CNASCL36：2012分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用說明

1、2012年09月13日發(fā)布2013年XX月XX日第1次修訂2014年xx月xx日實施醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明GuidanceontheApplicationofAccreditationCriteriafortheMedicalLaboratoryQualityandCompetenceintheFieldofMolecularDiagnostics（征求意見稿）中國合格評定國家認(rèn)可委員會CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發(fā)布2013年XX月XX日第1次修訂2014年xx月xx日實施*/1前言本文件由中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）

2、制定，是CNAS根據(jù)分子診斷領(lǐng)域的特性而對CNAS-CL02：2012醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則所作的進一步說明，并不增加或減少該準(zhǔn)則的要求。本文件與CNAS-CL02：2012醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則同時使用。在結(jié)構(gòu)編排上，本文件章、節(jié)的條款號和條款名稱均采用CNAS-CL02：2012中章、節(jié)條款號和名稱，對CNAS-CL02：2012應(yīng)用說明的具體內(nèi)容在對應(yīng)條款后給出。本文件的附錄A、B為規(guī)范性附錄。附錄的序號及內(nèi)容與CNAS-CL02:2012不對應(yīng)。本文件于2012年制定，本次為第1次修訂換版。CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發(fā)布2013年XX月X

3、X日第1次修訂2014年xx月xx日實施醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明1范圍本文件規(guī)定了CNAS對分子診斷領(lǐng)域的認(rèn)可要求，包括：病原體核酸和人體基因等領(lǐng)域涉及的核酸擴增試驗、雜交試驗（包括解剖病理中的原位雜交試驗）、核酸電泳分析等。注：“分子診斷”包括檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的“分子檢驗”以及病理學(xué)檢查領(lǐng)域的“分子病理”。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2006臨床實驗室定量測定室內(nèi)質(zhì)量控制指南CNAS-RL02能力驗證規(guī)則CNSA-C

4、L31內(nèi)部校準(zhǔn)要求臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊，人民軍醫(yī)出版社，2004醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則病理科建設(shè)與管理指南（試行），衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)200931號術(shù)語和定義管理要求4.1組織和管理責(zé)任實驗室為獨立法人單位的，應(yīng)有醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可；實驗室為非獨立法人單位的，其所屬醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)證書的診療科目中應(yīng)有醫(yī)學(xué)實驗室，自獲準(zhǔn)執(zhí)業(yè)之日起開展醫(yī)學(xué)檢驗/病理工作至少2年。技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)具有副高以上醫(yī)學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，從事醫(yī)學(xué)檢驗/病理工作至少5年。質(zhì)量管理體系文件控制服務(wù)協(xié)議受委托實驗室的檢驗CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發(fā)布2013年XX月XX日第1次修訂20

5、14年xx月xx日實施4.6外部服務(wù)和供應(yīng)4.7咨詢服務(wù)4.8投訴的解決4.9不符合的識別和控制4.10糾正措施4.11預(yù)防措施4.12持續(xù)改進4.13記錄控制4.14評估和審核4.15管理評審技術(shù)要求5.1人員實驗室負(fù)責(zé)人應(yīng)具有醫(yī)學(xué)專業(yè)本科以上學(xué)歷，副高以上專業(yè)技術(shù)職稱、從事分子檢驗/分子病理工作至少3年。臨床基因擴增檢驗實驗室操作人員應(yīng)經(jīng)過有資質(zhì)的培訓(xùn)機構(gòu)培訓(xùn)合格取得上崗證后方可上崗。簽發(fā)分子病理報告的醫(yī)師應(yīng)具有中級以上病理學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子病理工作經(jīng)歷。認(rèn)可的授權(quán)簽字人應(yīng)至少具有中級以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，從事申請認(rèn)可授權(quán)簽字領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)工作至少3年以上。實驗室的檢驗

6、/檢查人員至少應(yīng)有2名。應(yīng)每年評估員工的工作能力。對新進員工在最初6個月內(nèi)應(yīng)至少進行2次能力評審，保存評估記錄。當(dāng)職責(zé)變更時，或離崗6個月以上再上崗時，或政策、程序、技術(shù)有變更時，應(yīng)對員工進行再培訓(xùn)和再評估。沒有通過評估的人員應(yīng)經(jīng)再培訓(xùn)和再評估，合格后才可繼續(xù)上崗，并記錄。5.2設(shè)施和環(huán)境條件應(yīng)實施安全風(fēng)險評估，并制定針對性的防護措施及合適的警告。臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分四個獨立的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；樣品制備區(qū)；擴增區(qū)；擴增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用自動分析儀（擴增產(chǎn)物閉管檢測），擴增區(qū)和擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。上述每個區(qū)域應(yīng)有充分空間以保證：（a）樣品處置符合分析前、后樣品分區(qū)放置；（b

