中藥制劑分析專業(yè)培訓(xùn)講義

1、中藥制劑分析專業(yè)培訓(xùn)講義 二、中藥制劑分析的特點(diǎn) 一）中藥制劑分析的對(duì)象是復(fù)雜的混合物。 1.組成中成藥的中藥材具有復(fù)雜性。 中藥材的同名異物，同物異名現(xiàn)象普遍存在。有的中藥更由于形態(tài)相似，容易誤用。 2.中成藥化學(xué)成分的多樣性、復(fù)雜性。 1 1）由多味中藥組成的復(fù)方制劑，其化學(xué)成分極為復(fù)雜多樣。 2) 各種化學(xué)成分在中藥中的含量相差懸殊。 3）中藥制劑由多種單味藥材組成，所含化學(xué)成分相互影響。 3.中成藥的劑型繁多，所用之輔料多種多樣，在測(cè)定前，樣品必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理，以排除各種輔料的干擾，必要時(shí)還須進(jìn)行輔料的檢查和測(cè)定。 4.工藝各異，很多在單味中藥鮮品中存在的化學(xué)成分，經(jīng)過(guò)炮制或制備工藝中經(jīng)

2、加熱處理后已不復(fù)存在，或在制備過(guò)程中因揮發(fā)、分解、成鹽 (沉淀)反應(yīng)等增加了中成藥分析工程的困難。 二）首先進(jìn)行組方分析，隨方?jīng)Q定測(cè)定主藥，選擇合適的檢測(cè)指標(biāo)，是目前質(zhì)量分析方法的特點(diǎn)之一。 在進(jìn)行質(zhì)量分析時(shí)首先以中醫(yī)理論和用藥原則為指導(dǎo)，進(jìn)行組方分析，按功能主治分出主、輔、從、次藥味和藥群，選擇某合適的化學(xué)成分為指標(biāo)來(lái)說(shuō)明其與質(zhì)量的關(guān)系。 三、影響中藥制劑質(zhì)量的因素 (一)原料藥材的品種、規(guī)格、產(chǎn)地、藥用部位、采收季節(jié)、加工方法的影響 (二)炮制方法的影響 （三）生產(chǎn)工藝的影響 (四)中藥制劑的包裝、貯藏、保管的影響 四、中藥制劑質(zhì)量控制的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 一）國(guó)外藥物分析發(fā)展趨勢(shì) 基本的方法

3、主要為：分離分析法、電化學(xué)法、光譜法和聯(lián)用分析方法等。 各種色譜及其聯(lián)用技術(shù)已成為占主導(dǎo)地位的常規(guī)分析方法，如HPTLC、HPLC、GC、HPCE、LC-MS聯(lián)用等。 體內(nèi)藥物分析研究，趨向于采用在線的聯(lián)用微透析分析技術(shù)，如on-line MD-CE、on-line MDLC等。 手性藥物作為化學(xué)藥物的特殊群體，以HPLC和CE為主要拆分手段的手性藥物分析方興未艾，已成為全世界藥物分析的研究熱點(diǎn)。 二）國(guó)內(nèi)中藥制劑分析現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì) 1、國(guó)內(nèi)中藥制劑分析現(xiàn)狀 1）光譜法的應(yīng)用 A 比色法 如丹參素/丹參注射液，阿魏酸/當(dāng)歸浸膏-定量 B 紫外-可見(jiàn)分光光度法 單波長(zhǎng)法 如蒽醌/何首烏，香豆素/

4、祖師栗膏-定量 ； 雙波長(zhǎng)法 靛藍(lán)、靛玉紅/喉痛消炎丸-定量 ； 三波長(zhǎng)法 小檗堿/三黃片-定量 ； 一階導(dǎo)數(shù)光譜法 綠原酸/感冒咳嗽沖劑，麻黃堿/哮喘丸-定量 二階導(dǎo)數(shù)光譜法 膽酸/清宮沖劑，血竭/七厘散-定量； 三階導(dǎo)數(shù)光譜法 氫溴酸東莨菪堿/中麻2號(hào)注射液-定量。等 C 熒光法 丹參素/丹參注射液 D 紅外分光光度法 -體、-體/山道年；番木鱉堿、馬錢(qián)子堿/馬錢(qián)子 E 質(zhì)譜法 F 核磁共振光譜法 2）色譜法的應(yīng)用 A 紙色譜法 已較少應(yīng)用； B 薄層色譜法 應(yīng)用廣泛； C 棒狀薄層色譜法 小檗堿/復(fù)方黃柏制劑、人參皂甙/人參、膽酸和去氧膽酸/熊膽-定量； D 氣相色譜法 揮發(fā)性成分定量

