藥典附錄之高效液相色譜法

1、蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司 HYPERLINK HYPERLINK 第 PAGE 4頁 共 NUMPAGES 4頁藥典附錄之高效液相色譜法高效液相色譜法 附錄 D. 高效液相色譜法 高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。 1.對儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動相的組分應(yīng)按各品種項下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基硅烷鍵合硅膠次之,

2、氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑，用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法（附錄 ）項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變, 以適應(yīng)具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。 2.系統(tǒng)適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品

3、對儀器進行試驗和調(diào)整，應(yīng)達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。 (1) 色譜柱的理論板數(shù)(n) 在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同,但應(yīng)取相同單位）和半峰高寬(W),按n=5.54(tRW)計算色譜柱的理論板數(shù)。如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達到要求。 (2) 分離度 定量分析時，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計

4、算公式為： 2(tR-tR) R WW 式中 tR為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； tR為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W及W為此相鄰兩峰的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。 (3) 重復(fù)性 取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液,分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。 (4) 拖尾因子 為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規(guī)定

5、,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W T 2d 式中 W為0.05峰高處的峰寬； d為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.951.05間。 3.測定法 定量測定時，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測定雜質(zhì)含量時，須采用峰面積法。 (1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項下的規(guī)定,精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： AC 校正因子（f） AC 式中 A為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面

6、積或峰高； A為對照品的峰面積或峰高； C為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； C為對照品的濃度。 再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量： A 含量(C)f AC 式中 A為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； C為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度。 f、A和C的意義同上。 當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。 (2) 外標(biāo)法測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項下的規(guī)定,精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀

7、器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： A 含量(C)C A 式中各符號意義同上。 (3) 加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。 測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤?，進樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載

8、為限），使對照溶液的主成分色譜峰高約達滿量程的10%25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分（面積約為通常條件下滿量程峰積分值的10%）。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間除另有規(guī)定外,應(yīng)為主成分保留時間的若干倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。 (4) 不加校正因子的主成分自身對照法 當(dāng)沒有雜質(zhì)對照品時，可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調(diào)節(jié)儀器靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時間的若干倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。 若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖。色譜圖上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計算。 (5) 面積歸一化法 由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于