7、）儀器放置符合維修和操作要求；（c）樣品制備區(qū)放置生物安全柜、離心機和冰箱等儀器設(shè)備；（d）打印檢驗報告時交叉污染的控制。工作區(qū)域應(yīng)符合如下要求：（a）應(yīng)有限制進入實驗區(qū)的標(biāo)志和措施；（b）非本實驗室工作人員，未經(jīng)許可不得接觸到患者樣品、信息等資源；（c）實驗室各分區(qū)應(yīng)配置固定和移動紫外線燈，波長為254nm，照射時離實驗臺的高度一般為6090cm；擴增儀配備不間斷電源；（d）各區(qū)應(yīng)有信息通訊聯(lián)系手段，便于在緊急情況下與外面的聯(lián)系；（e）樣品制備區(qū)應(yīng)配置二級生物安全柜和洗眼器，實驗室附近應(yīng)有噴淋裝置。所有分子病理實驗室均應(yīng)設(shè)置獨立的標(biāo)本前處理區(qū)，包括切片區(qū)和脫蠟區(qū)，用于組織切片、脫蠟、水化、染

8、色等。脫蠟、水化及染色應(yīng)在通風(fēng)設(shè)施中進行。應(yīng)有足夠的、溫度適宜的儲存空間（如冰箱），用以保存臨床樣品和試劑，設(shè)置目標(biāo)溫度和允許范圍，并記錄。實驗室應(yīng)有溫度失控時的處理措施并記錄。不同的實驗區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。工作結(jié)束后應(yīng)立即對工作區(qū)進行清潔，必要時進行消毒及去污染。應(yīng)依據(jù)所用分析設(shè)備和實驗過程對環(huán)境溫、濕度的要求，制定溫濕度控制要求并記錄，應(yīng)有溫度失控時的處理措施并記錄。應(yīng)依據(jù)用途（如：RNA檢測用水），制定適宜的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（如：應(yīng)除RNase）,并定期檢測。分子檢驗各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記。進入各工作區(qū)域應(yīng)按照單一方向進行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)-樣品制備區(qū)-擴增區(qū)-擴增產(chǎn)物

9、分析區(qū)。不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不應(yīng)將工作服帶出。實驗室設(shè)備、試劑和耗材5.3.1.1如從事RNA的檢測，應(yīng)配備一70C的冷凍設(shè)備和高速冷凍離心機。標(biāo)本制備區(qū)使用的一次性加樣器吸頭應(yīng)帶有濾芯。PCR試驗用容器應(yīng)可密閉。不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不能混用。分子病理實驗室標(biāo)本前處理區(qū)的設(shè)備應(yīng)包括切片機、裱片機、切片刀及防樣品交叉污染的消毒用具、紫外燈、電熱恒溫箱、脫蠟缸、水化缸及HE染色缸。應(yīng)按國家法規(guī)要求對強檢設(shè)備進行檢定。應(yīng)進行外部校準(zhǔn)的設(shè)備，如果符合檢測目的和要求，可按制造商校準(zhǔn)程序進行。應(yīng)至少對分析設(shè)備的加樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)進行校

10、準(zhǔn)。分析設(shè)備和輔助設(shè)備的內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)符合CNAS-CL31內(nèi)部校準(zhǔn)要求。應(yīng)定期對PCR儀、加樣器、溫度計、恒溫設(shè)備和離心機進行校準(zhǔn)。設(shè)備故障修復(fù)后，應(yīng)首先分析故障原因，如果設(shè)備故障影響了方法學(xué)性能，可通過以下合適的方式進行相關(guān)的檢測、驗證（適用于定量項目）：（a）校準(zhǔn)的項目實施校準(zhǔn)；（b）質(zhì)控物檢驗；（c）與其他儀器或方法比對，偏差符合附錄A.3的要求；（d）以前檢驗過的樣品再檢驗，偏差符合附錄A.5的要求。5.3.2.1實驗室應(yīng)建立試劑和關(guān)鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗收程序，相應(yīng)程序中應(yīng)有明確的判斷符合性的方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（宜參考附錄A）。實驗室應(yīng)對新批號或同一批號不同貨運號的試劑和關(guān)鍵

