食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院[1]

1、第六章 食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)第一節(jié) 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)第二節(jié) PCR檢測(cè)技術(shù)第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)技術(shù)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1第一節(jié) 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)一、概述 抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)是一切免疫測(cè)定技術(shù)的最基本原理。在此基礎(chǔ)上結(jié)合一些生化或理化方法作為信號(hào)顯示或放大系統(tǒng)即可建立免疫測(cè)定法，如放射免疫測(cè)定法、酶免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法等。一個(gè)成功的免疫測(cè)定法必須具備3個(gè)要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏和專(zhuān)一性的標(biāo)記物和高效的分離手段。按照是否使用標(biāo)記物分為標(biāo)記免疫測(cè)定法和非標(biāo)記免疫測(cè)定法，后者又稱(chēng)為經(jīng)典免疫測(cè)定法；按反應(yīng)介質(zhì)分為均相或非均相(免疫復(fù)合物需分離后檢測(cè))

2、免疫測(cè)定法；按反應(yīng)狀態(tài)分為平衡態(tài)或非平衡態(tài)免疫測(cè)定法。按照標(biāo)記物種類(lèi)，標(biāo)記免疫測(cè)定法又分為放射性標(biāo)記測(cè)定法和非放射性標(biāo)記測(cè)定法。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1目前最常用的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)如下：（1）放射免疫測(cè)定技術(shù) （2）酶免疫測(cè)定技術(shù)（3）熒光免疫測(cè)定技術(shù)（4）發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（5）膠體金免疫測(cè)定技術(shù)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)（一）ELISA的基本原理 ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。這一方法的基本

3、原理如下。 （1）使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，井保持其免疫活性； （2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性又保留酶的活性。（二）ELISA的類(lèi)型 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類(lèi)型。1 雙抗體夾心法測(cè)抗原2 雙抗原夾心法測(cè)抗體3 間接法測(cè)抗體4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（三）ELISA的材料與試劑 完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；酶的底物；陰性對(duì)照品和

4、陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；洗滌液；酶反應(yīng)終止液。1 免疫吸附劑 2 結(jié)合物 3 酶的底物4 洗滌液5 酶反應(yīng)終止液6 陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品7 參考標(biāo)準(zhǔn)品食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1三、磺胺二甲嘧啶的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)（一）人工完全抗原的合成（二）合成抗原的鑒定（三）抗體的制備與純化（四）標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線的制作（五）畜產(chǎn)品中SM2殘留的ELISA檢測(cè)（六）方法評(píng)價(jià)1 特異性2 靈敏度3 準(zhǔn)確度4 精確度食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1第二節(jié)PCR檢測(cè)技術(shù)一、概述 PCR

5、又稱(chēng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction)，是1985年由美國(guó)的Kary Mullis首創(chuàng)并由美國(guó)Cetus公司開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA的方法。應(yīng)用該方法可使極微量的特定DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增至百萬(wàn)倍，因而一經(jīng)問(wèn)世便在短短的數(shù)年內(nèi)就得到了迅速發(fā)晨和實(shí)際應(yīng)用，并在原有基礎(chǔ)上結(jié)合各種生化分子生物學(xué)技術(shù)衍生出了許多改良技術(shù)。這些技術(shù)顯示出了巨大的潛力，發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，也正因?yàn)槿绱怂鼈儽蛔u(yù)為20世紀(jì)80年代分子生物學(xué)革命和生物技術(shù)的飛躍。（一）PCR原理 PCR是依據(jù)DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程，在體外合適的條件下以單鏈DNA為模板，以人工設(shè)計(jì)和合成的

6、寡核苷酸為引物，利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延5-3方向摻人單核苷酸來(lái)特異性的擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。（二）PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、緩沖液、Mg2+和核酸模板組成。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（三）PCR反應(yīng)參數(shù) 在PCR反應(yīng)中每輪循環(huán)的各步反應(yīng)時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介紹PCR反應(yīng)中的一些具體參數(shù)。1.變性 2.退火 3.延伸 4.循環(huán)次數(shù) （四）常見(jiàn)的PCR種類(lèi)1.熱啟動(dòng)PCR 2.一步單管PCR 3.多重PCR4.依賴(lài)PCR的DNA指紋圖譜技術(shù) 5.PCR-單鏈構(gòu)想多態(tài)

