家禽新城疫HAHI的免疫監(jiān)測(共10頁)

1、實(shí) 驗(yàn) 二 家禽具血凝性病毒(bngd)病的免疫監(jiān)測一、實(shí)驗(yàn)(shyn)目的1.掌握血凝性病毒(bngd)病免疫監(jiān)測的基本方法。2.學(xué)會(huì)根據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測的結(jié)果指導(dǎo)雞群血凝性病毒病免疫接種。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測抗原的HA效價(jià)及4個(gè)血凝單位抗原的配制。2.紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)檢測免疫禽只的HI抗體。3.根據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測的結(jié)果指導(dǎo)雞群相應(yīng)病毒病的免疫接種。三、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及材料1.抗原原液：購自標(biāo)準(zhǔn)廠家，根據(jù)監(jiān)測抗體的種類而確定抗原的種類。ND免疫監(jiān)測ND抗原；AI H5免疫監(jiān)測H5抗原；AI H9免疫監(jiān)測H9抗原；EDS76免疫監(jiān)測EDS抗原。2.被檢血清：隨機(jī)采取

2、被檢禽群的血液（抽樣比例約為12，或每個(gè)禽群抽取2040只），取血液自然凝固后析出的血清作為被檢血清。3.滅菌PBS生理鹽水，PH7.0，按常規(guī)配制。4.紅細(xì)胞懸浮液：采取健康公禽（被檢測血清為雞血清時(shí)，應(yīng)采用公雞，被檢血清為鴨、鵝血清時(shí)，應(yīng)采用公鴨）血液（每次可采510mL），抗凝，加滅菌PBS生理鹽水離心洗滌35次（每次離心的速度和時(shí)間為3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘，將血漿、白細(xì)胞等充分洗去，將沉淀的紅細(xì)胞用滅菌PBS生理鹽水稀釋成1懸浮液。該紅細(xì)胞懸浮液在4存放，可用35天。注意懸浮液顏色變暗應(yīng)予棄去。5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反應(yīng)板，普通離心機(jī)等。（以下內(nèi)容主要以ND的免疫

3、監(jiān)測為例，同學(xué)們可依此類推探討其他血凝性病毒病免疫監(jiān)測的相關(guān)技術(shù)）四、實(shí)驗(yàn)原理雞群ND免疫后，體內(nèi)可產(chǎn)生抗ND中和抗體及紅細(xì)胞凝集抑制抗體（HI抗體）。后者在體外可抑制NDV凝集紅細(xì)胞的能力。在一系列試管中，將被檢雞血清作連續(xù)稀釋，血清中HI抗體越高，則能使ND病毒凝集紅細(xì)胞能力完全抑制的血清稀釋度就越高。由于HI抗體與中和抗體的消長是基本一致的，故通過HI抗體水平的檢測可以達(dá)到ND免疫監(jiān)測的目的。五、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（微量法檢測ND抗原原液HA效價(jià)及配制4個(gè)血凝單位ND抗原）1.分裝生理鹽水：用移液器在96孔V型反應(yīng)板的一排孔上的112孔，每孔加入PBS生理鹽水25uL，換滴頭

4、；2.添加抗原：吸取標(biāo)準(zhǔn)ND抗原原液25uL加入第1孔，換滴頭；3.稀釋抗原：用25uL移液器將第1孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第2孔；用移液器將第2孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第3孔，如此，直至第11孔，從11孔吸取25uL溶液棄去，換滴頭；4.加入PBS生理鹽水：向1-12孔加入PBS生理鹽水，每孔25uL；5.加入紅細(xì)胞懸浮液：向1-12孔加入紅細(xì)胞懸浮液，每孔25uL；6.靜置感作20-30分鐘，然后判定結(jié)果；7.判定結(jié)果（觀察、判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)概念與方法）“凝集(nngj)”的概念：觀察反應(yīng)孔，當(dāng)一層紅細(xì)胞凝

