植物組織培養(yǎng)技術(shù)(二)ppt課件

1、二 環(huán)境條件在植物組織培育中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培育基組成、pH值、浸透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組織培育育苗的生長和發(fā)育。 溫度(temperature) 由于溫度是植物組織培育中的重要要素，所以植物組織培育在最適宜的溫度下生長分化才干表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培育都是在2327之間進展，普通采用25 2。低于15時培育，植物組織會表現(xiàn)生長停頓，高于35時對植物生長不利。但是，不同植物培育的適溫不同，百合的最適溫度是20、月季足25-27、番茄是28。溫度不僅影響植物組織培育育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進程。如煙草芽的構(gòu)成以28為最好，在120以下，33以上

2、構(gòu)成率皆最低。不同培育目的采用的培育溫度也不同，百合鱗片在30以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25以下的高。桃胚在25條件進展一定時間的低溫處置，有利于提高胚培育成活率。用35處置草莓的莖尖分生組織35d，可得到無病毒苗。 光照(light) 組織培育中光照也是重要的條件之一，主要表如今光強、光質(zhì)、以及光照時間方面 1光照強度(light intensity)光照強度對培育細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研討情況看，光照強度對外植體及細胞的最初分裂有明顯的影響。普通來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。2光質(zhì)(light wave)光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)

3、，培育組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培育，8周后，分化出愈傷組織。但在藍光下培育，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍光下培育首先出現(xiàn)芽，構(gòu)成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。3光周期(light period)試管苗培育時要選用一定的光暗周期來進展組織培育，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研討闡明，對短日照敏感的種類的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時需求暗培育，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。 濕度 (humidity)濕度的影響包括培育容器堅持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受

4、培育基水分含量和封口資料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否那么，將使培育基干硬，以致不利于外植體接觸或插進培育基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。封口資料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封鎖性較高的封口資料易引起透氣性受阻，也會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。環(huán)境的相對濕度可以影響培育基的水分蒸發(fā)，普通要求70%80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)理濕度。濕度過低會使培育基喪失大量水分，導(dǎo)致培育基各種成分濃度的改動和浸透壓的升高，進而影響組織培育的正常進展。濕度過高時，易引起棉塞長霉，呵斥污染。 浸透壓(penetrating pressure)培育基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物

5、，因此，而影響到浸透壓的變化。通常12個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有妨礙作用，而56個大氣壓植物生長就會完全停頓，6個大氣壓植物細胞就不能生存。pH值 (pH value)不同的植物對培育基最適pH值的要求也是不同的(表21)，大多在5、65左右，普通培育基皆要求5.8，這根天性順應(yīng)大多植物培育的需求。 pH值適度因資料而異，也因培育基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。普通來說當(dāng)pH值高于65時，培育基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。由于高溫滅菌會降低pH值(約0.20.3個pH值)因此在配制時常提高pH值0203單位。pH值

6、大小調(diào)整可用01M的NaOH和0IM的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高02單位，lml的HCl可使pH值降低02單位。調(diào)理時一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7不同植物的最適pH值 氧氣(oxygen)氧氣是組織培育中必需的要素，瓶蓋封鎖時要思索通氣問題，可用附有濾氣膜的封口資料。通氣最好的是棉塞封鎖瓶口，但棉塞易使培育基枯燥，夏季易引起污染。固體培育基可加進活性炭來添加通氣度，以利于發(fā)根。培育室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣情況。液體振蕩培育時，要思索振蕩的次數(shù)、振幅等，同時要思索容器的類型、

7、培育基等 第二節(jié) 培育基的制備 一、母液(stock solution)的配制和保管在植物組織培育任務(wù)中，配制培育基是日常必備的任務(wù)。為簡便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取，而且還便于低溫保藏。普通母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。配制時留意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一同溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級較高的化學(xué)純或分析純。藥品的

8、稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。普通配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一同。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保管，用時再按比例稀釋。 母液的配制方法：單配法：將培育基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。普通用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴展一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一同定容到一定體積配成混合母液，濃度可用a mg/L表示，即配制一升培育基汲取該母液a ml.生長素配制時可先用少量95%酒精助溶。2，4D可用O1molL的NaOH或KOH助溶，參與溫水

9、定容。生長素常配成1mgml的溶液貯于冰箱中備用。細胞分裂素類普通先用少量1N鹽配溶解后，再參與溫水冷卻后定容，鐵鹽配法MS為例：在裝有400ml 蒸餾水的燒杯中參與2粒苛性鈉，溶解后參與3.73g EDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊漸漸參與2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至500ml，置于冰箱中備用。第三節(jié) 培育基的選擇在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適宜的培育基，最好先由一種已被廣泛運用的根本培育基(如Ms培育基或B5培育基)開場。當(dāng)經(jīng)過一系列的實驗，對這種培育基做了某些定性和定量的小變動之后，即有能夠得到一種能滿足實驗需求的新培育基，選擇最