7、性分析6.mRNA差異顯示技術(shù) 7.隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）8.以微衛(wèi)星DNA介導(dǎo)的PCR技術(shù)9.基因間重復(fù)性回文片段（REP）和基因內(nèi)重復(fù)性一致序列（ERIC）的擴(kuò)增10.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）11.限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）12.用于RNA病毒檢測(cè)的核酸擴(kuò)增技術(shù)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（五）PCR技術(shù)用于檢測(cè)的主要步驟（1）運(yùn)用化學(xué)手段對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行提取。（2）設(shè)計(jì)并合成引物，引物設(shè)計(jì)或合成的好壞直接決定PCR擴(kuò)增的成效。（3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（4）克隆并篩選鑒定PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，在紫外光照射下可見(jiàn)擴(kuò)

8、增特異區(qū)段的DNA帶根據(jù)該帶的不同即可鑒定不同的DNA。（5）DNA序列分析食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)技術(shù)一、概述 轉(zhuǎn)基因食品又稱(chēng)遺傳修飾食品（genetically modified food），簡(jiǎn)稱(chēng)GMF或GM食品。轉(zhuǎn)基因食品大體上分為如下三類(lèi)。（1）轉(zhuǎn)基因植物食品 由轉(zhuǎn)基因植物如轉(zhuǎn)基因的玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、香蕉、蘋(píng)果、菠菜等生產(chǎn)加工而成。（2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品 如轉(zhuǎn)基因的魚(yú)、雞、牛、羊等。目的主要通過(guò)導(dǎo)入外源基因或?qū)ψ陨砘蚣右孕揎梺?lái)使受體動(dòng)物降低結(jié)締組織交聯(lián)度、改善肉質(zhì)或使受體生物個(gè)體肥大，或生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的蛋、肉、

9、乳等。（3）轉(zhuǎn)基因微生物食品 如轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵而制得的葡萄酒、啤酒、醬油等，此類(lèi)食品是利用轉(zhuǎn)基因微生物（如轉(zhuǎn)基因酵母和酶）的作用而生產(chǎn)出來(lái)的食品。后兩類(lèi)轉(zhuǎn)基因食品目前在市場(chǎng)上還很少。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（一）ELISA技術(shù)與轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè) l.ELISA基本原理 建立在抗體抗原免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上。 ELISA分析法必須具備待檢測(cè)的固定相抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體、酶作用的底物三種試劑，且滿(mǎn)足兩個(gè)前提條件： 待檢測(cè)的抗原或抗體能夠結(jié)合到不溶性載體表面并保持活性； 標(biāo)記酶能與抗原或抗體結(jié)合并同樣 保持各自生物活性。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代

10、生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1 ELISA分析基本步驟如下：將抗原（Ag）或抗體Ab結(jié)合到固相載體平板的孔里；待測(cè)溶液的特殊抗原或抗體結(jié)合到敏化載體表面；加入酶標(biāo)抗體使之與抗原或抗體化合物相結(jié)合；結(jié)合物通過(guò)標(biāo)記酶催化底物的顏色改變而被檢測(cè)；通過(guò)最后溶液的顏色深淺對(duì)待側(cè)抗原或抗體進(jìn)行定量分析。2.ELISA分析法的靈敏度3.ELISA分析法的要點(diǎn) 特異性高，獲得結(jié)果快，儀器簡(jiǎn)單，易于操作，對(duì)人員要求不高。免卻了對(duì)樣品進(jìn)行核酸提取的麻煩，同時(shí)可降低檢測(cè)的成本，由于酶既有很高的催化效率，可極大的放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定達(dá)到很高的靈敏度和穩(wěn)定性。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院