5、冰片/復(fù)方丹參片/牛黃解毒丸/冠心蘇合丸等； 厚樸酚、和厚樸酚/藿香正氣水，麻黃堿/葛根湯； E 高效液相色譜法 應(yīng)用廣泛，以反相HPLC為主； 黃連素/半夏瀉心湯，紅景天甙/紅景天口服液，甘草酸/千金升白沖劑等。 3）電化學(xué)分析法的應(yīng)用 A 庫(kù)侖法 B 電位法 藥物電極測(cè)定法和電位溶出分析法 4）其他 A 原子吸收光譜法和冷原子技術(shù) B 原子發(fā)射光譜 C X射線分析法 目前，中藥體系存在的突出問(wèn)題具體表現(xiàn)在：(1)定量分析指標(biāo)與其主要藥效作用間缺乏相關(guān)性；(2)與化學(xué)藥物相比，中藥是一個(gè)由多成分、多因素構(gòu)成的復(fù)雜體系，目前還沒(méi)有建立起一套有效的中藥復(fù)雜體系定量分析標(biāo)準(zhǔn)。 2。國(guó)內(nèi)中藥制劑分析

6、發(fā)展趨勢(shì) (1)中藥有效成分的篩選與確定；應(yīng)用仿生學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的理論和進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，從分子、基因、受體、組織和整體水平系統(tǒng)準(zhǔn)確地確定中藥復(fù)雜體系中的藥效物質(zhì)； (2)中藥有效成分的提取與分析；中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，而且有效成分也具有相對(duì)性。為了高效率地提取中藥有效成分，應(yīng)用各種現(xiàn)代提取技術(shù)，如SFE、SWE、UAE等，可用于中藥復(fù)雜體系中有效成分的提取，利用準(zhǔn)確的儀器分析方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，通過(guò)因子分析方法對(duì)中藥復(fù)雜體系進(jìn)行定性定量評(píng)價(jià)； (3)中藥藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥理論相關(guān)性研究；利用現(xiàn)代分析方法研究中藥復(fù)雜體系中藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥理論的定量關(guān)系，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，闡明其作用機(jī)制

7、，在此基礎(chǔ)上對(duì)中藥及其復(fù)方進(jìn)行全面質(zhì)量控制。 第二節(jié) 中藥制劑分析工作的基本程序 中藥制劑分析程序一般可分取樣、測(cè)試樣品溶液的制備和測(cè)定（包括定性鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定）等。 一、 取樣 1供試品要具有代表性：原則是均勻、合理。 2嚴(yán)格按照規(guī)定的取樣方法進(jìn)行取樣：一般應(yīng)從每個(gè)包裝的四角和中央五處取樣，深度可達(dá)1/32/3處。取得的樣品裝入清潔、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批號(hào)、數(shù)量、取樣日期及取樣人。 3抽取供試品的數(shù)量：各類中藥制劑取樣大致是至少夠3次檢驗(yàn)的用量。貴重藥品可酌情取樣。 粉狀制劑（散劑、顆粒劑）一般取樣100g，可從包裝的上、中、下三層及周圍間隔相等部位

8、取樣若干，將所得樣品混勻，按四分法從中取出所需供試量。 液體制劑（口服液、藥酒、糖漿、酊劑等）一般取樣200ml。同時(shí)須注意均勻取樣。 固體中成藥（丸劑、片劑）成品取樣一般為100g，壓片后取樣200片。丸劑一般取10丸。 膠囊劑 稱取不少于20個(gè)膠囊，傾出其中的藥料，稱定空膠囊的重量，由總重中減去，即為膠囊內(nèi)藥料的重量。依標(biāo)示量及供試量稱取部分藥料供分析。一般取樣量為100g。 注射液的取樣，灌注、熔封，滅菌前后應(yīng)經(jīng)過(guò)兩次分析。灌封前將注射液混合均勻，如 液體取樣原則取樣，再按標(biāo)示量及供試量分別取部分進(jìn)行檢驗(yàn)；經(jīng)滅菌后的注射液須按原來(lái)的方法進(jìn)行分析檢驗(yàn)。已封好的安瓿，取樣量一般為200支。

9、其它劑型的中成藥，可根據(jù)具體情況隨意抽取一定數(shù)量，作為隨機(jī)抽樣。 供試樣品檢驗(yàn)完畢，應(yīng)保留一半數(shù)量作為留樣觀察。 二、測(cè)試樣品溶液的制備 中藥制劑測(cè)試樣品溶液的制備一般分為提取、分離、凈化等過(guò)程。 1.中藥制劑樣品的提取 冷浸法，61020倍藥重溶劑，稱重，浸泡122448小時(shí)，稱重,，等分取樣或取總樣測(cè)定。適宜遇熱不穩(wěn)定的有效成分； 連續(xù)回流法，樣品置索氏提取器中，利用溶劑反復(fù)提取，提取效率高，溶劑少，遇熱不穩(wěn)定的有效成分不宜用此法； 超聲波提取法，樣品置容器中，溶劑提取，效率高，一般樣品30min內(nèi)即可完成。 2中藥制劑樣品的預(yù)處理 液-液萃取法: 溶劑直接萃取、離子對(duì)萃取，操作繁，易乳化

