參考在臨床病理中的應(yīng)用

1、免疫組化在臨床病理中的應(yīng)用腫瘤醫(yī)院病理科 陸洪芬免疫組化原理用標(biāo)記的抗體（或抗原）對細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進(jìn)行定性、定位或定量檢測免疫組織化學(xué)方法分類按照標(biāo)記物的種類分為： 免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等 病理診斷中常用免疫組化方法EnVision兩步法目前最常用ABC法（抗生物素生物素過氧化物酶復(fù)合技術(shù)）LAB法（標(biāo)記生物素抗生物素技術(shù)）抗體的基本結(jié)構(gòu)重鏈Fab輕鏈Fc四條多肽鏈，呈Y型輕鏈兩條Fab,結(jié)合抗原重鏈兩條Fc，結(jié)合二抗重鏈決定抗體的類型IgA,IgD,IgE,IgG,IgMCOOHEnVision兩步法原理 腫瘤細(xì)胞抗原二抗一抗HRP酶

2、polymer免疫組化檢測組織或細(xì)胞標(biāo)本組織標(biāo)本 石蠟切片，冰凍切片 石蠟切片免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法，但對組織內(nèi) 抗原暴露有一定的影響，可進(jìn)行抗原修復(fù)。細(xì)胞標(biāo)本 組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片 EnVision兩步法 步驟將45m 的石蠟組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟脫水置0.01M pH6.0 檸檬酸中，100修復(fù)抗原10分鐘，保溫10分鐘 滴加一抗（根據(jù)產(chǎn)品說明書做相應(yīng)稀釋）于切片上，反應(yīng)過夜 TBS洗滌3次，2分鐘/次 滴加二抗于切片上，37反應(yīng)1小時 TBS洗滌3次，2分鐘/次 DAB顯色1545分鐘 待組織呈棕色時終止顯色，水洗干凈 蘇木復(fù)染 脫水、透明、封片常用緩沖液的配制0.5M

3、TBS pH7.6 Tris 60克,NaCl 85克,HCl 34毫升,溶于1000毫升蒸餾水，用時稀釋10倍。0.1M檸檬酸 pH6.0 檸檬酸21g, 2N, NaOH調(diào)pH至6.0，蒸餾水加至1000ml,用時稀釋10倍。檸檬酸三鈉緩沖液 pH6.0 58.5g檸檬酸三鈉，濃HCL調(diào)pH至6.0，蒸餾水加至1000ml,用時稀釋20倍（如：25ml母液用475ml蒸餾水稀釋至500ml工作液）。EDTA緩沖液 PH8.0 0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。DA

4、B顯色液 3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochloride Dihydrat（DAB）40 mg，TBS 緩沖液100ml，H2O2 40l。抗原修復(fù)抗原修復(fù)液 0.1M檸檬酸 pH6.00.5M或1.0M EDTA緩沖液 PH8.0抗原修復(fù)方法 熱修復(fù)微波，水浴，高壓 蛋白酶消化胰蛋白酶最常用抗原修復(fù)時注意： 熱抗原修復(fù)后應(yīng)注意自然冷卻 熱處理過程中修復(fù)液切勿煮干一 抗 類 型單克隆抗體 B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備多克隆抗體 將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物 一抗孵

5、育一抗稀釋度 根據(jù)抗體說明書的稀釋范圍找出最佳稀釋度一抗孵育時間、溫度 4 冰箱 過 夜 37溫箱 /常溫 2小時 免疫組化的自動化 BenchMarkXT （ ROCHE公司）Bond-Max ( LEICA公司)免疫組化結(jié)果的判斷陽性判斷陽 性 定 位 細(xì)胞核 細(xì)胞漿 細(xì)胞膜免疫組化分?jǐn)?shù) 染色強(qiáng)度陽性細(xì)胞數(shù) 染 色 強(qiáng) 度 弱陽性 中度陽性 強(qiáng)陽性 陽性細(xì)胞數(shù) 110 1150 5080 80%設(shè)立對照陽性對照陰性對照自身對照免疫組化結(jié)果的判斷陰性細(xì)胞核ERPRHER2/neu 細(xì)胞膜CD117細(xì)胞漿假陰性結(jié)果抗原修復(fù)方法欠佳抗體失活或濃度不當(dāng)抗原丟失或減弱技術(shù)失誤假陽性結(jié)果抗體的交叉反應(yīng)