11、耗材進行驗收，驗收試驗至少應(yīng)包括：（a）外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性、有效期等；（b）性能驗證：通過實驗才能判斷的，如試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率、試劑的批間差異、關(guān)鍵耗材的抑制物等：試劑性能驗證記錄應(yīng)能反映該批試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率。一般情況下，臨床實驗室采用新批號試劑或關(guān)鍵耗材檢測5份過去用舊試劑或關(guān)鍵耗材檢測過的患者樣品進行驗證，符合附錄A.6要求即可視為滿足要求。但當(dāng)實驗室懷疑提取試劑有質(zhì)量問題時，可采用凝膠電泳試驗比較核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)物確認(rèn)核酸片段提取的完整性、260nm紫外波長測定確認(rèn)核酸提取的產(chǎn)率、260nm/280nm比值確認(rèn)核酸提取的純度。核酸擴增效

12、率可通過計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（slope）獲得，實驗室可參照供應(yīng)商提供的斜率范圍來評價該批試劑的符合性。用于定性檢驗的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。用于定量檢驗的試劑，應(yīng)進行新舊試劑批間的差異驗證，方法和要求參照附錄A.6要求。耗材的抑制物驗收：對關(guān)鍵耗材應(yīng)檢測是否存在核酸擴增的抑制物，方法和要求參照附錄A.6要求。檢驗前過程應(yīng)規(guī)定分子檢驗樣品留取的具體要求，如：（a）使用無DNase和RNase的一次性密閉容器；（b）正確使用抗凝管：一般全血和骨髓樣品應(yīng)進行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時除外）；（c）用于RNA（如H

13、CVRNA）擴增檢測的血樣品宜進行抗凝處理，并盡快分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜盡快分離血清。（d）分泌物、拭子、腫瘤組織等樣品留取的注意事項等。核酸應(yīng)盡快處置并儲存，以便盡可能減少降解。超長期儲存后的標(biāo)本，使用前應(yīng)再次評估標(biāo)本的完整性。e）基于組織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的檢測項目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)樣品是否滿足檢測要求。分子病理檢測樣品若為組織，應(yīng)采用10%中性緩沖的福爾馬林固定，固定液的量和固定時間應(yīng)符合檢測要求。5.5檢驗過程定量檢測方法和程序的分析性能驗證內(nèi)容至少應(yīng)包括正確度、精密度、可報告范圍等。定性檢測項目驗證內(nèi)容至少應(yīng)包括檢出限及符合率等。驗證結(jié)果應(yīng)經(jīng)過授

14、權(quán)人審核。應(yīng)使用通過驗證的核酸抽提和純化的試驗方法，在需要時進行核酸的定量。對產(chǎn)前檢驗，在完成分子診斷前應(yīng)保留備份培養(yǎng)物并跟蹤監(jiān)測實驗的準(zhǔn)確性；在檢驗胎兒標(biāo)本前，應(yīng)檢驗父母一方或雙方的突變狀態(tài)，宜由同一實驗室檢驗；如有足夠的標(biāo)本，應(yīng)從兩份不同標(biāo)本中提取DNA進行雙份檢驗。實驗室應(yīng)了解檢驗方法受母體細(xì)胞存在污染的影響，應(yīng)有程序評估并減少這種影響。應(yīng)有明確和統(tǒng)一的原位雜交（ISH）陽性信號的標(biāo)準(zhǔn)，并建立本實驗室的陽性閾值。組織病理ISH，應(yīng)結(jié)合組織形態(tài)進行結(jié)果判讀，并采用國際通用的評分標(biāo)準(zhǔn)。檢驗結(jié)果質(zhì)量的保證5.6.2.1總則應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制程序，可參照GB/T20468-2006臨床實驗室定量

15、測定室內(nèi)質(zhì)量控制指南。質(zhì)量控制程序中應(yīng)有針對核酸檢測防污染的具體措施。應(yīng)保留DNA質(zhì)量評價記錄。需要時，應(yīng)對RNA的質(zhì)量進行評價，并選擇合適的“看家”mRNA作為內(nèi)對照以評價RNA的完整性，并保留RNA質(zhì)量評價記錄及假陰性率監(jiān)測記錄。對于需要進行DNA抽提的石蠟包埋樣品，應(yīng)從組織形態(tài)學(xué)對腫瘤細(xì)胞數(shù)量進行評價。病理醫(yī)師除了要明確組織樣品中是否存在腫瘤細(xì)胞，還應(yīng)明確組織樣品中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否達到后續(xù)分子檢測所需的最低標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)分子診斷結(jié)果與臨床和其他實驗室結(jié)果不符時，應(yīng)記錄并分析原因，適當(dāng)時采取糾正措施。質(zhì)控物分子檢驗定性檢測項目，每次實驗應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和陽性質(zhì)控物。分子病理定性檢測項目，每次