5、集(nngj)顆粒均勻覆蓋于整個(gè)孔底，判定為“凝集(nngj)”（將反應(yīng)板傾斜，無紅細(xì)胞流淌現(xiàn)象），記錄為“+”。 “不凝集”的概念：觀察反應(yīng)孔，當(dāng)紅細(xì)胞完全自然沉降到孔底中央，形成一個(gè)邊緣光滑無凝集顆粒的紅圓點(diǎn)，判定為“不凝集”（將反應(yīng)板傾斜，有紅細(xì)胞流淌現(xiàn)象），記錄為“”。ND抗原的血凝效價(jià)的概念：凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋度稱為該ND抗原的血凝效價(jià)。判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的方法判定、記錄反應(yīng)結(jié)果時(shí)，可繪制一個(gè)表格，將試驗(yàn)情況與結(jié)果判斷作填寫。如下是一個(gè)ND抗原原血凝效價(jià)測定結(jié)果判定與記錄的例子，可作模仿?？滋?hào)123456789101112效價(jià)抗原稀析1：24816326412825

6、651210242048PBS對照1：64反應(yīng)圖像結(jié)果記錄+-84個(gè)血凝單位（4HAU）抗原的配制方法依據(jù)ND抗原原液的HA效價(jià)，用PBS生理鹽水將該抗原原液稀析為4HAU抗原（用于下述HI試驗(yàn)）。每mL抗原原液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為：該抗原原液效價(jià)的倒數(shù)除以4減1。如上例，抗原原液效價(jià)為1：64，則，每mL抗原原液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為64/4-1=15。（二）紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（微量法）檢測免疫禽只的HI抗體。1分裝PBS生理鹽水：在96孔反應(yīng)板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理鹽水25uL;2.向第1孔加入被檢血清；3.稀釋被檢血清: 用25uL移液器將第1孔中的

7、被檢血清與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第2孔；用移液器將第2孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第3孔，如此，直至第10孔，從10孔吸取25uL溶液棄去，換滴頭；4.加入4HAU抗原：向第1至第11孔加入4HAU ND抗原溶液，每孔25uL;5加入紅細(xì)胞懸液：向第1至第12孔加入1雞紅細(xì)胞懸浮液，每孔25uL，室溫中靜置2030分鐘，觀察結(jié)果并記錄。6. 判定結(jié)果（觀察、判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)概念與方法）“凝集”的概念：觀察反應(yīng)孔，當(dāng)一層紅細(xì)胞凝集顆粒均勻覆蓋于整個(gè)孔底，判定為“凝集”（將反應(yīng)板傾斜，無紅細(xì)胞流淌現(xiàn)象），記錄為“+”，讀作凝集。

8、“完全抑制”的概念：觀察反應(yīng)孔，當(dāng)紅細(xì)胞完全不凝集而自然沉降于試管底部中央，形成一個(gè)邊緣光滑的紅圓點(diǎn)，邊緣沒有分布紅細(xì)胞凝集顆粒，判定為完全抑制，記錄為“”，讀作完全抑制；被檢血清HI效價(jià)的概念：凡能使0.25mL 濃度4個(gè)凝集單位的ND抗原凝集紅細(xì)胞的能力完全抑制的血清最高稀釋度稱為該被檢血清的HI效價(jià)。判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的方法判定、記錄(jl)反應(yīng)結(jié)果時(shí)，可繪制一個(gè)表格，將試驗(yàn)情況與結(jié)果判斷作填寫。如下是2個(gè)被檢血清HA效價(jià)測定結(jié)果判定與記錄(jl)的例子，可作模仿。孔號(hào)123456789101112效價(jià)血清稀析 度1：2481632641282565121024抗原對照PBS對照1：25

