、 ()四限制酶的特點 1. 識別順序和酶切位點 ）識別-8個相連的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外側(cè)，產(chǎn)生-端突起 ）富含 ）對稱性雙對稱 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 ）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外 ）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是-和- 2.末端種類 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 P

6、st I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5 ）平齊末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互補(bǔ)的粘性末端 ）切點在識別順序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ）能識別簡并順序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG

7、-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG ）相容性末端如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識別和酶切，但BamHI和BglII的識別機(jī)率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 不同末端的連接特性: 除第4種末端不能進(jìn)行不同DNA分子

8、或同種DNA分子不同切點產(chǎn)生的末端相連外，其余4種末端可以相互連接。五. 異源同序酶（isoschizomer，同裂酶） 1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶 2. 特點：1）識別相同順序 2）切割位點的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 限制酶的星反應(yīng)（star activity） 1.特點: 限制酶識別序列特異性降低 2.發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件（見下頁） 3.星反應(yīng)的利用和避免1.限制性核酸內(nèi)切酶的星活性(star activity)在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識別序

9、列相似的序列,降低酶切反應(yīng)的特異性,這種改變的特殊性稱為限制性核酸內(nèi)切酶的星活性。產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識別位點，還可以切斷非特異性的位點。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。 2.星活性產(chǎn)生的原因如下： 反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。 酶用量過大，大于100U/微克DNA。 低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙 酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價離子的存在。常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 表1 具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條

10、件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識別序列AvaI 1, 2, 4BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCCBstI 2, 4BsuI 2, 4, 6EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTNHae 2, 4HhaI 2, 4, 7Hind 6HpaI 1, 2, 4PstI 1, 2, 4, 7Pvu 2, 4SalI 1, 2, 4, 7ScaI 4 - 6, 8 Sst 2, 4XbaI 2, 4, 7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)； 5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亞砜(8%)

11、; 8:無NaCl。 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度 DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1g DNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤引入甲基，受其影響的酶有Bcl I Mbol 等，但BamHI、BglII、Sau3A I不受影響。大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影響。采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來

12、制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。 酶切反應(yīng)的溫度多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37，如SmaI為25或30 ，SfiI為50 。反應(yīng)溫度過度或過低都會影響酶活性，甚至導(dǎo)致酶失活。DNA分子結(jié)構(gòu) 某些酶切割超螺旋質(zhì)粒DNA時，酶量比切割線性DNA時高出多倍，可高達(dá)20倍。 核酸內(nèi)切酶的緩沖液 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性”現(xiàn)象。限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時應(yīng)使用新的吸頭去取酶，加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時將會抑制酶的活性。整個操作

13、應(yīng)在0進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。當(dāng)切割大量DNA時，通常采用延長反應(yīng)時間，減少酶的用量。當(dāng)DNA需2種或以上酶切時，應(yīng)用通用緩沖液，若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個酶切反應(yīng)。 七. 其它特異性的內(nèi)切酶及其用途 1. 末端酶（ terminase）： 5-GGGCGGCGACCTN-3 N-5，出現(xiàn)的頻率約412 分子量為 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000） 2. Omega核酸酶（I-SceI）： 由內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418 = 6.9 X 1010 bp，其識別

14、順序為 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 3. I-PpoI：來自于Physarum polycephalum 識別序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT 4. 用途 遺傳標(biāo)記， 構(gòu)建載體八. 限制酶的用途 1. DNA重組 2. 限制酶（物理）圖譜繪制 3. 突變分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點 1. 具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。 2. 酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1- 20nt。 3. 酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。 4. 產(chǎn)生粘性末端可以是1-5個核苷酸

15、。 5. 均為單體，分子量為47108 kD。 第二節(jié) DNA 甲 基 化 酶 一. 甲基化酶的種類與識別順序 1. 限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶 三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤： 在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同 2. Ecoli 的dam、dcm甲基化酶 這類甲基化酶與限制酶無關(guān)，不構(gòu)成相應(yīng)的限

16、制修飾系統(tǒng)。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG 3. 哺乳動物的甲基化酶 該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過程有關(guān)。 4. Ecoli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）二. 甲基化酶活性對限制酶活性的影響 1. dcm 和dam甲基化酶對限制酶的影響 1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識別順序是完全重疊還是邊界重疊 如：完全重疊 BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG) 邊界重疊 ClaI-dam； Sau96I-dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管兩

