細(xì)胞融合-與-單克隆抗體

1、細(xì)胞融合 與 單克隆抗體Cell Fusion and Monoclonal Antibodies4.1細(xì)胞融合4.2雜種細(xì)胞的遺傳特性和應(yīng)用4.3淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體技術(shù)4.1細(xì)胞融合4.11聚乙二醇介導(dǎo)的細(xì)胞融合4.12細(xì)胞電融合4.13雜種細(xì)胞的篩選4.1 細(xì)胞融合定義：指用自然或人工方法、使兩個(gè)或更多個(gè)不同的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過程，又稱為體細(xì)胞雜交4.11 聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細(xì)胞融合 原理：PEG帶有大量的負(fù)電荷,和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)

2、致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。影響因素： 分子量：4006000（通常：10004000） 濃度： 2060% （通常：3050%） 時(shí)間： 懸浮法 12 min 離心法 58 min pH： 偏堿為宜（pH7.48.0） 其他： 二甲亞砜、植物血凝素4.12 細(xì)胞電融合原理： 懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在1100MHz和1001000V/cm的交流電場中，會向小電極移動，并極化成偶極子，而沿電場方向發(fā)生雙向電泳，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖，即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細(xì)胞融

3、合。雙向電泳：在交流電場的作用下（1MHz，150V/cm）細(xì)胞膜上正負(fù)電荷分離，產(chǎn)生偶極，兩個(gè)極化的細(xì)胞會發(fā)生相互的緊密接觸?？赡骐娊到猓涸诟哳l電場的脈沖作用下（50ms，電場強(qiáng)度1.22kV/cm），細(xì)胞膜上的離子發(fā)生位移，而使電荷分開，細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生電勢，正、負(fù)電荷相互吸引，細(xì)胞膜變薄，隨細(xì)胞勢的增加，膜降解穿孔，形成微孔。電場誘發(fā)的微孔面積和數(shù)目與細(xì)胞膜總表面積相對不大時(shí)，微孔可以重新封閉。電場示意圖甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。注意事項(xiàng)1）對介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸

4、餾水并選用適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強(qiáng)度和時(shí)間，以防止細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。優(yōu)點(diǎn)：融合率高，達(dá)7080，甚至100 融合率（融合組多核細(xì)胞的核數(shù)對照組多核細(xì)胞的核數(shù)/對照組的全部細(xì)胞數(shù)）100可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞4.13 雜種細(xì)胞的篩選原理：兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。1）親本 2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細(xì)胞。6）核質(zhì)體：有細(xì)胞核而帶

5、有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體植物細(xì)胞篩選方式1）遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 如親本1：葉綠體缺陷型 親本2：光致死型 兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白 色，融合細(xì)胞長成植株呈綠色，并能成長2）抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個(gè)世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細(xì)胞死亡3）利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的

6、愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。 親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體 親本2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體 在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分4）利用生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。動物細(xì)胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長2）營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成

7、分時(shí)，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會死亡。3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。雜種細(xì)胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長。4.2 雜種細(xì)胞的遺傳特性和應(yīng)用4.21雜種細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用4.23雜種細(xì)胞在植物育種中的應(yīng)用4.21 雜種細(xì)胞在細(xì)

8、胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用1）基因定位 不同種屬的細(xì)胞融合時(shí)，常會出現(xiàn)一個(gè)親本細(xì)胞的染色體被優(yōu)先排除，而另一個(gè)親本的染色體被選擇性留下，即染色體分離的現(xiàn)象。由此，可根據(jù)表型和與表型特征相對應(yīng)的基因在特定染色體上。 例如 ：HGPRT人細(xì)胞與TK的小鼠細(xì)胞融合后，可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細(xì)胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。2）體細(xì)胞雜種的致瘤性分析 通過正常二倍體細(xì)胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的融合來進(jìn)行致瘤性的遺傳分析。 3）遺傳缺陷的基因互補(bǔ) 基于雜種細(xì)胞的基因互補(bǔ)作用，可分為基因間和基因內(nèi)的互補(bǔ)作用，即雜種細(xì)胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表

9、型。通過這種基因互補(bǔ)，可以用正常基因來治療由于基因突變或基因缺失的疾病。4）分化功能表達(dá)調(diào)控的研究通過細(xì)胞融合可將不同分化狀態(tài)或組織類型的細(xì)胞構(gòu)建成為能夠存活的種內(nèi)或種間雜種，同時(shí)對雜種細(xì)胞內(nèi)的基因組和胞質(zhì)觀察和分析，了解如何通過相互作用而最終導(dǎo)致原先表達(dá)的分化性狀熄滅或保留。4.22 雜種細(xì)胞在植物育種中的應(yīng)用雜種細(xì)胞是一條新的育種途徑，可以產(chǎn)生新經(jīng)濟(jì)性狀的良種?？茖W(xué)家已經(jīng)在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯番茄等都得到了再生植株。目標(biāo)：地上和地下部兼用種、固氮禾等具有兩種不同優(yōu)勢性狀的新品種。4.3 單克隆抗體4.31抗體的結(jié)構(gòu)

