分子雜交和印跡技術(shù)PPT

1、關(guān)于分子雜交與印跡技術(shù)PPT第一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、變性與復(fù)性 （一）變性 1、定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成為單鏈。第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理第二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。第三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低 密度

2、增加 紫外吸收值增加第四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4、DNA變性曲線 AT區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈 階梯式曲線第五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3融解溫度：定義：在DNA熱變性時，其A260的升高達最大值一半時的溫度。第六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、

3、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子第八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學(xué)）dC dt=K2C2（1）將（1）積分C Co 1 1+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（2）式中的 為1 21 2 1 1+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢C Co（3）1 K2Cot1/2=第九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、分

4、子雜交將任何具有互補核苷酸順序的兩條單鏈核酸分子放入同一個反應(yīng)體系，兩條互補鏈可通過復(fù)性重新締合形成雙鏈，這一過程成為核酸分子雜交。第十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、探針（一）探針的種類 基因組DNA探針 cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針探針：是指帶有標記物的、能與被檢測的核酸片段互補的一段已知核酸片段。第十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二） 探針的制備方法制備方法： (1) DNA重組技術(shù) (2) PCR擴增 (3) 化學(xué)合成第十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月合成寡核苷酸探針注意原則(1) 長度（50-300 bp); (2) G:C對含量

5、40%-60%；(3) 探針內(nèi)避免互補；(4) 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5) 與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列 相同，最好不用。第十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）標記物 1.想標記物應(yīng)具備的特性： 高度靈敏性 不影響堿基配對的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性第十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 標記物種類 核素標記物：32p、35s、3H 非核素標記物 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標記物與某種底物反

6、應(yīng)發(fā)光， 如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光 第十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）標記方法 體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使 核素摻入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到DNA中， 3H-尿苷可摻入到RNA中 第十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月體外標記法： 化學(xué)標記法：標記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標記物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標記法：標記物預(yù)先標記核苷酸，然 后利用酶促法將標記的核苷酸 摻入到探針上第十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月酶促標記法1.切口平移法（nick tr

7、anslation)1、利用DNase I在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中第十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.隨機引物法 其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補。 另一單鏈DNA模板同樣合

8、成一條新的完全互補的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中第二十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月隨機引物法所具有的優(yōu)點：1、能進行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當所帶來的一系列問題3、標記活性高，標記活性可達108cpm/gDNA以上4、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記第二十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3. PCR標記法：將標記的核苷酸作為PCR反應(yīng)的底物，以待標記的DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標記的核苷酸摻入到新合成的DNA分

9、子中第二十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、影響雜交的因素 1、探針分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜 交效率第二十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、溫度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5 第二十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3、離子強度： （1）低鹽濃

10、度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 第二十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在3542 雜交 （2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68雜交 第二十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度 （2）復(fù)性速率與

11、反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成反比 （3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性 第二十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月6、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉 第三十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、應(yīng) 用1.檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關(guān)系；2.用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達豐度。 第三十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月按待測核酸是否固

12、定在固相支持物上分： 固-液相雜交印跡雜交原位雜交液相雜交按照雜交分子特性分DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交蛋白質(zhì)雜交第二節(jié) 核酸分子雜交的方法第三十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、Southern印跡雜交此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。第三十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印跡雜交的技術(shù)流程第三十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）待測核酸樣品的

13、制備 1、裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段第三十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）待測DNA樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢,小分子DNA泳動快， 大小 相同的分子處于同一條帶 3、分子量標準：經(jīng)Hind消化的DNA，雜交 所用分子量標準可用核素標記 第三十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 第三十

14、七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程第三十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機械性能 非特異吸附少第三十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點：DNA

15、與膜共價結(jié)合；對不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低第四十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、Southern印跡的常用方法 （1）毛細管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上第四十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月。第四十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）電轉(zhuǎn)法利用電場

16、的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。第四十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。第四十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 （五）Southern雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液 2、雜交：液相中的DNA

17、探針與膜上的待測DNA雜交 雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA 第四十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針第四十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析第四十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、Northern印跡雜交 1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同

18、 2、鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣品為總RNA或mRNA第五十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Northern印跡與Southern 印跡的不同點 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA第五十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、 Western印跡雜交 將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-prote

19、in”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。第五十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月四、斑點及狹縫印跡雜交 1、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀 3、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量第五十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、原位雜交1、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交；根據(jù)雜交物分為菌落、噬菌斑及真核細胞原位雜交。第五十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6

20、月 保持組織細胞的形態(tài) 對核酸無抽提，修飾與降解作用 不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定 2、雜交過程：（1）組織或細胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：第五十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）組織細胞雜交前的預(yù)處理 去垢劑（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落第五十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）探針的選擇與標記 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長度一般為50300bp

21、,有時達1.5kb 放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長 非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察第五十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）雜交 雜交液體積?。?020l cDNA和RNA探針雜交溫度約為50 雜交時間:DNA探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜 雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使DNA變性 沖洗溫度一般 不超過50 第五十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）雜交結(jié)果檢測 所用探針為核素標記,放射自顯影檢測 所用探針為非核素標記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測第五十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月六、液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。第六十張，PPT共六十六頁，