10、。 沉淀法： 采用某些試劑沉淀雜質(zhì)或沉淀待測(cè)成分。 蒸餾法： 利用待測(cè)成分或其分解產(chǎn)物具有揮發(fā)性的特點(diǎn)，采用蒸餾法、收集餾液進(jìn)行含量測(cè)定，必須明確測(cè)定成分的結(jié)構(gòu)才可用此法。 色譜法（液-固萃取法），常用凈化劑有三氧化二鋁、氧化鎂、硅膠、活性炭、大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂、硅藻土、鍵合相硅膠C18、C8等。 其中離子交換樹(shù)脂、硅藻土、鍵合相硅膠C18、C8等目前有較多商品預(yù)處理柱，使用方便，操作簡(jiǎn)單，凈化效率高。 三、定性鑒別、檢查和含量測(cè)定 1定性鑒別 1）性狀鑒別系指中成藥的形狀、顏色、氣味等，凡藥典收載品，在藥典中均有規(guī)定，可按要求進(jìn)行檢查。 2）顯微鑒別 因?yàn)楹兄兴幵鄣闹谐伤幘Ａ糁兴幉?/p>

11、的顯微特征?？梢酝ㄟ^(guò)這些特征，對(duì)中成藥進(jìn)行定性鑒別。 3）理化鑒別 藥典中常用的方法有：熒光法、顯色法、沉淀法、微量升華法；紙色譜法、薄層色譜、液相色譜、氣相色譜等。 中藥定性鑒別應(yīng)選擇其中主藥（君藥）、輔藥（臣藥）作為主要對(duì)象，其次應(yīng)鑒別毒劇藥及貴重藥材。 2檢查 按我國(guó)藥典要求，中藥制劑需要檢查的項(xiàng)目大致可分為三類： 1）污染型 中成藥一般雜質(zhì)檢查項(xiàng)目有：異物、灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽等；衛(wèi)生學(xué)檢查：微生物細(xì)菌檢查；以及有的產(chǎn)品要求農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。 2）特殊雜質(zhì)型 原料藥材摻假、有毒成分的限量檢查。 3）劑型的要求檢查類型（制劑通則要求檢查項(xiàng)目） 中成藥一般質(zhì)量要求的檢查有：揮發(fā)

12、油測(cè)定、水分測(cè)定（固體制劑）、乙醇含量測(cè)定、總固體、相對(duì)密度、pH值（酊劑、藥酒）、裝量差異（片重差異）、崩解度（片劑、膠囊劑）、熔點(diǎn)測(cè)定、旋光度測(cè)定等。 3含量測(cè)定 中成藥含量測(cè)定所采用的方法除經(jīng)典的重量法、容量法(包括中和法、容量沉淀法、絡(luò)合滴定法、氧化還原法及非水溶液滴定法等)外，還可采用電位法、庫(kù)倫滴定法、比色法、可見(jiàn)-紫外分光光度法、紅外分光光度法、液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、雙波長(zhǎng)薄層掃描法等。 1）對(duì)有效成分明確的中藥制劑要進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定。 2）大致明確有效成分，要求測(cè)定這些成分的總量。 3）對(duì)有效成分已知但無(wú)理想的測(cè)定方法的中藥制劑，可通過(guò)測(cè)定其

13、中某些化學(xué)成分的含量間接控制有效成分的含量。 4）對(duì)有效成分不明確的中藥制劑可采用以下方法：選擇可能的有效成分或主要成分（指示性成分）進(jìn)行含量測(cè)定；測(cè)定藥物的總固體量；選擇在原料加工炮制時(shí)或制備、貯存過(guò)程中易損失、破壞的成分進(jìn)行含量或限量測(cè)定。 5）中藥制劑中含有劇毒性成分則要測(cè)定其含量。 6）貴重藥材在制劑中投料量應(yīng)加以測(cè)定。第二章 中藥制劑定量分析方法 第一節(jié) 可見(jiàn)-紫外光譜法 一、單一物質(zhì)的定量 定量依據(jù)是Beer-Lambert定律，A=lC。測(cè)定單一物質(zhì)時(shí)，先測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，然后選擇最大吸收峰的波長(zhǎng)max進(jìn)行定量分析。 一個(gè)物質(zhì)若有幾個(gè)吸收峰時(shí)，可選擇吸收峰較高，在此吸收峰處吸光

14、度隨波長(zhǎng)變化較小，并且其它物質(zhì)無(wú)吸收的波長(zhǎng)作為定量條件。 一般不選擇光譜最左邊的末端吸收峰作定量測(cè)定的波長(zhǎng)。常用定量方法： 1.對(duì)照法 C樣=C標(biāo)A樣/A標(biāo)；C標(biāo)A樣/（A標(biāo)C樣）=樣品%，C樣和C標(biāo)分別為樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品濃度，C樣為樣品標(biāo)示濃度。 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度-濃度曲線求得樣品濃度。 二、 混合物的含量測(cè)定 一） 混合物中有a，b兩種組分，若兩者的最大吸收峰不重合，且在a的1max處，b無(wú)吸收；在b的2max處，a無(wú)吸收?？煞謩e在1max、2max處用單一物質(zhì)的定量方法從混合物中測(cè)定a、b的濃度。 二） 混合物中有a，b兩種組分，吸收光譜部分重疊，在a的1處，b無(wú)吸收；在b

