蛋白質(zhì)工程思考題(共10頁)

1、蛋白質(zhì)工程(gngchng)：通過對蛋白質(zhì)己知結(jié)構(gòu)和功能的了解，借助計算機輔助設(shè)計，利用基因定點誘變等技術(shù)，特異性地對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因進行改造(gizo)，產(chǎn)生具有新的特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)，并由此深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。蛋白質(zhì)工程的研究(ynji)內(nèi)容有哪些？答：利用己知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息作為應(yīng)用研究；從混雜變異體庫中篩選和選擇具有一定結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的蛋白質(zhì)；定量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究；根據(jù)己知結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系人工改造蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的基本程序：舉例說明蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用？答：1、研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；2、改變蛋白質(zhì)的特性；3、生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)（提高酶的產(chǎn)量和創(chuàng)建新型酶

2、；設(shè)計和研制新型抗體；設(shè)計和研制多肽及蛋白質(zhì)類藥物）；4、設(shè)計合成全新蛋白質(zhì)。前胰島素原如何變成胰島素？答：人胰島素初合成時是一條由110個氨基酸殘基組成的前胰島素原肽鏈，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號肽酶作用，剪切掉N一端24個氨基酸殘基的信號隊序列，形成含有86個氨基酸殘基組成的胰島素原，并在相應(yīng)位置上形成3個二硫鍵。當其在高爾基器包裝成為顆粒時，再經(jīng)胰蛋白酶和類羧肽酶B的催化，切除中間33個氨基酸殘基的C肽后，才能轉(zhuǎn)變成具有生物活性的胰島素。分子病：由于基因突變而導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(jigu)改變后表現(xiàn)出生理功能異常，使機體出現(xiàn)病態(tài)現(xiàn)象，叫酶的空間結(jié)構(gòu)與催化功能(gngnng)的關(guān)系如何？P17基因

3、克隆的基本(jbn)程序：制備目的基因；連接目的基因與載體形成重組體(重組子)；將重組體轉(zhuǎn)入宿主細胞；重組體的篩選和鑒定；重組體的擴增和表達。定點誘變(sitedirected mutagenesis)：在體外通過堿基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中任何一個特定的堿基發(fā)生改變。試述M13DNA寡核苷酸誘變的過程。答：1、正鏈DNA的合成；2、突變引物的合成；3、異源雙鏈DNA分子的制備；4、閉環(huán)異源雙鏈DNA分子的富集和轉(zhuǎn)化；5、突變體的篩選；6、突變基因的鑒定。 如下圖試述Kunkel定點誘變法的基本原理。（P38 39）試述PCR寡核苷酸定點誘變過程(guchng)。（圖P39）

4、答：變性：通過(tnggu)加熱使模板DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解開形成單鏈。一般為95，15se；退火：當溫度突然降低時，人工合成(rn n h chn)的兩個寡核昔酸引物分別與模板單鏈形成雜交鏈。一般為55、30sec；延伸：將反應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，以四種dNTP為底物，DNA聚合酶摧化以引物為起始點的DNA鏈的延伸反應(yīng)，一般為72，15min。以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一循環(huán)的模板，因此經(jīng)數(shù)小時n次循環(huán)后目的DNA理論上可擴增2n倍。盒式誘變(cassette mutagenesis)：是一種定點誘變技術(shù)，其方法是利用一段人工合成的具有突變序列的雙鏈寡核苷酸片段，

5、取代野生型基因中相應(yīng)序列?；驹恚哼@種誘變的雙鏈寡核苷酸片段是由兩條人工合成的寡核苷酸鏈組成的，當它們退火時，會按照設(shè)計要求產(chǎn)生出克隆需要的粘性末端。這些合成的寡核苷酸片段就好像不同的盒式錄音磁帶，可隨時插入到已制備好的載體分子(“錄音機”)上，便可以獲得數(shù)量眾多的突變體，故稱為盒式誘變。該方法的優(yōu)點是簡單易行，突變效率高。試述隨機誘變的過程。P41蛋白質(zhì)工程的設(shè)計(shj)思想包括哪幾個方面？舉例說明。答：1、加入(jir)二硫鍵。2、將天冬酰胺和谷氨酰胺轉(zhuǎn)換成其他(qt)氨基酸。3、減少游離半胱氨酸殘基的數(shù)目。4、增加酶的活性。5、改變酶的特異性。酶活性中心（active center）

