藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析

1、 第十三章 生化藥物和基因工程藥物 分析概念 基本要求概述質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法常用定量分析方法及其應(yīng)用 練習(xí)與思考 返回主目錄藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析基本要求 1掌握本類藥物質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法類型。2掌握HPLC法和酶活力測定法在本類藥物測定中的應(yīng)用。3熟悉本類藥物的范圍、種類、質(zhì)量控制的要點(diǎn)。4了解本類藥物含量測定的其他方法。返 回藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 一、防病、治 病的三大藥源 第一節(jié) 概 述藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 1生化藥物： 例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析2. 基因工程藥物： 以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)

2、的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細(xì)胞生長因子類藥物。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析DNA重組技術(shù)（基因工程）：生產(chǎn)過程為天然基因合成的核苷酸序列內(nèi)切酶連接酶載體重組的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞增殖、表達(dá)分離純化目的產(chǎn)物藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析二、種類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及其降解物和衍生物類藥物1生化藥物藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析2基因工程藥物的種類 1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物： 人生長激素釋放抑制因子、人胰島素、人生長激素 2）細(xì)胞因子類藥物： 人干擾素人白細(xì)胞介素、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素 3）酶類及凝血因子類藥物藥物分析

3、A生化藥物和基因工程藥物分析 三、特點(diǎn) 1. 生物體的基本生化成分 2. 分子量大: 分子量測定 3. 結(jié)構(gòu)難確證 4. 全過程的質(zhì)量控制：原料、生產(chǎn)過程、 最終產(chǎn)品 5. 生物活性檢查藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 6. 安全性檢查 7. 效價(jià)（含量）測定： 理化法：有效成分的含量 效價(jià)測定和酶活力測定：有效成分 的生物活性返 回藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項(xiàng)目： 來源與種類 純度 性狀 干燥失重或水分 鑒別 熾灼殘?jiān)?氨酸組分分析 生物活性 肽圖 熱源試驗(yàn) 糖含量 含量分析 第二節(jié) 質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析一、

4、鑒別 理化鑒別法：化學(xué)鑒別法 紫外分光光度法 HPLC法生化鑒別法：酶法 電泳法 等電聚焦法生物鑒別法：家兔驚厥試驗(yàn)藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析（一）理化鑒別法 1.化學(xué)鑒別法： 例：溶菌酶 - CONH- +Cu2+ 絡(luò)合顯色藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 2.紫外分光光度法 溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉 濃度：20g/ml 判斷： max：2571nm A250/A260：0.170.27。3. HPLC法： 利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。 藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 4.酶法： 例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法

5、原理：藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 方法： 取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置370.5恒溫水浴保溫，記時(shí)。反應(yīng)系統(tǒng)在3040秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時(shí)，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法 操作，凝結(jié)塊在2小時(shí)內(nèi)不溶。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析5. 電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動(dòng)位置相應(yīng)。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 6. 生物法： 利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。 例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素。 利用胰島素的降糖作用。給家兔

6、大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析（二）雜質(zhì)檢查 一般雜質(zhì)檢查 特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析 生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查 1. 原料藥純度分析： 多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質(zhì) 酶類藥物-酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析， 具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查 選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物進(jìn)行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個(gè)胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個(gè)單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%（g/g）。1:

7、1000=x:50 x=0.05（mg） L=0.05/1=5% 2. 生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 （三）安全性試驗(yàn) 熱源試驗(yàn) 異常毒性試驗(yàn) :急性毒性物質(zhì) 過敏試驗(yàn)：異性蛋白 降壓物質(zhì)試驗(yàn)：導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)、組 胺、類組胺藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 無菌試驗(yàn)：活菌 基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查 來源于宿主細(xì)胞的殘留DNA，外源性雜質(zhì) 致突變試驗(yàn) 生殖毒性試驗(yàn)藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析（四）含量測定生化藥物和基因藥物的含量表示方法：百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥 物或經(jīng)水解后變成小分子的 藥物。生物效價(jià)或酶活力單位：適用于酶類、 蛋

8、白質(zhì)類藥物。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析含量測定方法： 理化分析法： 化學(xué)分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學(xué)分析法 光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法 色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、 灌注色譜法、HPCE法 酶法：酶活力測定法、酶分析法 電泳法 生物檢定法返 回藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 1電化學(xué)分析法 藥物膜電極 生物組織膜電極 藥物電極 微生物電極 離子選擇性電極法 免疫電極 免疫場效應(yīng)管 酶電極 第三節(jié) 常用定量分析方法及其應(yīng)用 藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 2. HPLC法 1）RP-HPLC：柱前衍生化自動(dòng)測

9、定氨基酸 柱：RP18， 柱溫：48 流動(dòng)相：A-0.05% TFA；B-乙腈-異丙醇（4：1） 梯度洗脫 熒光檢測器：ex=280nm340nm,em=430nm藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 測定： 樣品-肽 樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2， 110，20h 24h。 樣品干燥：真空 樣品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/L NaOH 進(jìn)樣測定藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 2）HPIEC 測定對象：蛋白質(zhì)，多肽 柱：離子交換鍵合相 流動(dòng)相：0.3mol/L1.0m

10、ol/L的鹽的緩沖液。 梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵 素類鹽 特點(diǎn)：可回收活性蛋白。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 3）HPGFC 應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測定。 示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量 的測定 柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000 流動(dòng)相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4 （1:1）0.05%疊氮化鈉藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線的制備： 醛縮酶血清白蛋白右旋糖苷藍(lán) 碳酸酐酶抑蛋白酶肽 酪氨酸T0 完全排阻完全進(jìn)入填料空隙 Tt標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線：Kd - lg M.W

11、.藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 樣品測定： 藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析應(yīng)用示例：ChP（2000）重組人胰島素的質(zhì)量控制 1）鑒別： 法1：在效價(jià)測定項(xiàng)下，供試品主峰的保留時(shí)間 應(yīng)與對照品的一致。 法2：供試品與對照品分別經(jīng)過酶解后，再分別 進(jìn)行梯 度洗脫，供試品的肽圖譜與對照品 的肽圖譜一致。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 2）檢查： 檢查項(xiàng)目：有關(guān)物質(zhì)、高分子蛋白、鋅、氮、 干燥失重、無菌、細(xì)菌內(nèi)毒素。 有關(guān)物質(zhì)：供試液經(jīng)梯度洗脫，按峰面積歸一化 法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量不得超過3.0%。 高分子蛋白質(zhì)： 藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 固定相：色譜用親水硅膠，它可

12、以分離分子量 為50006000的球狀蛋白。流動(dòng)相：0.4mol/L 碳酸氫銨-乙腈（69 : 31）測定：分別測定供試液（1mg/ml）和對照液（將供試液稀釋成0.01mg/ml），供試液顯示的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，應(yīng)不大于對照液主峰面積（限量1.0%)。 藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析 3）效價(jià)測定：固定相：ODS C18 流動(dòng)相：硫酸鹽緩沖液-乙腈（7426） 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測定胰島素主峰和A21脫氨胰 島素峰之間的分離度與拖尾因子。含量測定：分別進(jìn)樣供試液和對照液，按峰面積 外標(biāo)法計(jì)算含量。藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析3.灌注色譜法 固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)上構(gòu) 成貫穿孔 顆粒分離介質(zhì)-POROSR。 雙模式孔結(jié)構(gòu)：80150nm大擴(kuò)散孔 600