15、的2處，a有吸收。先在2處測(cè)定總吸收Aa+b，再在1處測(cè)定Aa1；先從Aa1直接求出a的濃度，根據(jù)a的濃度求出Aa2。再?gòu)腁a+b減去Aa2后求得Ab2，就可求得b的濃度。 （三）雙波長(zhǎng)測(cè)定法 中藥制劑分析中常用的方法為等吸收波長(zhǎng)法和系數(shù)率法。 1等吸收波長(zhǎng)法 1）基本原理 根據(jù)左圖選出兩個(gè)波長(zhǎng)1與2，其選擇原則 是干擾組分a在1與2處吸收度相等，即 Aa1= Aa2。而待測(cè)組分b在1與2處的差吸 收度A應(yīng)比較大，再在1與2處測(cè)混合組分 溶液的差吸度A。 設(shè)1為參比波長(zhǎng)，2為測(cè)量波長(zhǎng)，則 等吸收波長(zhǎng)法原理示意圖 A=Aa+b2 - Aa+b1 =（Aa2 + Ab2）-（Aa1 + Ab1）

16、=Ab2 - Ab1 =（b2 - b1）CbL 2）應(yīng)用舉例 喉痛消炎丸中靛藍(lán)、靛玉紅的測(cè)定 ）選擇等吸收波長(zhǎng)：用28g/ml的靛藍(lán)及靛 玉紅的氯仿溶液在分光光度計(jì)上掃描，并用同 法掃描出空白樣品溶液的吸收曲線。 從左圖可知靛藍(lán)在540nm、634.4nm處有合適 的等吸收波長(zhǎng)；靛玉紅卻是在5142nm和 566nm處有等吸收波長(zhǎng)，而空白樣品液在上述 波長(zhǎng)處的吸收曲線幾乎成一條直線、不干擾測(cè) 圖2-1-3 靛藍(lán)、靛玉紅的吸收曲線 (1)靛藍(lán)(2)靛玉紅(3)無(wú)青黛樣品 定，選取靛藍(lán)的測(cè)定波長(zhǎng)s1566 nm、參比波長(zhǎng)R1=514.2 nm?？蛇x靛玉紅的測(cè)定波長(zhǎng)s2=540nm、參比波長(zhǎng)R2=

17、634.4nm。 )標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取靛藍(lán)對(duì)照品溶液0.25、0.50、2.0ml；靛玉紅對(duì)照品溶液0.20、0.40、1.40ml，分別放入10ml量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，分別在上述等吸收波長(zhǎng)處測(cè)其差吸收度： A1=A566nm - A514.2nm ； A2=A540nm - A634.4nm ； 然后用A對(duì)C作標(biāo)準(zhǔn)曲線；并求出其一元回歸方程： A10.02241C1 (r11.0000) A20.04060C2 + 0.0055 (r21.0000) )含量測(cè)定：精稱喉痛消炎丸細(xì)粉約0.2g于索氏提取器中，用氯仿提取至無(wú)藍(lán)色，用氯仿定容于50ml量瓶中，再精密吸取5ml置10ml量瓶中

18、，加氯仿至刻度即為樣品溶液。將樣品溶液在s1與R1，處測(cè)出A樣1值，用以上A1式求出靛藍(lán)的濃度及樣品中靛藍(lán)的含量。同樣，在s2與R2處測(cè)出A樣2，用以上A2式求出靛玉紅的濃度及樣品中靛玉紅的含量。 2 聯(lián)立方程法 A a+b1=Aa 1+Ab 1=a 1 CaL+ b 1 CbL A a+b2=Aa 2+Ab 2=a 2 CaL+ b 2 CbL （四）三波長(zhǎng)測(cè)定法 此法要求在任一吸收曲線上，能找出滿足下述條件的三個(gè)波長(zhǎng)：即在干擾組分的吸收曲線上，與三個(gè)波長(zhǎng)相應(yīng)的點(diǎn)，能在一條直線上。 1基本原理 左圖中1、2、3為在任一吸收曲線上，任意 選擇的三個(gè)波長(zhǎng)。A1、A2、A3為在三個(gè)波長(zhǎng)處 分別測(cè)出

19、的吸收度。 根據(jù)相似三角形的等比性質(zhì)，可推導(dǎo)出下式， A= A2 - （m A1+nA3）/（m + n） =2 （m1 + n3）/（m + n）CL 三波長(zhǎng)分光光度法的原理 說(shuō)明A與待測(cè)組分濃度C成正比。 2應(yīng)用舉例 二陳丸中陳皮甙的測(cè)定 1）總干擾組分的制備及其吸收光譜 )除去陳皮甙后，陳皮其他組分提取液的制備：用溶劑(含0.1氫氧化鈉的75乙醇液)提取陳皮粉，提取液經(jīng)薄層分離，刮取除陳皮甙以外的所有斑點(diǎn)洗脫，得除陳皮甙以外陳皮其他組分提取液(I)。 )二陳丸空白粉提取液的制備：按處方比例 配制除陳皮以外的二陳丸空白粉，用上述溶 劑提取，得二陳丸空白粉提取液()。 將(I)、()按處方比