17、者的識別順序為何種重疊 如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcmBstNI表2 對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶限制酶 識別序列* 甲基化酶Ava GG(A/T)CC(A/T)GG dcmBcl TGATCA dam Cla GATCGAT dam EcoR CC(A/T)GG dcmHph GGTGATC damMbo GATC damNru GATCGCGA damSau96 GGNCC(A/T)GG dcmSauF CC(A/T)GG dcmStu AGGCCTGG dcmTag GATCGA damXba TCTAGATC dam *下橫線字母表示限制酶識別序列,

18、 綠色字母表示dam甲基化酶識別序列,紅色字母表示dcm甲基化酶識別序列2. II型甲基化酶對限制酶活性的影響 ） 抑制同種限制酶的活性 M.BamHI GGATmCCBamHI(GGATCC)M.EcoRI GAmATTCEcoRI(GAATTC) ） 抑制不同種限制酶的活性 a. 順序完全重疊 如：M. ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA） b. 順序邊界重疊 如：M. BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG） ） 抑制不同種限制酶的部分活性 MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3.

19、 甲基化酶的用途 ） 改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成 ） 在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切表3 甲基化酶與識別序列甲基化酶 識別序列a 受甲基化影響的限制酶b M.Alu AGmCT Alu, BamH, Bsp1286 Dde,HgiA, Nhe, Pst M.BamH GGATmCC BamH, Msp M.Cla ATCGmAT Cla, Mbo, Taq dam GmATC c dcm CCA/TGG c M.EcoR GAmATTC EcoR M.HId GCNGC GGmCC Mst, Pst, Pvu M.Hae GGmCC Ban

20、,Bgl,Bsp1286,BstX,Hae, Msp,Nae,Nco,Sac, Sau96 M.Hha GmCGC Aha, FnuD, Hha M.Hpa CmCGG Aha,Ava,Ava,Hpa,ScrF M.Hph TmCACC Hinf, Hph, Sau3A M.Msp mCCGG BamH, Msp M.Pst CTGCmAG Alu, Pst M.Taq TCGmA AluI, Ava, EcoRV, HinC, Hinf, Mbo, Taq, Xmna.標(biāo)在堿基的左上角的m表示該堿基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.參見表2; d.M.HI分離自噬菌體污染的細(xì)菌

21、細(xì)胞，它可識別兩個序列，GCNGC的甲基化位點尚未確定。M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE第三節(jié)核 酸 酶 ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口, 缺口, 斷口缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P5一. 外切酶III（ExoIII） 1. 一般特點： 來自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反應(yīng)類型 1) 外切酶活性：3 5，產(chǎn)生5-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2) 核酸酶H活性：除去DN

22、A-RNA雜交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3) 3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH 6.8-7.4 4) 內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH 7.6-8.5 3.外切酶活性特點 1) 反應(yīng)底物：互補(bǔ)ds-DNA 2) 堿基釋放速度：CA-TG 3) 反應(yīng)產(chǎn)物：5-單磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，過度反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解 4.用途 1) 核酸（DNA）標(biāo)記 2) 基因突變-缺失 3) DNA序列測定時作順序缺失 5.使用注意事項 1) 正式使用前，測定在一定條件下酶的反應(yīng)速度 2) 在一定條件下，ExoIII不

23、能作用GC富集區(qū)(來自于cDNA加尾)5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b cExoIII用于順序缺失 ExoIII ExoIII -32P -32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于DNA標(biāo)記二. 外

24、切酶 1. 反應(yīng)特點 1) 作用底物: 要求5-PO4基; 不作用含切口的DNA分子 2) 作用方向與產(chǎn)物：5 3; 產(chǎn)生5-P核苷和3-突起的ds-DNA 2. 用途：DNA定序測定; 除去5-端突起，產(chǎn)生3-端突起，便于加尾3 HO 3 HO 3 HO OH 3 OH 3 OH 3 5 P 5 P 5 P P 5 P 5 P 5 AAAAAAAAAAAATdT+dATP 三. 核酸酶Bal31 1. 一般特點：胞外酶；具DNase和 RNase 活性；由“快”和“慢”兩種成分構(gòu)成 2. 催化反應(yīng)特點 1) 底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切與內(nèi)切活性) 2) 作用方向與產(chǎn)物：5