6、：又叫活性部位。當肽鏈盤曲、折疊形成空間結(jié)構(gòu)時，互相隔離的必需基團彼此靠近，集中在酶分子表面而形成具有三維結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域，該區(qū)域能與底物結(jié)合并發(fā)揮催化作用，稱為常見的必需基團有：組氨酸殘基的咪唑基、絲氨酸殘基的羥基、半胱氨酸殘基的巰基、谷氨酸殘基的羧基等。酶催化反應(yīng)機制的學(xué)說有哪些？答：1趨近效應(yīng)與定向效應(yīng) 當酶催化兩個以上(yshng)底物進行反應(yīng)時，諸底物均結(jié)合到酶的活性中心，使它們相互接近，這就是趨近效應(yīng)(approximation)。趨近效應(yīng)可使底物在活性中心區(qū)的有效濃度提高數(shù)千至效萬倍，大大增加了底物問碰撞的機會，使反應(yīng)速度極大的提高。酶與底物結(jié)合后才能起催化反應(yīng)，所以僅靠近還不行，

7、還需定向即底物與酶的活性中心結(jié)合時，可誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，使底物和酶的活性中心互補契合(qh)，并使底物的反應(yīng)基團彼此嚴格定向，使酶與底物的結(jié)合達到原有利形態(tài)，使反應(yīng)(fnyng)加速。這種現(xiàn)象稱為定向效應(yīng)。2張力效應(yīng) 酶與底物結(jié)合，酶活性中心中的某些基團或金周離子可以改變底物敏感鑲的電子云分布，產(chǎn)生“電子張力”而易于斷裂。也可以使底物的構(gòu)象改變，接近于過渡態(tài)而易于反應(yīng)。這種現(xiàn)象稱為張力效應(yīng)。3. 共價催化理論 包括親核催化和親電子催化兩類。因酶分子活性中心的一些基團如羥基、巰基和咪唑基，分別帶有多電子的原子如O，S和N，可以提供電子去“攻擊”底物上相對帶正電的原子，這種現(xiàn)象稱為親核攻擊，OH，

8、SH和咪唑氮等能進行親核攻擊的基團稱為親核基團。 親核攻擊通過行程?；腹矁r中間物，減少活化能而加速化學(xué)反應(yīng)。有些酶分子中具有能與電子親和的原子中心，能從底物得到一對電子形成酶底物共價化合物，繼而催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，這種現(xiàn)象稱為親電子催化。4酸堿催化 酸堿催化有兩種主要類型，即狹義酸堿催化和廣義酸堿催化。前者是指在催化反應(yīng)體系中，緩沖溶液濃度不變時，化學(xué)反應(yīng)速度隨PH值的變化而改變；后者是指在催化反應(yīng)體系中，pH值不變，反應(yīng)速度隨緩沖溶液濃度的改變而變化。舉例說明枯草桿菌蛋白酶的定點改造、應(yīng)用。P56答：1、提高酶的穩(wěn)定性。將Ser128、Leu104突變?yōu)镚ly128和Val104，使得突變

9、酶熱穩(wěn)定性提高10.4攝氏度；利用定點誘變，將南極嗜冷芽孢桿菌所產(chǎn)的枯草桿菌蛋白酶熱穩(wěn)定性提高至嗜中溫枯草桿菌蛋白酶的程度；利用交錯延伸技術(shù)，使突變酶在65攝氏度的半衰期能提高2550倍。2、改變底物特異性與酶活性?？莶輻U菌蛋白酶有較廣的底物特異性，通過它的兩個特異性口袋S1和S4，與底物的側(cè)鏈氨基酸殘基P1和P4反應(yīng)。通過改變Sl口袋的電荷、疏水性或立體結(jié)構(gòu)已成功的提高了底物殘基Pl和P2的特異性。近年來通過對S4口袋的氨基酸替換也成功的改變了對底物殘基P4的特異性。3、提高酶在有機相中的反應(yīng)效率。將表面電荷的數(shù)量減少到最少的程度，以便降低融合作用的能量。增加內(nèi)部極性及疏水作用性能。導(dǎo)入構(gòu)象