9、6血清1反應(yīng)圖像結(jié)果記錄-+-血清2反應(yīng)圖像1：64結(jié)果記錄-+-（三）根據(jù)ND等血凝性病毒(bngd)病免監(jiān)結(jié)果指導(dǎo)雞群相應(yīng)病毒病免疫接種的步驟1計(jì)算禽群ND抗體合格率禽群ND抗體合格率的計(jì)算公式：ND抗體合格率=（被檢血清樣品數(shù)-抗體效價(jià)低于臨界滴度*的樣品數(shù)）/被檢血清樣品數(shù)100%。*注：ND抗體效價(jià)臨界滴度：雞群可抵抗NDV感染的ND抗體的最低滴度。這是一個(gè)由生產(chǎn)實(shí)際總結(jié)得出的數(shù)值，可因?qū)嶋H情況的變化而變化。目前，此值通常定為1：32。2.確定禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn) 禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn)也是一個(gè)由生產(chǎn)實(shí)際總結(jié)得出的數(shù)值，而且雞的日齡不同其標(biāo)準(zhǔn)有不同。目前各種日齡雞群能夠抵抗ND感染的的

10、抗體合格率參考標(biāo)準(zhǔn)為：1月齡以下的小雞，抗體合格率要求在85以上，且其余15的被檢雞只的抗體水平不低于1:5；中成雞群的抗體合格率應(yīng)在95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應(yīng)不低于1:5。3將被檢雞群抗體合格率對照禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn)，確定被檢雞群目前的免疫狀況，指導(dǎo)其進(jìn)一步的免疫接種。 如下為根據(jù)ND等血凝性病毒病免監(jiān)結(jié)果指導(dǎo)雞群相應(yīng)病毒病免疫接種的一個(gè)例子：某后備種雞群，18周齡，共3000只種雞，隨機(jī)采血20份，經(jīng)ND HI試驗(yàn)檢測，各樣品抗體水平情況如下表。請根據(jù)該免監(jiān)結(jié)果，對該指導(dǎo)雞群的ND免疫接種作指導(dǎo)。抗體效價(jià)1:640監(jiān)測只數(shù)13316600解：1計(jì)算雞群ND抗體合格率（臨界滴

11、度取1：32）：雞群ND抗體(kngt)合格率（被檢血清樣品數(shù)-抗體(kngt)效價(jià)低于臨界滴度*的樣品(yngpn)數(shù)）/被檢血清樣品數(shù)100%（20-4）/20100%80% 2. 確定禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn)：本雞群為中成雞群，中成雞群的抗體合格率標(biāo)準(zhǔn)為95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應(yīng)不低于1:5。3. 將被檢雞群抗體合格率對照禽群抗體合格率標(biāo)準(zhǔn)，確定被檢雞群目前的免疫狀況： 該被檢雞群的ND抗體合格率為80%，而中成雞群的抗體合格率標(biāo)準(zhǔn)是95%，故可見該雞群目前ND免疫狀況未及格，建議盡快給于ND疫苗的加強(qiáng)免疫接種。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1.扼要反映本實(shí)驗(yàn)步驟。2.報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)包括各被

12、檢血清樣品各孔的反應(yīng)結(jié)果和各被檢血清的HI效價(jià)，及應(yīng)用本試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)被檢雞群的ND臨床免疫接種。3.試指出應(yīng)用本技術(shù)對不同的血凝性病毒病作免疫監(jiān)測時(shí)，在材料、方法上有何異同。七、實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng) (參閱實(shí)驗(yàn)步驟)八、思考題家禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測技術(shù)有哪些關(guān)鍵點(diǎn)?請作扼要陳述。實(shí)驗(yàn)二 家禽具有血凝性病毒病的免疫監(jiān)測（以ND為例，兼顧各種病免疫監(jiān)測技術(shù)的特點(diǎn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握ND等家禽血凝性病毒病免疫監(jiān)測的基本方法。 2.學(xué)會(huì)根據(jù)ND免疫檢測的結(jié)果指導(dǎo)禽群的ND等血凝性病毒病免疫接種。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測抗原的HA效價(jià)。 2.紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)檢測免疫禽只的HI抗體。三、

