病理學(xué)常用研究方法

1、病理學(xué)常用研究方法整體水平：尸體解剖 autopsy動物實驗 animal experiment細(xì)胞水平：光鏡組織切片 light-microscope細(xì)胞培養(yǎng) cell culture流式細(xì)胞技術(shù) flow cytometry組織芯片 tissue micro-array組織微切割技術(shù) micro-dissection電鏡 透射、掃描、免疫電鏡蛋白水平：1.免疫組化 immunohistochemstry2.Western Blotting3.組織芯片 tissue micro-array基因水平：1.原位分子雜交(組織、染色體Fish) in situ hybridization2.基因芯

2、片 gene chip3.組織芯片 tissue micro-array4.PCR及測序等 PCR and sequence一、免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化問題探討本世紀(jì)70年代問世抗體種類急速增加，交叉反應(yīng)存在免疫組化技術(shù)方法不斷問世使用的試劑或?qū)嶒炇覘l件不同操作人員的熟練程度病理醫(yī)生的結(jié)果判定水平及關(guān)聯(lián)知識解決標(biāo)準(zhǔn)化的問題勢在必行(一)方法的選擇目前常用的免疫組化方法有：PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等各種方法只要運用得好，都會得到滿意的結(jié)果建議：在我們省內(nèi)都采用S-P法S-P法的優(yōu)點 方法統(tǒng)一 有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒 一般2-3小時(30-60)，而ABC法需1天，分 子量小

3、(60KD)，穿透力強(qiáng) 靈敏性高，特異性強(qiáng)，4個亞基都能于二抗上的生 物素結(jié)合，而且結(jié)合鍵強(qiáng) 背景低，非特異性反應(yīng)少，等電點為，接近于 中性，不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合,而ABC法為10S-P法與ABC法的區(qū)別S-P法：Streptaridin peroxidase conjugataed method 鏈霉菌素抗生物素蛋白過氧化物酶連接法ABC法： Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素親生物素過氧化酶復(fù)合物法S-P法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素即：卵白素中的4個亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié) 合，另一方面還與

4、復(fù)合物中的生物素結(jié)合一抗二抗卵白素生物素過氧化物酶A-B-C一抗二抗鏈菌素抗生物素蛋白過氧化物酶ABC法：S-P法：(二) 固定、包埋固定液：一般10%中性緩沖福爾馬林，PH7.3-7.4(PBS配制)固定時間：應(yīng)少于24小時，固定時間越長，抗原丟失越多固定液量或組織塊大小：組織為1/3，固定液2/3大體標(biāo)本：切下一塊固定包埋：起初免疫組化對蠟溫的要求很嚴(yán)，溫度一高會嚴(yán)重影響結(jié)果?，F(xiàn)在由于抗體質(zhì)量的提高，以及抗原恢復(fù)方法的問世，多數(shù)人又忽視了蠟溫的問題。個人認(rèn)為：盡管有抗原修復(fù)方法，但不如開始就不使抗原破壞，另外，蠟溫過高，組織變脆，不易切成大片，容易脫片。因此，要控制蠟溫在65以下(三) 抗

5、原修復(fù)(抗原暴露、抗原復(fù)原)組織中存在某種抗原、但用特異性抗體，卻為陰性其原因是：固定、包埋后部分抗原決定簇與核酸或其它蛋白抗原發(fā)生了交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)固定液中的醛基本身也會發(fā)生交聯(lián)，而封閉抗原抗原修復(fù)的目的：就是要打開交聯(lián)，暴露抗原決定簇，有利于抗原抗體反應(yīng)，抗原修復(fù)的方法從大的方面講有兩種：只限于需要抗原修復(fù)的抗體熱微波高壓鍋水浴鍋酶消化胰蛋白酶胃蛋白酶熱修復(fù)： 檸檬酸緩沖液，95，10分鐘注意：脫片多多聚L賴氨酸 干片 選醫(yī)用微波爐酶消化：1.細(xì)胞內(nèi)抗原0.1%胰蛋白酶 2037 2.間質(zhì)抗原4%胃蛋白酶37，4-8小時(八)免疫組織化學(xué)的發(fā)展1. 免疫PCR：主要用于臨床生物分子檢測方面

6、血清(Ag)電泳+Ab+無關(guān)引物擴(kuò)增顯色 意義：1. 原來較弱、水平較低的酶等，用免疫PCR就可以檢測出來 2. 需要較長或一定時間才能查出來用免疫PCR法，就可提前查出來如：病毒性心肌炎、血腫CPK檢測 心梗早期心肌酶譜的檢測等心梗預(yù)報：心絞痛一般認(rèn)為沒有酶 譜改變，設(shè)想用免疫PCR就可能發(fā)現(xiàn)改變2. 原位免疫PCR在組織切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2卵白素洗凈生物素標(biāo)記的DNA片斷洗凈原位PCR擴(kuò)增洗凈ACB或S-P顯色 特點：提高陽性率 定位好2. 擴(kuò)增：Total: 25l dH294 25” 55 25” 72 40” 30 cycles3. Agarose 2-5%，用1TBE

7、電泳 擴(kuò)增后液 5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色 20，UV照射下確認(rèn)泳帶照相4. DNA收集 RECOCHIP法三、Western Blotting1. 提取蛋白 500l的hypotonic buffer + 組織2mm3勻漿器粉碎 冰上放置30 15000轉(zhuǎn)/分，4，30。上清：細(xì)胞質(zhì)蛋白，+250l 3loading buffer沉淀物 + 750l loading buffer再次粉碎、離心，上清為細(xì)胞膜蛋白 2-氫硫基乙醇 7.5l(1/100)混合 95沸騰5分鐘 冰上放置2. 蛋白定量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度制備：BSA，0，1，2mg/ml 比色：測定系數(shù) 換

8、算成含量 計算出每個樣品加樣量3. 電泳 丙烯酰胺 上部膠、下部膠 marker樣品4. 轉(zhuǎn)膜5. 洗膜 一抗、二抗 顯色或自顯影四、組織芯片(Tissue Micro-Array, TMA) 組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù)，它是將幾十個或幾百個不同個體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時對幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本，進(jìn)行某一個或多個特定的基因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。應(yīng)用免疫組化DNA或RNA原位雜交FISH原位PCR低密度芯片(50-70個標(biāo)本)、高密度芯片(500個標(biāo)本)制作過程1. 組織處理：固定、石蠟包埋、HE染色、組織定位2. 組織打孔/陣列儀鉆取組織，直徑3. 制作陣列蠟塊，將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入空白蠟塊內(nèi)4. 切片厚度為5m，以40為宜，56烤片3小時，備用好的組織芯片1. 制片過程中組織片不移位、不脫落2. 組織樣本的厚度以3mm為佳3. 每張組織芯片為5m4. 一個芯片蠟塊可切片100-200張注：組織片上約有30,000個細(xì)胞，2mm的組織芯片約有100,000個細(xì)胞人有了知識，就會具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以