10、限制用以降低蛋白質(zhì)變性傾向。舉例說明組織型纖溶酶原激活劑（tPA）的定點改造、應(yīng)用。答：1、將tPA分子的3個糖基化位點進行改造。2、將tPA的N端F和F區(qū)編碼序列的核苷酸做缺失處理，表達的tPA突變體的半衰期為野生型的25倍。3、用基因定位誘變及DNA重組技術(shù)構(gòu)建一種tPA的缺失突變體，由此獲得了對PAI1的抗性。應(yīng)用：一種高效的特異性溶血栓藥物?？勺鳛槔w溶系統(tǒng)功能的判斷(pndun)指標；診斷血栓形成的指標；凝血疾病預(yù)后診斷的指標；肝功能評價指標。舉例說明葡萄糖異構(gòu)酶的定點(dn din)改造、應(yīng)用。P60答：1、提高熱穩(wěn)定性；2、降低最適pH值；3、改變底物專一性，提高催化(cu hu)

11、效率。酶蛋白定向進化的基本原理：在待進化酶基因的PCR擴增反應(yīng)中，利用Taq DNA多聚酶不具有35校對功能的性質(zhì)，配合適當條件，如降低一種dNTP的量等，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶（或蛋白質(zhì)），從而排除其他突變體?；舅悸罚?eq oac(,1)理想的突變頻率為每個目的基因的堿基替換在1.5到5個左右； eq oac(,2)選擇一個性狀最接近人們期望的酶分子作為起點； eq oac(,3)建立有效且靈敏的選擇方法，確保檢測出由單一氨基酸取代而引起的功能變化?？贵w的基本特性：一個極不均一的分子群；有不同的類和亞類，表現(xiàn)出各不相同的

12、抗原特異性；不同的抗體有相同的結(jié)構(gòu)，都是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成。按發(fā)展歷史抗體可分哪幾類：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體。蛋白質(zhì)多肽藥物的表達系統(tǒng)有哪些？各自優(yōu)缺點如何？答：1、大腸桿菌表達系統(tǒng)。優(yōu)點： eq oac(,1)培養(yǎng)方法簡單，增值快，生長成本低，有巨大的生產(chǎn)潛力；表達水平一般高于真核系統(tǒng)，而且其下游工藝簡單，容易控制。缺點： eq oac(,1)缺乏真核細胞特有的翻譯后加工修飾功能；表達的多肽分子不能正確地折疊，以不溶性包涵體形式存在，提取純化步驟復(fù)雜，而且從包涵體中獲得的蛋白質(zhì)常常沒有活性；細菌本身產(chǎn)生的熱源、內(nèi)毒素不易除去，產(chǎn)品純化問題較多。2、酵母表達系統(tǒng)

13、。優(yōu)點：3、昆蟲細胞表達系統(tǒng)。優(yōu)點： eq oac(,1)能利用信號肽使外源蛋白分泌到胞外，而且能有效地進行翻譯后加工修飾；允許插入較大的外源基因； eq oac(,3)桿狀病毒具有嚴格的宿主專一性；外源基因表達水平高，而且比哺乳動物細胞表達速度快。缺點：主要用于研究，尚不能用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。4、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。優(yōu)點：是表達哺乳動物蛋白質(zhì)的最佳選擇。它不僅能識別和剪切外源基因中的內(nèi)含子并加工成成熟的mRNA，而且能對表達蛋白質(zhì)進行翻譯后加工，產(chǎn)生天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)。5、在轉(zhuǎn)基因動物中表達。優(yōu)點：基因的表達不會受到限制。胰島素的結(jié)構(gòu)：一種蛋白質(zhì)類激素由胰島素的細胞合成。人類胰島素由A，B兩條多