13、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及材料 1.抗原：購自標(biāo)準(zhǔn)廠家，根據(jù)監(jiān)測抗體的種類而確定抗原的種類。ND免疫監(jiān)測ND抗原；鴿瘟（禽PMV-）免疫監(jiān)測PMV-抗原；AI H5免疫監(jiān)測H5抗原；AI H9免疫監(jiān)測H9抗原；EDS76免疫監(jiān)測EDS抗原。 2.被檢血清：隨機(jī)采取被檢禽群的血液（抽樣比例約為12，或每禽群抽取2040只），取其自然析出的血清作為被檢血清。3. 1紅細(xì)胞懸浮液：采取健康公禽血液（每次可采510mL），采血后抗凝，加生理鹽水離心洗滌35次（每次離心的速度和時(shí)間為3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘，將血漿、白細(xì)胞等充分洗去），將沉淀的紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋成1懸浮液，這種紅細(xì)胞液在4存放，可用35天。注

14、意懸浮液顏色變暗應(yīng)予棄去。紅細(xì)胞來源(liyun)，檢測雞血清雞紅細(xì)胞，檢測(jin c)鴨、鵝血清鴨紅細(xì)胞。 4.滅菌(mi jn)生理鹽水：pH7.07.2。 5.移液器（規(guī)格分別為0.1mL、0.4mL、0.5mL、1mL），20孔反應(yīng)板（每孔的體積為1mL），10mL注射器、玻璃鉛筆、剪刀、鑷子等。四、實(shí)驗(yàn)原理 雞群經(jīng)ND免疫后，體內(nèi)可產(chǎn)生抗ND中和抗體及紅細(xì)胞凝集抑制抗體（HI抗體）。后者在體外可抑制NDV凝集紅細(xì)胞的能力。在一系列試管中，將被檢雞血清作連續(xù)稀釋，血清中HI抗體越高，則能使ND病毒凝集紅細(xì)胞能力完全抑制的血清稀釋度就越高。由于HI抗體與中和抗體的消長是基本一致的，故通

15、過HI抗體水平的檢測可以達(dá)到ND免疫監(jiān)測的目的。五、實(shí)驗(yàn)步驟 1.全量法測定抗原原液的血凝效價(jià)（紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，HA試驗(yàn)） 1.1操作方法 在20孔反應(yīng)板上，取其10孔，第1孔加入滅菌生理鹽水0.9mL，第210孔各加入0.5mL。用0.1mL移液器吸取ND抗原原液0.1mL加入第1孔中，用0.5mL移液器將第1孔內(nèi)抗原與生理鹽水充分吹打均勻，吸取0.5mL至第2孔，吹打均勻，再吸取0.5mL至第3孔如此依次倍倍稀釋，至第9孔，由第9孔吸出0.5mL棄去。第10孔不加抗原，只加生理鹽水作對照。這樣，各孔ND抗原原液的稀釋度依次為110，120，14012560。然后向各孔加入1紅細(xì)胞懸浮液0.

16、5mL，靜置2030分鐘，于第1015分鐘開始觀察，一直觀察到30分鐘，判定并記錄抗原原液的HA效價(jià)。具體術(shù)式見表31。 1.2結(jié)果判定與記錄方法 1.2.1判定結(jié)果的方法：當(dāng)一層紅細(xì)胞凝集顆粒均勻覆蓋于整個(gè)孔底，判定為“完全凝集”，記錄為“#”。當(dāng)一層紅細(xì)胞凝集顆粒均勻覆蓋于孔底3/4面積時(shí)，稱不完全凝集，記錄為“+”；依次類推為“+”、“+”，均為不完全凝集，這時(shí)孔底中央會(huì)形成一個(gè)小紅圓點(diǎn)，是未凝集的紅細(xì)胞自然沉降集中于孔底中央。當(dāng)紅細(xì)胞完全自然沉降到孔底中央，形成一個(gè)邊緣光滑無凝集顆粒的紅圓點(diǎn)，判定為完全不凝集，記錄為“”。結(jié)果判定與記錄如表31。1.2.2判定ND抗原的血凝效價(jià)：凡能使