6、組織中抗體的非特異性結(jié)合內(nèi)源性酶的著色腫瘤組織中殘余正常組織組織中抗原的彌散“異位”抗原的表達(dá)免疫組化的優(yōu)點(diǎn)高度特異性敏感性高方法步驟統(tǒng)一形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合免疫組化在病理診斷中的應(yīng)用提高病理診斷準(zhǔn)確性 腫瘤來源、性質(zhì)的判斷對預(yù)后的判斷 對腫瘤增生程度的評價發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶指導(dǎo)腫瘤治療 如 ER PR Neu CD117 EGFR VEGF提高病理診斷準(zhǔn)確性病理診斷準(zhǔn)確率： 單純常規(guī)HE切片 約8595； HE+免疫組織化學(xué)法 約9598； HE+免疫組織化學(xué)分子生物學(xué) 約99。確定腫瘤起源或分化表型 腫瘤來源的判斷上皮來源 CK間葉來源 VIM淋巴造血系統(tǒng) LCA惡性黑色素瘤 HMB45腫

7、瘤性質(zhì)的判斷 良惡性病變的鑒別，如：淋巴結(jié)反應(yīng)性增生與濾泡性淋巴瘤腫瘤的分型判斷 如：淋巴瘤分型 預(yù)后的判斷提示預(yù)后好的指標(biāo) 如：nm23 ER PR 提示預(yù)后差的指標(biāo) 如：HER2/Neu p53 c-myc 對腫瘤增生程度的評價Ki67 在細(xì)胞周期G1、S、G2、M期均有表達(dá)，G0期缺如，其和許多腫瘤分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān) PCNA （增殖細(xì)胞核抗原）EGFR（表皮生長因子受體） 發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶乳腺癌的前哨淋巴結(jié)檢查惡黑術(shù)中區(qū)域淋巴結(jié)的清掃等尋找感染病因 人乳頭狀瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV） 免疫組化對靶向治療的指導(dǎo)意義CD20HER-2/neu蛋白c-kit和PDG

8、FRA蛋白HER-1/EGFR蛋白CD20的檢測 正常B淋巴細(xì)胞從前B細(xì)胞直至分化到前漿細(xì)胞均表達(dá)CD20，而漿細(xì)胞通常不表達(dá)CD20，絕大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤（BCL）表達(dá)CD20，一些漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞分化的BCL和少數(shù)小BCL不表達(dá)CD20。 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法可檢測BCL是否表達(dá)CD20，陽性反應(yīng)定位在細(xì)胞膜上。凡CD20+ BCL都可用Rituxan治療。CD20雌孕激素的檢測乳腺癌中ER、PR的檢測 對內(nèi)分泌治療具有重要指導(dǎo)意義ERPR結(jié)果：-，+，+，+Ariol 3.2不只成像, 而且定量Ariol病理學(xué)工作站 (Applied Imaging公司) 高通量、自動化的圖像掃描及分析

9、系統(tǒng)Ariol 系統(tǒng)在臨床診斷中的應(yīng)用三個功能模塊通過美國FDA認(rèn)證免疫組化分析(乳癌Her-2/neu、ER、PR表達(dá)分析）細(xì)胞和組織FISH分析(Her-2/neu基因擴(kuò)增分析）骨髓中稀有細(xì)胞查找 Ariol系統(tǒng)對ER，PR的定量分析HER2/neu蛋白的檢測 分化差的乳腺癌表達(dá)HER-2/neu。免疫組織化學(xué)方法可檢測癌細(xì)胞是否過度表達(dá)HER2蛋白，陽性反應(yīng)必須定位在細(xì)胞膜上，陽性強(qiáng)度必須+，才能用Herceptin靶向治療。 如弱陽性或中度陽性（+），則必須用CISH、FISH或其它方法進(jìn)一步檢測。FISH：無擴(kuò)增IHC： 2FISH：有擴(kuò)增IHC： 3 c-kit蛋白和PDGFR的檢測C-kit基因或PDGFR基因突變