20、例混合，得二陳丸總干 擾成分液()。分光光度計(jì)分別測(cè)定陳皮甙對(duì) 照品和()的吸收光譜。見(jiàn)左圖。其他成分對(duì) 陳皮甙的測(cè)定有干擾，用6批不同來(lái)源的原料按上法制備()，并測(cè)其吸收光譜，結(jié)果譜形相似?？刹捎萌ㄩL(zhǎng)法消除干擾。 2）選擇三個(gè)測(cè)定波長(zhǎng) 作圖法粗選，再計(jì)算精選在()的A=0處，即為精選的三個(gè)波長(zhǎng)：1=318.0nm，2=286.0nm，3=275.0nm。 3）標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制不同濃度的陳皮甙對(duì)照品溶液，在選出的三個(gè)波長(zhǎng)處，分別測(cè)定吸收度，并算出A值，對(duì)A值與濃度C進(jìn)行直線回歸，回歸方程為： A = 9.9059C 0.0024(r = 0.9990) 4）樣品測(cè)定 精密稱取二陳丸細(xì)粉約0.1

21、g，加100.0ml上述溶劑浸泡提取15小時(shí)，過(guò)濾，取續(xù)濾液2.0ml，用溶劑稀釋至5.0ml，在選出的三波長(zhǎng)處，分別測(cè)定吸收度，計(jì)算其A值，再按回歸方程算出陳皮甙含量。本法平均回收率：98.28，RSD：2.12。 （五）差示光譜法 1基本原理 差示光譜法的關(guān)鍵有二，其一，提供一個(gè)近似理想的參比溶液。其二，使待測(cè)組分發(fā)生特征光譜變化，而賦形劑或其他共有組分卻不引起光譜變化，因而可消除它們的干擾。 設(shè)Ax、Ay分別代表兩種不同介質(zhì)中待測(cè)組分在測(cè)定波長(zhǎng)處的吸收度，Az代表背景和干擾組分的吸收度，其不受測(cè)定介質(zhì)改變的影響。根據(jù)吸收度加和性原理，則 A=A樣 - A參=(Ax +Az)-(Ay +

22、Az)= Ax - Ay =(x - y)CL 差示光譜中的振幅，即最大吸收與最小吸收之差值，也可進(jìn)行定量測(cè)定，這可提高本法的專屬性。 2應(yīng)用舉例 差示光譜法測(cè)定含牛黃的中成藥中膽紅素的含量 1）測(cè)定原理 膽紅素具有高度共軛體系結(jié)構(gòu)，在波長(zhǎng)453nm處為最大吸收，在可見(jiàn)光照射下膽紅素易氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在453nm處吸收度顯著降低。 2）選用日光下照射30分鐘或在紅外燈下照射4小時(shí)測(cè)A值。 3）精密稱取膽紅素2mg于50ml棕色量瓶中， 加入適量冷(10以下)的酸性氯仿(150ml氯 仿中含0.05ml濃鹽酸)，于冰水浴中超聲振 蕩20分鐘，稀釋至刻度，制成儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確 吸取0，4、08、1，2

23、、1.6、2.0ml儲(chǔ)備液 于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，測(cè)其 光照前后在453nm處的吸收度。回歸方程 膽紅素在酸性氯仿溶液中的吸收光譜 為A=0.0804C + 0.00570(r=0.9995)。 a光照前 b光照后 除光照反應(yīng)外，其余操作均需避光。 4）分別制得六應(yīng)丸、六神丸、牛黃消炎丸的空白樣品對(duì)照液，在453nm處測(cè)得各自光照前后的A值，計(jì)算A。實(shí)驗(yàn)表明三種成藥A值為零或幾乎為零。說(shuō)明其他干擾組分在以上光照條件下不干擾膽紅素的測(cè)定。 5）精密稱取六應(yīng)丸、六神丸各60mg，牛黃消炎丸120mg置10ml帶塞的試管中，準(zhǔn)確加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振蕩20分鐘，過(guò)濾，棄去