17、紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋度稱為該ND抗原的血凝效價(jià)，如表31，其ND抗原的血凝集效價(jià)為1640。其含義是該ND抗原原液作640倍稀釋，每0.5mL有一個(gè)血凝單位，即每0.5mL抗原原液含有640個(gè)血凝單位的抗原。表21 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)術(shù)式與結(jié)果（單位：mL）孔號(hào)12345678910抗原稀釋倍數(shù)1020408016032064012802560對照生理鹽水0.90.50.50.50.50.50.50.50.5ND抗原液0105050505050505棄1紅細(xì)胞0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5感作溫度及時(shí)間2030 1015分鐘結(jié)果舉例試管底圖象記錄#+- 2.全

18、量法測定血清抗體水平（紅細(xì)胞凝集(nngj)抑制試驗(yàn)，HI試驗(yàn)）操作方法 2.1分裝生理鹽水：在20孔反應(yīng)(fnyng)板上，取其10孔，第1孔加入滅菌生理鹽水0.4mL，第29孔加0.25mL，第10孔加0.5mL。 2.2加入(jir)被檢血清并稀釋：用0.1mL移液器，吸取0.1mL被檢血清加入第1孔，換取0.25mL移液器吹打使之充分混合，從中吸取0.25mL加入第2孔，吹打之充分混合，從中吸取0.25mL至第3孔如此一直稀釋至第8孔，從第8孔中吸出0.25mL棄去，第9、10號(hào)孔不含血清。 2.3加4單位抗原：向第1至第9孔加入4個(gè)血凝單位ND抗原溶液【經(jīng)上述HA試驗(yàn)測定血凝效價(jià)的抗

19、原原液，根據(jù)其血凝效價(jià)用生理鹽水稀釋為4個(gè)血凝單位，稀釋方法為每1mL抗原原液，加入生理鹽水（加入生理鹽水體積（mL）抗原原液中的血凝單位數(shù)/41），為提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可進(jìn)行4個(gè)血凝單位抗原的滴定，即將假定為4個(gè)血凝單位的抗原，分別取其原液、1:2、1:4、1：8倍稀釋液各0.5mL，各加入0.5mL 1%的紅細(xì)胞后，觀察其凝集的情況，若在1:4倍稀釋孔中出現(xiàn)非完全凝集的情況，表明4個(gè)單位的抗原濃度偏低；若在1:8倍稀釋孔中出現(xiàn)“”以上的凝集的情況，表明抗原的濃度偏高。并根據(jù)以上結(jié)果作相應(yīng)的調(diào)整】，每孔0.25mL，第10孔不含抗原作空白對照。 2.4添加紅細(xì)胞懸液：向第1至第10孔加入1雞

20、紅細(xì)胞懸浮液，每孔0.5mL，輕輕振蕩，室溫中靜置1030分鐘，觀察結(jié)果并記錄。具體方法見表32。 2.5結(jié)果判定與記錄方法 2.5.1判定結(jié)果的方法 當(dāng)紅細(xì)胞完全不凝集而自然沉降于試管底部中央，形成一個(gè)邊緣光滑的紅圓點(diǎn)，邊緣沒有分布紅細(xì)胞凝集顆粒，判定為完全抑制，記錄為“”，當(dāng)試管底紅圓點(diǎn)周圍分布少量紅細(xì)胞凝集顆粒時(shí)，判定為不完全抑制，記錄為“+”，隨著紅圓點(diǎn)的逐漸縮小，紅細(xì)胞凝集顆粒分布的逐步增多，而可依次記錄為“+”，“+”和“#”。結(jié)果判定與記錄舉例見表32。 2.5.2確定被檢血清的紅細(xì)胞凝集抑制抗體效價(jià)（HI效價(jià)）在本HI試驗(yàn)術(shù)式中，凡能使0.25mL 濃度4個(gè)凝集單位的ND抗原凝