25、 3和3 5同時進(jìn)行，但反應(yīng)速度不同； 產(chǎn)生5-單磷酸核苷和縮短的ds-DNA 3.用途： 基因突變-缺失; 繪制限制酶譜; DNA定序(與ExoIII相同)，其優(yōu)點是Bal31酶活依賴于Ca+和Mg+，Ca+在反應(yīng)完畢后可用EGTA（乙二醇四乙酸）滅活而不影響Mg+濃度，后者是限制酶活性必需的 4.使用注意事項： 1) 應(yīng)作預(yù)備實驗，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同 2) DNA兩條鏈堿基組成不同，終止反應(yīng)時存在單鏈突起，需要補(bǔ)平5PP53HOOH3核酸酶Bal31的活性四. 核酸酶S1 1.一般特點：糖蛋白(含糖量8%)，最佳pH 4.5， 對熱穩(wěn)定，抗變性劑 2.催化反應(yīng)類型: ss

26、-DNA; ss-RNA; 雙螺旋變性區(qū) 3.用途 1) 基因突變-缺失，常與外切酶，如ExoIII、外切酶、Bal31連用 2) DNA定序分析 3) S1作圖法 4) 基因結(jié)構(gòu)分析 5) tRNA結(jié)構(gòu)分析 4.使用注意事項 1) 避免長時間反應(yīng)，因最適酸性pH將導(dǎo)致DNA斷裂或降解 2) 避免使用高濃度酶量，以免DNA被降解(因產(chǎn)生切口)ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶S1活性 五. 綠豆核酸酶 1.與S1酶相同點：作用于ss-DNA和RNA，對5-端的突起核苷酸作用速度為GCAT 2.與S1酶的不同點 最適pH接近中性，不會產(chǎn)生切口; 不

27、使具切口的ds-DNA斷裂 3. 用途：與S1酶相同 六. 外切酶 作用于ss-DNA的3- 與5-端，產(chǎn)物為低聚核苷酸 除去單鏈DNA形成平整末端 七. 牛脾磷酸二酯酶 作用含5-羥基端的ss-DNA和RNA，產(chǎn)生3-單磷酸核苷 用于短鏈RNA和 DNA的定序分析 八. 蛇毒磷酸二酯酶 作用3-羥基單、雙鏈DNA和RNA，產(chǎn)生5-單磷酸核苷 用于RNA和DNA的定序分析表4 幾種常用外切酶的特點 外切酶 作用方向 作用底物 反應(yīng)產(chǎn)物 ExoIII 35 dsDNA 單核苷酸 外切酶 53 ss和dsDNA 同上 Bal31 35和53 ss和dsDNA, RNA 同上 S1 35和53 ss

28、RNA和ss DNA 低、核苷酸 綠豆核酸酶 35和53 ssRNA和ss DNA 同上 Exo VII 35和53 ssDNA 低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 53 ssRNA，ss DNA 同上 蛇毒磷酸二酯酶 35 ss，ds RNA和DNA 同上 九. RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。RNase的識別序列和特點見表5。 1. RNase A分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100加熱15min仍具活性）, 用于除去DNA樣品中的RNA分子 2. 核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA 十

29、. RNase H 作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去DNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。 十一. DNase I 1. 特點：具內(nèi)切酶活性，作用于ds -DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活達(dá)最大值 當(dāng)酶濃度很低時，ds -DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg 2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關(guān)Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置 2. 用途 1) 切口移位，制備DNA探針 2) 制備RNA樣品時除去DNA分子 3) 基因突變時產(chǎn)

30、生切口 Mn+存在時 Mg+存在時 DNaseI作用特點DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI與Pol I 的切口移位Pol I第四節(jié) DNA 聚 合 酶 一 . E.coli DNA聚合酶I（polI） 1. E.coli 的DNA聚合酶系統(tǒng) Pol I 參與DNA修復(fù), 具35和53外切酶活性 pol II 同上 具35外切酶活性 pol III 參與DNA復(fù)制, 具35和53外切酶活性 2. E.coli polI的特點 1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦稱為Kl

31、enow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響（表6） 3） 外切酶活性 3. 用途 1） 除去3-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時） 2） 補(bǔ)齊5-突起端 3） 合成第二條cDNA 4） 切口移位制備探針 其中用途2) 和3)常用大片段表6 E.coli DNA PolI 的延續(xù)性 DNA模板-引物類型 反應(yīng)條件 延續(xù)性(堿基數(shù)) 切口 ColE1 37C, 低鹽 8 缺口 ColE1 37C, 低鹽 47 切口/缺口胸腺DNA 37C, 低鹽 24 poly d(AT) 37C, 低鹽 188 poly d(AT) 5C,