16、實驗應(yīng)設(shè)置陰性和陽性質(zhì)控物。質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控規(guī)則應(yīng)確保試驗的穩(wěn)定性和檢驗結(jié)果的可靠性。定量檢測項目質(zhì)控圖應(yīng)包括質(zhì)控結(jié)果、質(zhì)控物名稱、濃度、批號和有效期、質(zhì)控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標(biāo)識、方法學(xué)名稱、檢驗項目名稱、試劑和校準(zhǔn)物批號、每個數(shù)據(jù)點的日期和時間、干擾行為的記錄、質(zhì)控人員及審核人員的簽字、失控時的分析處理程序和糾正措施等。定性檢測項目：陰陽性符合預(yù)期。563.1應(yīng)按照CNAS-RL02能力驗證規(guī)則的要求參加相應(yīng)的能力驗證/室間質(zhì)評。應(yīng)保留參加能力驗證/室間質(zhì)評的結(jié)果和證書。實驗室負(fù)責(zé)人或指定負(fù)責(zé)人應(yīng)監(jiān)控室間質(zhì)量評價活動的結(jié)果，并在結(jié)果報告上簽字。通過與其他實驗室（如已獲認(rèn)可的

17、實驗室、使用相同檢測方法的實驗室、使用配套系統(tǒng)的實驗室）比對的方式確定檢驗結(jié)果的可接受性時，應(yīng)滿足如下要求：（a）規(guī)定比對實驗室的選擇原則；（b）樣品數(shù)量：至少5份，包括正常和異常水平；（c）頻率：至少每年2次；（d）判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)有80%的結(jié)果滿足要求。實驗室使用兩套及以上檢測系統(tǒng)檢測同一項目時，應(yīng)有比對數(shù)據(jù)表明其檢測結(jié)果的一致性，比對頻次每年至少2次，每次不少于20份樣品，濃度水平覆蓋測量范圍；比對結(jié)果的系統(tǒng)偏倚應(yīng)符合附錄A.4的要求。使用不同生物參考區(qū)間的檢測系統(tǒng)間不宜進行比對。比對記錄應(yīng)由實驗室負(fù)責(zé)人審核并簽字，并應(yīng)保留至少2年。5.7檢驗后過程檢驗結(jié)果報告后，原始樣品、核酸提取物以及核

18、酸擴增產(chǎn)物均應(yīng)保存至少1個月。為便于追溯，凝膠圖像和斑點雜交條帶應(yīng)作為技術(shù)記錄保存，保存期限參照相關(guān)行業(yè)要求。結(jié)果報告5.8.1應(yīng)在規(guī)定時限內(nèi)報告每一項分子診斷學(xué)檢驗結(jié)果?；诮M織/細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分子病理檢查結(jié)果應(yīng)由病理醫(yī)師負(fù)責(zé)結(jié)果判讀和簽發(fā)報告。應(yīng)實施雙簽名。對于產(chǎn)前及產(chǎn)后診斷先天性疾病，檢驗結(jié)果應(yīng)由有資質(zhì)的病理學(xué)家或由有臨床背景的經(jīng)適當(dāng)培訓(xùn)且有實驗室經(jīng)驗的人員報告。對于臨床微生物學(xué)和傳染病學(xué)，以下檢驗結(jié)果應(yīng)當(dāng)由有資質(zhì)的經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)且有實驗室經(jīng)驗的臨床微生物學(xué)專家報告：a.艾滋病毒：核酸擴增檢驗，病毒載量，抗病毒耐藥類型；b.HCV：核酸擴增檢測，病毒載量；c.乙肝病毒：病毒載量、抗病毒耐藥

19、類型；d.SARS冠狀病毒：核酸擴增試驗；e.除季節(jié)性流感（H1N1和H3N2）以外的甲型流感病毒：核酸擴增試驗；f.所有來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)標(biāo)本的核酸擴增檢測。應(yīng)該注意的是，僅用定性的分子檢測結(jié)果用于艾滋病毒、乙肝病毒和丙肝病毒感染的臨床診療是不夠的。實驗室應(yīng)提醒醫(yī)生，在開始任何決定性的治療方案前需要考慮選做其他參數(shù)如血清學(xué)調(diào)查結(jié)果和臨床特征。結(jié)果發(fā)布實驗室信息管理CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發(fā)布2013年XX月XX日第1次修訂2014年xx月xx日實施附錄A（規(guī)范性附錄）分子診斷項目分析性能標(biāo)準(zhǔn)A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測系統(tǒng)不精密度要求：以能力驗證/室間質(zhì)評評價界限（靶值0.4對數(shù)值）作為允許總誤差（TEa）,重復(fù)性精密度v3/5TEa；中間精密度4/5TEa。A.3設(shè)備故障修復(fù)后，分析系統(tǒng)比對：5份樣品，覆蓋測量區(qū)間，至少4份樣品測量