21、集紅細(xì)胞的能力完全抑制的血清最高稀釋度稱為該被檢血清的HI效價(jià)。如表32結(jié)果舉例，該血清HI效價(jià)為180。表22 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)術(shù)式與結(jié)果舉例（單位：mL）材料孔號(hào)12345678對照對照稀釋度1:51:101:201:401:801:1601:3201:640生理鹽水0.40.250.250.250.250.250.250.250.250.5血清0.10.250.250.250.250.250.250.25棄4單位抗原0.250.250.250.250.250.250.250.250.251雞紅細(xì)胞懸液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5感作1520分鐘后，每5分

22、鐘觀察一次，直到60分鐘結(jié)果舉例試管底圖象記錄+#3. 根據(jù)免疫監(jiān)測(jin c)的結(jié)果指導(dǎo)雞群的免疫接種統(tǒng)計(jì)所有被檢血清樣品（20或40份樣品）的HI效價(jià)，根據(jù)抗體的臨界滴度（能夠使雞群免受ND感染(gnrn)的ND HI抗體的最低滴度，通常為120）計(jì)算(j sun)雞群HI效價(jià)的合格率（其公式為：雞群抗體合格率被檢雞只數(shù)抗體滴定低于臨界滴定的雞只數(shù)）/被檢雞只數(shù)100。并對照各種日齡雞群能夠抵抗ND感染的的抗體合格率參考標(biāo)準(zhǔn)，即：1月齡以下的小雞，抗體合格率要求在85以上，且其余15的被檢雞只的抗體水平不低于1:5；中成雞群的抗體合格率應(yīng)在95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應(yīng)不低于1

23、:5，則說明雞群抗體水平能夠抵抗ND強(qiáng)毒感染，暫時(shí)不需要加強(qiáng)ND的免疫接種。）4.微量血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)技術(shù)4.1材料準(zhǔn)備4.1.1 96孔V型微量反應(yīng)板，微量移液器（配滴頭）。 4.1.2 pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（配方一：磷酸氫二鈉1.10g，二水磷酸二氫鈉0.316g，氯化鈉8.50g，加水1000mL，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2，高壓滅菌備用；配方二：磷酸氫二鈉1.15g，磷酸二氫鉀0.20g，氯化鉀0.20g，氯化鈉8.00g，加水1000mL，高壓滅菌備用）4.1.3 阿氏（Alsevers）液配制:葡萄糖 2.05g，檸檬酸鈉 0.8g，

24、檸檬酸 0.055g，氯化鈉 0.42g，加蒸餾水至100mL，加熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4保存?zhèn)溆谩?.1.4 1%紅細(xì)胞懸液制備：采集至少3只SPF公禽或無禽流感和新城疫等抗體的健康公禽的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用PBS配成1%（V/V）紅細(xì)胞懸液，4保存?zhèn)溆谩?.1.5血凝性病毒病抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清以及陰性血清。4.2操作方法4.2.1 血凝（HA）試驗(yàn)（微量法）4.2.1.1在微量反應(yīng)板的1-12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。4.2.1.2吸取0.

25、025mL抗原加入第l孔，混勻。4.2.1.3從第1孔吸取0.025mL抗原PBS混合液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。4.2.1.4每孔再加入0.025mL PBS。4.2.1.5每孔均加入0.025mL 1%（V/V）雞紅細(xì)胞懸液（加入前，應(yīng)將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻）。4.2.1.6振蕩混勻，在室溫（20-25）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下1hr）。對照孔紅細(xì)胞將成明顯的圓點(diǎn)狀沉到孔底。4.2.1.7結(jié)果判定。將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或

26、病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。表2-3 HA試驗(yàn)微量法操作術(shù)式252525252525252525252525ND抗原液#25252542#25252521+#記錄圖象結(jié)果舉例2030C 1015分鐘感作溫度及時(shí)間252525252525252525251%紅細(xì)胞25252525252525252525PBS25252525252525252525PBS對照204810245122561286432168抗原稀釋倍數(shù)1211109876543孔號(hào)4.2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)(shyn)（微量法） 4.2.2.1根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍

27、數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。4.2.2.2在微量反應(yīng)(fnyng)板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。4.2.2.3吸取0.025mL血清加入(jir)第1孔內(nèi)，充分混勻后吸取0.025mL置于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。4.2.2.4 1-11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20）靜置至少30min。4.2.2.5每孔加入0.025mL的雞紅細(xì)胞懸液輕輕混勻，靜置約

28、40min（室溫約20，若環(huán)境溫度太高可置4條件下1hr），對照紅細(xì)胞將呈顯圓點(diǎn)狀沉于孔底。表2-4 HA試驗(yàn)微量法操作術(shù)式4.3結(jié)果(ji gu)判定在對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，以完全抑制(yzh)紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制滴度。免疫雞群血清抑制滴度在4log2的雞群保護(hù)率為50左右；在4log2以上的保護(hù)率達(dá)90100；在4log2以下的非免疫雞群保護(hù)率約為9，免疫過的雞群約為43。雞群的血凝抑制滴度以抽檢樣品的血凝抑制滴度的幾何均值表示，如平均水平在4log2以上，表示該雞群為免疫雞群。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求(yoqi) 1.扼要反映本實(shí)驗(yàn)步驟。2.報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)包括各孔的反應(yīng)

29、結(jié)果和被檢血清的HI效價(jià)。3.敘述影響試驗(yàn)結(jié)果的因素和注意事項(xiàng)。 4.說明應(yīng)用本試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)ND臨床免疫的方法。七、影響免疫監(jiān)測的因素及注意事項(xiàng) 1.病毒（抗原） 1.1病毒抗原應(yīng)避免反復(fù)凍融和污染； 1.2在凝集抑制試驗(yàn)中，不足量的抗原，有可能被大多數(shù)血清非特異性抑制之傾向，即假陽性。因此，有必要用足量的抗原避免誤差。但過量的抗原也會(huì)大大降低試驗(yàn)的敏感度，在配制4單位抗原時(shí)，一定要準(zhǔn)確。 2.紅細(xì)胞 2.1來自不同公禽個(gè)體的紅細(xì)胞，對抗原的敏感性存在著差異。配備紅細(xì)胞時(shí)，如需用來自幾只公禽的血液則應(yīng)將之混合進(jìn)行洗滌配制。采血禽只若注射過相應(yīng)疫苗時(shí)，則需徹底洗滌5次以上。另外，成年公禽是最好的

30、紅細(xì)胞供體。 2.2為使1紅細(xì)胞的懸液的濃度準(zhǔn)確，在紅細(xì)胞洗滌過程，最后一次離心必須統(tǒng)一用3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，并充分吸干上清液，然后將沉淀的紅細(xì)胞按1的比例進(jìn)行稀釋。 2.3保存紅細(xì)胞的阿氏液，內(nèi)含檸檬酸鈉葡萄糖，因此易于生長細(xì)菌，而污染雜菌的紅細(xì)胞懸液易發(fā)生溶血和自凝。如果保存于阿氏（Alserer）液中紅細(xì)胞，一旦發(fā)生變色或溶血就不能再用。無污染情況下，使用阿氏液保存的紅細(xì)胞的時(shí)間最長不宜超過1周。 2.4紅細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)化：為使在試驗(yàn)中紅細(xì)胞濃度一致，常用的方法是：a.燈光比色計(jì)；b.用細(xì)胞計(jì)數(shù)板數(shù)血球；c.最方便的方法是最后一次離心的速度和時(shí)間恒定,使紅細(xì)胞泥壓實(shí)后的密度基本一致。 3.血清 3.1非特異性抑制現(xiàn)象：血清常含有對病毒凝血素作用的非異性抑制物質(zhì)，這些物質(zhì)為粘液素類脂蛋白或類脂質(zhì)等。血清中抑制因子結(jié)構(gòu)性質(zhì)與紅細(xì)胞表面（類粘液蛋白）相似，因而奪去病毒與紅細(xì)胞結(jié)合的機(jī)會(huì)，為了消除這些抑制，可采用白陶土處理法，即將血清5630分鐘滅活后，以生理鹽水作15稀釋，再加等量25白陶土混合均勻