32、低鹽 14 poly d(AT) 5C, 高鹽 3Klenow酶的基本用途修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3隱性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列 二. T4 DNA聚合酶 1. 特點： 53聚合酶活性，1500 nt/min, 為pol I的兩倍 35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分別為40和 4000nt/min 2.用途： 制備高比活性探針(1010 cpm/gDNA); DNA末端修飾-缺失5CAGCAACGT 3 dATP CAGCAACGT 3 S1 T 33GTCGTTGCA 5T4聚合酶 A 5 A 5

33、外切酶活性 聚合酶活性 無dNTP dNTP三.反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)反轉(zhuǎn)錄酶具有53的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈,同時又具有3 5和5 3的RNA外切核酸酶活性。AMV（鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒）和MLV（鼠白血病病毒）。雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈四. Taq DNA聚合酶 1. 特點： 分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75， 對95高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在35外切酶活性 2. 用途： 主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個DNA 分子因而可被擴(kuò)增4106倍 DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為

34、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個步驟： DNA模板變性(95) 與DNA引物退火(45) 引物延伸(75) Taq Pol 和PCR 5 3 變性 3 5 5 3 引物 3 5 復(fù)性 5 3 5 3 3 5 引物 3 5 5 3 延伸 5 3 3 5 3 5 五.T7DNA聚合酶從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來的一種核酶。兩種不同的亞基：T7噬菌體編碼的基因5蛋白質(zhì)和大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。用途：大分子DNA合成；通過延伸或取代合成的途徑標(biāo)記DNA的3末端；標(biāo)記5和3突出末端，轉(zhuǎn)變成平末端結(jié)構(gòu)。修飾的T7DNA聚合酶失去外切酶活性，但在單鏈模板上的聚合作用的速率增加了3倍，能有效

35、地催化低水平的dNTPs(0.1umol/L)參入。而且能有效填補(bǔ)和標(biāo)記具有5突出末端的DNA片段的3末端。 六. DNA定序酶 用基因工程方法去除35外切酶活性的Taq DNA聚合酶七. Tth DNA聚合酶 93kD，75，含有二級結(jié)構(gòu)DNA分子的定序八. Tli DNA聚合酶 100仍具酶活，35外切酶活性，85 kD DNA的切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng) DNA聚合酶和核酸酶S1或綠豆核酸酶連用, 可用于 DNA末端結(jié)構(gòu)的修飾 5AAGCTT3 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+ klenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT

36、3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA連接酶 T4 DNA連接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng) 四種不同補(bǔ)平反應(yīng)5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1

37、 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 小結(jié)：DNA聚合酶(DNA polymerase)第 五 節(jié) RNA 聚 合 酶 一. SP6 RNA聚合酶 1、特點： 依賴于DNA的RNA聚合酶，具SP6啟動子特異型 2、用途： 主要用于RNA分子的體外合成，RNA分子可用于： 1） RNA分子的拼接研究 2） 標(biāo)記的RNA常用于雜交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更穩(wěn)定，兩條鏈均可標(biāo)記，產(chǎn)生的RNA具高放射比活性 3） DNA的定序分析 4） 基因結(jié)構(gòu)的研究，其中

38、包括內(nèi)含子數(shù)目，長度和位置 5） 還可以用于蛋白質(zhì)的合成研究RNA聚合酶活性 二. T7 RNA聚合酶 特異性識別T7噬菌體基因啟動子 三. T3 RNA聚合酶 特異性識別T3噬菌體基因啟動子 基因啟動子識別的特異性比較：SP6T7T3 四. E.coli RNA聚合酶五. 多聚核苷酸磷酸化酶 第 六 節(jié)連 接 酶 DNA連接酶(DNA ligase)DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸根和3-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應(yīng)需要供給能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。1. T4 DNA連接酶 1. 特點： 只連接d

39、s -DNA分子，要求3-羥基和5-磷酸基 2. 用途： 1) 相同或相容粘性末端的連接 2) 平整末端的相連 DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果; 限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多 3. 抑制劑： PO43-5mM , NaCl25mM, Ca+0.1mM修復(fù)雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵修復(fù)與RNA結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個平頭雙鏈DNA分子：2、DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5MgCl2 10mmol/LATP 0.5-1mmol/LDTT 5mmol/LVolume 10-20LTemperature 4-15 Time 4-16h3、平頭雙鏈DNA片段的連接操作 從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢的多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）。加大平