14、肽鏈構(gòu)成，A鏈含有21個氨基酸殘基，B鏈含有30個氨基酸殘基，這兩條鏈由二硫鍵連接，在A鏈中還含有一個鏈內(nèi)二硫鍵。胰島素理化(lhu)特性：分子量約為6000，在不同的pH、離子(lz)強度和蛋白濃度下，可以單體、二聚體、六聚體等狀態(tài)存在。胰島素生物學(xué)活性：一種重要的蛋白質(zhì)激素，不僅(bjn)對機體的糖代謝具有關(guān)鍵作用，而且具有促生長功能。胰島素的主要生物學(xué)作用是促進組織、細胞對葡萄糖的攝取和利用，加速糖原合成、抑制糖異生，促進葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，從而使血糖降低。重組人胰島素的步驟如何？P87人胰島素的定點改造思路如何？舉例說明其定點改造。答：作為藥物制劑在臨床用的注射胰島素是六聚體，進人體內(nèi)后

15、要解聚為單體才能有效發(fā)揮生物學(xué)作用。六聚體胰島素解聚為單體的速度，可影響其降血糖的速度。如果通過分子改造使注射胰島素進入體內(nèi)后，解聚過程延長，即可制備長效胰島素；相反，使注射胰島素主要以單體形式存在或使其從六聚體解聚為單體的過程縮短，即可制備速效胰島素。1、速效胰島素。重組突變體B9人胰島素是通過蛋白質(zhì)工程途徑制備的一種速效胰島素。它將處于二聚體界面上的中性、短鏈殘基B9 Ser突變?yōu)樗嵝浴⑤^長鏈的Asp，使其在中性pH條件下主要以單體形式存在，注入體內(nèi)后無需解聚進入血液，從而產(chǎn)生速效效應(yīng)。2、長效胰島素。它的長期效應(yīng)主要在于B鏈羧端Thr被酰胺化和B27的Thr突變?yōu)閹д姾傻腁rg，使其等

16、電點上升，而A21位的突變使其在酸性溶液中也不會脫酰胺，保證了它的穩(wěn)定性，這樣制成pH3.0的可溶制劑，注射后能在生理pH條件下形成結(jié)晶，延緩吸收，半衰期因而延長，有利于低劑量胰島素基礎(chǔ)水平的維持。3、高效胰島素。利用定點誘變技術(shù)將人胰島素B10的His突變?yōu)锳sp，獲得B10 Asp突變體。該突變體的體外生物活力和受體結(jié)合能力均顯著升高，約為天然人胰島素的5倍。試述重組人生長激素的方法？P88 notes舉例說明人生長激素的定點改造。答：hGH三維結(jié)構(gòu)與功能研究發(fā)現(xiàn)，His一18，His一2l和G1u174是Zn2+結(jié)合部位，當Zn2+與這些氨基酸側(cè)鏈結(jié)合后，hGH與催乳素受體具有高親和性。

17、利用定點誘變技術(shù)，改變上述部位的氨基酸序列即可降低hGH與催乳素受體的結(jié)合。目前已經(jīng)獲得了僅能與hGH受體結(jié)合而不與催乳素受體結(jié)合的hGH突變株。干擾素的生物學(xué)活性如何？舉例說明重組人干擾素現(xiàn)狀。P91答：干擾素是免疫系統(tǒng)抵御外源侵襲的一類細胞因子，其主要作用有：影響細胞內(nèi)代謝過程，合成抗病毒蛋白，抑制病毒等細胞內(nèi)微生物的增殖；通過干擾細胞分裂周期抑制細胞增殖；通過作用于CTL、單核巨細胞、NK細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞而進行免疫調(diào)節(jié)；增加組織相容性抗原的表達。白細胞介素的作用及常見種類有哪些？答：白細胞介素(Interleukin，IL)是一組具有介導(dǎo)白細胞相互作用的細胞因子，在免疫系統(tǒng)中

18、發(fā)揮重要生理功能。它們通過復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)免疫應(yīng)答與炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)造血功能，對多種細胞的生長與分化起重要的調(diào)控作用，對腫瘤、感染性疾病及免疫缺陷等疾病均具有較好的療效。常見種類有：IL-1、 IL-2、IL-18。電泳(din yn)（electrophoresis）：蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下可解離成帶電離子(lz)，在電場作用下可向與其本身所帶電荷相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳(din yn)分類：根據(jù)有無支持物分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳；根據(jù)電泳使用的技術(shù)可分為顯微電泳，免疫電泳密度梯度電泳，等電聚焦電泳等；根據(jù)電泳的方向又分為水平電泳和垂直電泳；根據(jù)所用支