24、初濾液，測(cè)續(xù)濾液光照前后的A值，算出A值。由回歸方程算得樣品的含量。 本法加樣回收率：六應(yīng)丸為98.8，RSD=1.8；六神丸為100.7，RSD=2.2；牛黃消炎丸為93.0，RSD1.1。 （六）導(dǎo)數(shù)光譜法 1導(dǎo)數(shù)光譜及其特征 通常的吸收光譜，其吸收度是波長(zhǎng)的函數(shù) A=CE=C（）。對(duì)波長(zhǎng)求導(dǎo)，將其微分系 數(shù)（dnA/dn）對(duì)波長(zhǎng)掃描可得導(dǎo)數(shù)光 譜圖。 特征： (1)導(dǎo)數(shù)光譜的階數(shù)愈高，峰形愈尖銳且數(shù) 量亦增多。 (2)在零階光譜的極大處，其相應(yīng)的奇階光 譜通過(guò)零點(diǎn)。在零階光譜的兩拐點(diǎn)處，奇階 導(dǎo)數(shù)光譜為極大或極小。 (3)偶階導(dǎo)數(shù)光譜的形狀與零階光譜類似， 零階光譜的峰值對(duì)應(yīng)于偶階導(dǎo)數(shù)光

25、譜的極值， 零階光譜的拐點(diǎn)在偶階導(dǎo)數(shù)光譜中通過(guò)零點(diǎn)。 (4)導(dǎo)數(shù)光譜譜帶的極值數(shù)等于導(dǎo)數(shù)階數(shù)加1。 高斯曲線及其一至四階導(dǎo)數(shù)曲線 導(dǎo)數(shù)分光光度的優(yōu)點(diǎn)：a能檢出兩個(gè)或兩個(gè)以上的重疊吸收帶； b能分辨在強(qiáng)吸收曲線“肩部”的弱吸收帶； c能精密確定單一吸收峰位置； d能消除基線（背景）的影響； e能進(jìn)行定量測(cè)定。 2基本原理 吸收光譜服從Beer定律： ACL 根據(jù)導(dǎo)數(shù)光譜的定義，對(duì)上式求導(dǎo)，則： dA/d=（d/d）CL；d2A/d2=（d2/d2）CL； dnA/dn=（dn/dn）CL； 式中L為定值，給定物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處的d/d、d2/d2dn/dn也是定值，因此，dA/dC，d2A/d2C

26、dnA/dnC。 常用的定量參數(shù)的選擇方法有： 1）峰-谷法 測(cè)量相鄰峰、谷之間的距離。 左圖中的h1h2(振幅，用D表示)。 2）基線法 取相鄰二同向峰(正或倒)的 公切線為基線，以中間的反向峰峰尖至基線 的距離為測(cè)量值。左圖中p1。 3）峰-零法 測(cè)量峰值到零線間的垂直距 離，左圖中p2。 4）面積法 根據(jù)一階或二階導(dǎo)數(shù)光譜面 導(dǎo)數(shù)光譜的測(cè)量 積， 進(jìn)行定量測(cè)定。 3共存組分干擾吸收的消除 1）一階導(dǎo)數(shù)光譜法消除線性干擾吸收 A= CL + a + b dA/d= （d/ d）CL + a 說(shuō)明線性干擾在一階導(dǎo)數(shù)光譜中對(duì)定量參數(shù)D(振幅)沒(méi)有影響，D只與待測(cè)組分濃度成正比。 D=( dA/

27、d)峰 -( dA/d)谷 =( d/ d) 峰- (d/ d) 谷CL 2）高階導(dǎo)數(shù)光譜法消除非線性干擾吸收及用于重疊峰的分離，定量 若干擾組分吸收對(duì)波長(zhǎng)呈非線性，為一近似的二次吸收曲線，則總吸收度為 A= CL + e2 + f + g 對(duì)其求一階、二階導(dǎo)數(shù)得： dA/d=（d/ d）CL +e + f d2A/d2=（d2/ d2）CL +e 4.導(dǎo)數(shù)光譜法中的主要參數(shù) 1)微分階數(shù)(n) n的選擇主要由干擾組分吸收曲線的形狀而定。 n越大，分辨力愈強(qiáng)，但信噪比將降低。 2)波長(zhǎng)間隔() 愈大，測(cè)量靈敏度增大，但分辨率降低，通常選12nm為好。 3)中間波長(zhǎng)(m) 通常需選兩個(gè)m，即m1

28、、m2 。其選擇原則：待測(cè)組分的導(dǎo)數(shù)曲線在m1、m2處的形狀易辨認(rèn)，較特征；而干擾組分在此處的導(dǎo)數(shù)值相等或相近。 5.應(yīng)用舉例 1)肺露中丹皮酚含量的測(cè)定 ()干擾丹皮酚測(cè)定情況的考察： 按處方配比，分別取藥材，加水適量，蒸餾提制成22味藥材的模擬液，以水為空白，分別繪制紫外吸收光譜圖。 從圖中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸收很強(qiáng)，枇杷葉和蘆根蒸提液紫外吸收較弱，干擾丹皮酚的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)表明：丹皮酚在堿性溶液中的吸收光譜發(fā)生紅移，= 352nm。 1牡丹皮 2枇杷葉 3蘆根 ()選擇測(cè)定波長(zhǎng) 精取丹皮酚對(duì)照液2ml，枇杷葉和蘆根蒸提液各10ml，分別于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻

29、度，混勻。以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，繪制吸收光譜（零階）和一階導(dǎo)數(shù)光譜，如下圖。按中間波長(zhǎng)選擇原則，選330和370nm為中間波長(zhǎng)，則測(cè)定波長(zhǎng)為328nm和332nm，368nm和372nm。蒸提液在0.1molL氫氧化鈉溶液中的光譜圖 一階導(dǎo)數(shù)光譜圖1肺露 2丹皮酚 3枇杷葉 4蘆根 1丹皮酚 2枇杷葉 3蘆根 ()標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取丹皮酚對(duì)照液(0.1mg/ml)0.5、1.0、3.0ml，分別于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，計(jì)算一系列A值。A =(A328 - A332) - (A368

30、 - A372)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為： A = -11.08C + 0.0009 （r = 0.9997） ()樣品測(cè)定 取同一批號(hào)或不同批號(hào)樣品，分別精密量取10ml于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)其吸收度，算出A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算樣品中丹皮酚含量。 本法平均回收率99.57，RSD=0.82%。 2）清宮沖劑中膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定法 （）干擾情況的考察 膽酸對(duì)照液與樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示，在397nm，386nm波長(zhǎng)處有相應(yīng)的吸收峰和吸收谷。陰性樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜呈近乎平直線條，見(jiàn)下左圖。豬去

31、氧膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜將360420nm區(qū)間的吸收消除為二次無(wú)關(guān)吸收，不干擾樣品中膽酸的含量測(cè)定如下中圖。下右圖表明，膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜，其峰-谷振幅值D與濃度具有良好的線性關(guān)系，因此，可用397nm，386nm兩波長(zhǎng)的振幅D為定量參數(shù)，用峰-谷法進(jìn)行測(cè)定。 樣品，膽酸對(duì)照品溶 膽酸、豬去氧膽酸二 對(duì)照品溶液 液二階導(dǎo)數(shù)光譜 階導(dǎo)數(shù)光譜 二階導(dǎo)數(shù)光譜A樣品 B. 膽酸對(duì)照品 C.陰性樣品 1膽酸 2豬去氧膽酸 ()測(cè)定條件 零階光譜掃描波長(zhǎng)：190550nm；二階導(dǎo)數(shù)光譜掃描波長(zhǎng)，360420nm；=5nm。 ()標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱定膽酸對(duì)照品約30mg，置100ml量瓶中，加入60醋酸稀釋至刻度，

32、分別精密吸取0.1、0.21.0ml于15ml具塞刻度試管中，加60醋酸至1.0ml，加入稀硫酸140ml，搖勻，70水浴中放置20分鐘，取出靜置20分鐘后，用1.0ml 60醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白，測(cè)二階導(dǎo)數(shù)光譜。中間波長(zhǎng)397nm，386nm，測(cè)出各峰-谷振幅值D，得回歸方程： D= 57.3066C 0.1547(r=1000) ()樣品測(cè)定 精密稱取約2.5g樣品粉末加50ml氯仿回流提取4小時(shí)，常壓回收氯仿至干，用60醋酸溶解，定容于10ml量瓶中，精密吸取1.0ml樣品液于15ml具塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測(cè)峰-谷振幅值D，按回歸方程計(jì)算樣品中膽酸含量。 本法

33、平均回收率：102.9，RSD0.6。第二節(jié) 薄層色譜法 薄層色譜法(TLC)是一種微量的分離分析技術(shù)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，檢出靈敏，測(cè)定快速，應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。 薄層色譜定量的方法可分為二類，一類是薄層洗脫定量法，將被測(cè)化合物從薄層上洗脫下來(lái)，萃取后，再選擇適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定。另一類是在展開(kāi)后的薄層上直接進(jìn)行測(cè)定。 一、薄層洗脫定量 1點(diǎn)樣 在薄層板的起始線上，將定量的樣品液點(diǎn)成一條狀，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)避免任何損失。在板的兩邊，點(diǎn)上對(duì)照品作為定位劑，如圖A，然后，在選好的溶劑中層開(kāi)，斑點(diǎn)要集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象。 2定位 對(duì)本身有顏色的化合物可直接定位，對(duì)有熒光的化合物可在紫外光下觀察定位，對(duì)多數(shù)無(wú)色化合物不可

34、在薄層上直接噴顯色劑定位，此時(shí)，應(yīng)將待測(cè)組分的薄層部分用玻璃板懸空蓋住后再噴，這樣可利用兩邊的對(duì)照點(diǎn)顯色定位。 3捕集、洗脫和測(cè)定 定位后，應(yīng)捕集洗脫，若為軟板，可將待測(cè)組分的帶狀區(qū)域用捕集器收集，如圖 (B)。若為硬板，可直接用捕集器收集，也可用刀片將樣品區(qū)帶的吸附劑定量地刮下，再用合適溶劑洗脫后，進(jìn)行定量測(cè)定，如圖 (C)。 洗脫溶劑，一般應(yīng)選極性較大，對(duì)待測(cè)化合物溶解度亦較大的溶劑，如乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇等，在單一溶劑洗脫效果欠佳時(shí)，可采用混合溶劑。 洗脫方法可采用滲濾法、多次浸出法、加熱溫浸法、索氏回流提取法等。對(duì)不易洗脫的化合物，也可不經(jīng)洗脫，在吸附劑中加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使其