10、與功能4.32單克隆抗體的制備和生產(chǎn)4.34單克隆抗體的改造和應(yīng)用4.31 抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體是由B細(xì)胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)。抗體分子： 由四條肽鏈所組成，兩條重鏈（H鏈）兩條輕鏈（L鏈）。結(jié) 合 區(qū)： 抗體分子上有兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)可變區(qū)（V區(qū)）穩(wěn)定區(qū)（C區(qū)）人體內(nèi)的五種抗體4.32單克隆抗體的制備單克隆抗體(monoclonal antibody，簡稱McAb)：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。單抗的制備過程

11、動物免疫與親本細(xì)胞的選擇細(xì)胞融合：淋巴細(xì)胞雜交瘤的制備雜交瘤細(xì)胞的篩選：有限稀釋法等單克隆抗體的制備和凍存單克隆抗體的純化親本細(xì)胞的選擇骨髓瘤細(xì)胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT或TK。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。淋巴細(xì)胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。34天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個(gè)/ml，加適當(dāng)濃度抗原，34天

12、后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。 細(xì)胞融合將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心710分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG 0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入510ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細(xì)胞不超過2105 ml，即可加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和

13、1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時(shí)每隔23天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞融合的選擇示意圖HAT選擇系統(tǒng)HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。HPRT-細(xì)胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK- 細(xì)胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。嘌呤合成通路的阻斷淋巴細(xì)胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細(xì)胞通過互補(bǔ)作用獲得HR

14、PT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補(bǔ)救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT- 或TK- 親本細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞亦逐漸死亡，只有雜種細(xì)胞存活。特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細(xì)胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞?？扇∩锨逡海鶕?jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇?？扇苄钥乖刹捎梅派涿庖?、免疫酶標(biāo)測定、間接血凝等方法測定。細(xì)胞抗原可采用免疫熒光、51Cr釋放試驗(yàn)、溶血空斑測定、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒等方法直接測定針對這些抗原的抗體。利用培養(yǎng)基對單抗進(jìn)行鑒定的過程雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌

15、特異抗體的細(xì)胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進(jìn)雜交瘤生長的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。有限稀釋法通過適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機(jī)率將為每孔內(nèi)落入一個(gè)細(xì)胞。4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過812天后，可觀察到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化。軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25的軟

16、瓊脂。待細(xì)胞長成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)。單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種35106 雜交瘤細(xì)胞。1020天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含110mg單抗。2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。4.33 單克隆抗體的改造和應(yīng)用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病雜交人鼠單克隆抗體

17、單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。用同位素標(biāo)記的單抗在特定的組織中成象的技術(shù)可以用于腫瘤、心血管畸形的體內(nèi)診斷。1、單克隆抗體靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)通過化學(xué)反應(yīng)使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏堿，最后還原。這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。如：1，4溴柔紅霉素與腫瘤細(xì)胞單抗形成的偶合物，對腫瘤有明顯的選擇性毒性。2）藥物通過小分子與單抗連接通過

18、一些小分子交聯(lián)劑，把藥物分子上的某些基團(tuán)連接起來。小分子交聯(lián)劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、戊二酐；異型雙功能試劑：N琥珀酰胺基3丙酸和寡肽等。順烏頭酸酐制成的最常用，在中性條件下較穩(wěn)定，在酸性條件下容易發(fā)生水解。這種靶向試劑與腫瘤的表面抗原結(jié)合后，會進(jìn)入溶酶體，在酸性環(huán)境下釋放藥物，而殺死腫瘤細(xì)胞。3）藥物通過大分子與抗體相連大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等?？傊脝慰乖噭┖峡梢宰鳛榘邢蛩幬?，針對腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、各種病原體病等。2、雜交人鼠單克隆抗體鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，還可能引發(fā)人對鼠源抗體本身的免疫反應(yīng)。在抗體中，F(xiàn)c片段在抗體中的作用是激活機(jī)體免疫反應(yīng)。對鼠源抗體進(jìn)行改造，利用人源的Fc區(qū)域的DNA片段替換鼠源單抗的Fc的DNA片段。 嵌合抗體可以保留其目標(biāo)專一性，降低人的抗鼠反應(yīng)。一種制備人腫瘤單克隆抗體的方案3、人源單克隆抗體方法1：分離人B細(xì)胞，使之與熒光標(biāo)記的抗原相結(jié)合，通過熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的B細(xì)胞，并用EpsteinBarr病毒轉(zhuǎn)化，得到少量的單抗。方法2：將人源免疫干細(xì)胞導(dǎo)入缺失大部分免疫細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，遇到抗