11、1(二）PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) 1.PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的定性檢測(cè)（1）PCR基本原理 PCR技術(shù)由美國(guó)Centus公司Kary Mullis發(fā)明，20世紀(jì)90年代逐漸成熟應(yīng)用。簡(jiǎn)單地說(shuō)PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4種脫氧單核苷酸在試管內(nèi)完成模板DNA的快速?gòu)?fù)制 （2）PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的技術(shù)關(guān)鍵和理論依據(jù) 食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（3）PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的基本步驟 待檢材料DNA提?。和ǔ＠肅TAB法從食品材料中提取核酸； PCR反應(yīng)：設(shè)計(jì)合適引物。PCR擴(kuò)增待檢樣品中的靶標(biāo)DNA； 觀測(cè)PCR產(chǎn)物：通過(guò)凝膠電泳分析將PCR產(chǎn)

12、物展現(xiàn)； 確定結(jié)果：有時(shí)為了避免假阻性，還需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切分析進(jìn)行質(zhì)量控制。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院12.PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的定量檢測(cè) 目前基于GMO特異DNA片段的定性PCR篩選方法已廣泛應(yīng)用于GMO食品檢測(cè)但是隨著各國(guó)有關(guān)GMO標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對(duì)食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定。為此，研究者在定性篩選PCR方法的基礎(chǔ)上發(fā)展了不同的定量GMO的PCR檢測(cè)方法。目前，國(guó)外較為成熟的方法主要有半定量PCR法、定量競(jìng)爭(zhēng)PCR(Quantitative competitive PCR)和Realtime PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)法等三種

13、。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（1）半定量PCR法 樣品DNA的提取和定量。 按常規(guī)方法提取DNA后，取部分樣品DNA在0.8瓊脂糖凝膠中電泳，與已知古量的Marker比較，用計(jì)算機(jī)凝腔成像分析系統(tǒng)處理結(jié)果，以確定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lg DNA。PCR反應(yīng)。 a.樣品DNA的質(zhì)量分析 b.建立內(nèi)部參照反應(yīng)體系 c.測(cè)定CaMV35S啟動(dòng)子的定量PCR反應(yīng)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（2）定量競(jìng)爭(zhēng)PCR法 PCR反應(yīng)實(shí)質(zhì)是對(duì)特定模板DNA的指數(shù)擴(kuò)增放大，而在相同的條件下，獲得DNA的量與最初模板

14、DNA的濃度成正相關(guān)，競(jìng)爭(zhēng)定量PCR就是依據(jù)這種擴(kuò)增DNA與模板DNA之間的濃度相關(guān)性設(shè)計(jì)的?；驹硎窍葮?gòu)建含有修飾過(guò)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)DNA片段(競(jìng)爭(zhēng)DNA)，競(jìng)爭(zhēng)DNA由質(zhì)粒組成，帶有一個(gè)改造PCR擴(kuò)增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者點(diǎn)突變，競(jìng)爭(zhēng)DNA與待測(cè)目標(biāo)DNA在同一反應(yīng)管中進(jìn)行PCR共擴(kuò)增，因競(jìng)爭(zhēng)DNA片段和待測(cè)DNA的大小不同，經(jīng)瓊脂糖凝膠可將兩者分開(kāi)，通過(guò)比較兩種條帶的量可進(jìn)行定量分析。食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)技術(shù)6食品安全現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)武漢工業(yè)學(xué)院1（三）生物芯片與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 就目前轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中常用的ELISA和PCR技術(shù)而言，最大的缺點(diǎn)是檢測(cè)范圍窄，效率低，無(wú)法高通量大規(guī)模地同時(shí)檢測(cè)多種樣品，尤其是對(duì)轉(zhuǎn)基因背景一無(wú)所知的情況下。對(duì)各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。而目前正在研究的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所涉及的基因數(shù)量有上萬(wàn)種，今后都有可能進(jìn)入商品化生