35、定量反應(yīng)，然后離心或過(guò)濾后再進(jìn)行測(cè)定。 二、薄層上直接定量 薄層上直接定量的方法有目測(cè)法、測(cè)面積法、儀器測(cè)量法。，目前，用薄層掃描儀掃描測(cè)定斑點(diǎn)中化合物含量的方法已成為薄層定量的主要方法，此法也可用于紙色譜、電泳凝膠及其他介質(zhì)的色譜。 (一)測(cè)定原理與方法 1吸收測(cè)定法 (1)Kubelka-Munk原理及方程： 當(dāng)強(qiáng)度為I0的單色光照射到厚度為X的薄層后，其情況如下圖所示。 I0為入射光強(qiáng)度 i（x）為x處的透射光強(qiáng)。j（x）為x處的反射光強(qiáng)。X為固定相厚度。 Kubelka-Munk指出，當(dāng)強(qiáng)度為I0的單色光照射到厚度為X的薄層后，光的反射和透射符合下述微分方程： -di/dX = -(S

36、 + K)i + Sj dj/dX = -(S + K)j + Si S：?jiǎn)挝缓穸缺庸潭ㄏ嗟纳⑸湎禂?shù)；K為薄層色譜斑點(diǎn)或單位厚度薄層固定相的吸收系數(shù)；X為由載板表面算起的薄層厚度。 i與j的一般解為： i = Asinh(bSx) + Bcosh(bSx) j = (aA - bB)sinh(bSx) + (aB - bA)cosh(bSx) A，B常數(shù)，a=（S+K）/S，b=（a2 - 1）1/2 ，Sinh=（ex - e-x）/2；Cos= （ex + e-x）/2，A/B=a/b。 為討論方便，一般計(jì)算邊界的i和j，即薄層下表面的透射光和上表面的反射光。 X=0時(shí)，j= 0，i =

37、I0T X=X時(shí)，i =I0，j=I0R 則 T =b/asinh（bSX） + bcosh（bSX） R = sinh（bSX）/asinh（bSX） + bcosh（bSX） SX稱作散射參數(shù)，它與薄層厚度、散射系數(shù)有關(guān)。Merck硅膠板的SX=3，青島硅膠板SX3，日本和光硅膠F板SX=7。 SX數(shù)值大小直接影響薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度-濃度曲線偏離Beer定律的程度。 薄層色譜斑點(diǎn)中物質(zhì)的含量包含于a及b兩個(gè)參數(shù)中， 已知a=（S+K）/S，b=（a2 - 1）1/2 ，乘以X，則 a= （SX+KX）/SX b= KX（2SX+KX）1/2/SX KX為吸收參數(shù)，相當(dāng)于薄層色譜單位面積中

38、物質(zhì)的含量（ g/cm2），即KX=C。 薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度： 理想的空白薄層板的K=0，但一般K0。為消除影響，通常以空白板為基準(zhǔn)，測(cè)定相對(duì)透光率及相對(duì)反射率來(lái)計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度。 透射法 A= -lg（T/T0） 反射法 A= -lg（R/R0） -lgT/T0或-lgR/R0為儀器檢測(cè)部分所獲得的信號(hào)，它們和KX間的關(guān)系曲線相當(dāng)于一般分光光度法中的A-C曲線，在溶液中，A-C曲線為一直線，而在薄層上，-lgT/T0或-lgR/R0和濃度間不呈線性關(guān)系，比較下圖可以看出彎曲度隨SX增加而增加。 不同SX時(shí)，吸光度與KX間關(guān)系曲線 a透射法測(cè)定-lgT/T0與KX間關(guān)系 b反射法測(cè)定

39、-lgR/R0與KX間關(guān)系 目前對(duì)Kubelka-Munk曲線處理采用兩類方法：曲線校直法和計(jì)算機(jī)回歸法。島津CS系列采用前者，CAMAG儀器采用后者。 1校正前的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線 曲線校直法是一種簡(jiǎn)便的薄層色譜掃描定量校準(zhǔn)方法，但比較粗糙，且有時(shí)難于知道薄層板的SX的準(zhǔn)確值。 2熒光測(cè)定法 熒光測(cè)定法的定量依據(jù)為： F=I0abC F為熒光強(qiáng)度；為熒光效率；I0為入射光強(qiáng)度；a為吸收系數(shù)；b為薄層厚度；c為樣品濃度。F與C成正比，二者之間存在線性關(guān)系。熒光測(cè)定法與吸收測(cè)定法不同，其測(cè)量值與斑點(diǎn)形狀無(wú)關(guān)。本身具有熒光或經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的化合物均可用本法測(cè)量。熒光測(cè)定法選擇性高，因激發(fā)光與熒光波長(zhǎng)均能加