19、持物的不同又分為紙電泳、醋酸纖維家膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等；根據(jù)電泳系統(tǒng)的連續(xù)性還可分為連續(xù)性電泳和不連續(xù)性電泳等。影響電泳速度的因素：電場強度、緩沖溶液的pH值、緩沖溶液的離子強度、電滲、焦耳熱。PAGE中凝膠的化學(xué)聚合原理？答：化學(xué)聚合的催化劑一般采用過硫酸銨(AP)加速劑是脂肪族的叔胺，如四甲基乙二胺(TEMED)、三乙醇胺和二甲基氯丙腈等，其中以TEMED為最好。當過硫酸銨被加入Acr，Bis和TEMED的水溶液時，立即產(chǎn)生過硫酸自由基，該自由基再激活TEMED，隨后TEMED作為一個電子載體提供一個未配對電子，將丙烯酰胺單體活化?；罨谋０繁舜诉B接，聚合成含有

20、酰胺基側(cè)鏈的脂肪族多聚鏈。相鄰的兩條多聚鏈之間，隨機地通過Bis交聯(lián)起來，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠物質(zhì)。PAGE的分離效應(yīng)有哪幾種？結(jié)果如何？P99 100答：有三種。濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。PAGE中配制凝膠需注意哪些事項？（？）PAGE有哪些優(yōu)點？答： eq oac(,1)電滲作用比較小，不易和樣品相互作用； eq oac(,2)可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的網(wǎng)孔，又有比較好的機械性質(zhì)； eq oac(,3)在一定濃度范圍內(nèi)聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定，凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定；丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。影響凝膠聚合的因素有

21、哪些？可分別采取什么對策？答：1、試劑的純度。選擇質(zhì)量好、達到電泳純級的丙烯酰胺，過硫酸銨溶液要新鮮配制。2、凝膠濃度?？晒┻x擇的凝膠濃度范圍為3%30%?？倽舛仍酱?，孔徑相對變小。大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)采用7.5%濃度的凝膠。3、溫度和氧氣的影響。溫度高聚合快，反之就慢，一般以2325攝氏度為宜。聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣隔絕。SDS的原理是什么？有何用途？答：其原理是當向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS能破壞蛋白質(zhì)分子間非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象，特別是強還原劑巰基乙醇的存在，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵還原，從而保證蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物

22、。蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物所帶的SDS負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。這樣的蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小。SDSPAGE可以按蛋白質(zhì)的分子大小的不同將其分開。若用已知分子量的一組蛋白質(zhì)作圖繪制標準曲線，在同樣條件下檢測未知樣品，就可從標準曲線推算出未知樣品的分子量。主要用于蛋白質(zhì)分子量的測定、蛋白質(zhì)混合組分(zfn)的分離和蛋白質(zhì)亞基組分的分析(fnx)等方面。色譜(s p)（chromatography）：又叫層析法，是一種利用混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。色

23、譜技術(shù)分類：1、按兩相所處的狀態(tài)分：液相色譜、氣相色譜、液固色譜、液液色譜、氣固色譜、氣液色譜；2、按層析過程的機理分：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析；3、按操作形式不同分：柱層析、紙層析、薄層層析。試述離子交換層析的基本原理。（？）答：離子交換層析是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換層析介質(zhì)中可交換離子進行交換而達到分離純化的方法，也可以認為是蛋白質(zhì)分子中帶電的氨基酸與帶相反電荷的介質(zhì)的骨架相互作用而達到分離純化的方法。 離子交換層析法主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進行分離，具有較高的分離容量。使吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)解離的方法有：洗脫、改變鹽離子濃度、改變pH。離子交換劑的分類情況如何？答：1、離子交換劑分為兩大類，陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑中的可解離基團是磺酸( )、磷酸( )、羧酸( )和酚羥基(一OH)等酸性基團。陰離子交換劑中的可解離基團是伯胺( )、仲胺( )、叔