10、正確培育基。常用實驗方法主要有單因子實驗、多因子實驗及廣譜實驗等。 一、單因子實驗在單因子實驗中由于培育基中其他成分都維持在普通程度上，所以只變動一個因子，就可以找出這一因子對實驗的影響和影響的程度。例如Ms根本培育基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培育物生根的影響，這種只研討一個要素的實驗就是單因子實驗。生物學(xué)實驗不同于物理學(xué)或化學(xué)實驗，最顯著的差別是在生物學(xué)實驗中必需設(shè)置對照組與實驗組，實驗組可以有一組或幾組，隨實驗的復(fù)雜性而設(shè)置，對照組也能夠有一組以上。實驗中要求對照組與實驗組中的實驗個體，即植物組織塊或其他培育物，必需在遺傳性、生理形狀、前培育條件等方面，盡能夠完全一致。

11、以保證實驗結(jié)果是來源于實驗因子，而不是由于實驗資料的不一致導(dǎo)致的。實驗中各處置普通都要設(shè)有一定的反復(fù)，以獲得可靠的實驗結(jié)果。隨實驗規(guī)模和要求不同，大多每個工程要有410瓶，每瓶至少3塊培育物或3叢小幼苗。2種激素5種濃度的實驗組合6-BAmg/L） 0 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 對培育基中兩個或兩個以上要素進展研討的實驗稱為多因子實驗，實驗可采用完全實驗方案，也可選用正交設(shè)計方案，完全實驗方案具有平衡完全的特點，各個

12、因子的每個程度都相互搭配，構(gòu)成了一切能夠的處置組合，如研討NAA和6BA的最正確濃度組合，每個因子各設(shè)5個濃度程度(0，0.5，2.5，5，10mgL)，這兩種因子各種濃度的一切組合，就構(gòu)成了一個具有25項處置的實驗見表33。 二、多因子實驗完全實驗方案實驗因子越多，處置數(shù)越多，實驗越復(fù)雜，耗費的精神、物力越多。為了減少實驗處置，但又能準(zhǔn)確全面地獲得實驗信息，通常采用正交實驗。例如，采用正交設(shè)計，在運用此表時就可以安排4個因子，3種程度的實驗，一共做9種不同搭配的實驗，其結(jié)果相當(dāng)于做了27次種種搭配的實驗。正交實驗雖然是多要素搭配在一同的實驗，但是在實驗結(jié)果的分析中，每一種要素所起的作用卻又可

13、以明白無誤地表現(xiàn)出來。因此，一次系統(tǒng)的實驗結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時間獲得成倍的收獲。在組織培育研討中，可用于同時探求培育基中適宜的幾種成分的用量，如細胞分裂素、生長素、糖和其他成分的用量。三、逐漸添加和逐漸排除的實驗方法在植物組織分化與再生的研討中，在沒有獲得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機營養(yǎng)成分，而在獲得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐漸減少這些成分。在逐漸添加時是使實驗勝利，在逐漸減少時是減少范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了適用上的需求竭力使培育基簡化，以降低本錢和利于推行。在尋求最正確激素配比時，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡一方法。 四、廣譜實驗法在廣譜實驗法

14、中，把培育基中一切組分分為4大類：無機鹽、有機營養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長素、細胞分裂素。對每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個濃度。4類物質(zhì)各3種濃度的自在組合即構(gòu)成了一項包括81個處置的實驗。在這81個處置中最好的一個可用4個字母表示。例如，一個包含中等濃度無機鹽，低等濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高等濃度有機營養(yǎng)物質(zhì)的處置即可表示為MLMH。到達這個階段，再試用不同類型的生長素和細胞分裂素即可找到培育基的最正確配方。這是由于不同類型的生K素和細胞分裂素對不同植物的活性有所不同。 第四章 操作技術(shù) 第一節(jié) 滅菌和接種 滅菌是組織培育重要的任務(wù)之一。初學(xué)者首先要清楚有

15、菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的外表都是有菌的。依此觀念，無菌室等未經(jīng)處置的地方、超凈臺外表、簡單煮沸的培育基、我們運用的刀、剪在未處置之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培育容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不人。在自然條件下忍受力強，生活條件要求簡單，繁衍力極強，條件適宜時便可大量繁殖。 無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處置后的物體(當(dāng)然這

16、些方法必需曾經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、安康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學(xué)元素滅菌劑等外表和內(nèi)部等等都是無菌的。從以上可以看出：在地球外表無菌世界要比有菌世界小得多。菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體外表和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把一切生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以經(jīng)過嚴(yán)厲滅菌的操作空間(接種室、超凈臺、等)和運用的器皿，以及操作者的穿著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件

17、下進展的操作，就叫做無菌操作。 常用的滅菌方法常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處置(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是運用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處置。這些方法和藥劑要根據(jù)任務(wù)中的不同資料不同目的適中選用。 濕熱滅菌培育基培育基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之添加。在o1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各

18、種細菌及其高度耐熱的芽孢。留意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才干徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：封鎖放氣閥，通電后，待壓力上升到O05MPa時，翻開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再封鎖放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升到達01MPa時壓力01-015MPa，20min。對高壓滅菌后不蛻變的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種器具，可以延伸滅菌時間或提高壓力。而培育基要嚴(yán)厲遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培育基中的成分蛻變或效能降低，不能隨意延伸時間。對于一些布制品，照實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐

19、高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培育基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培育基pH值的變化方向和幅度取決于多種要素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的那么相反。培育基中成分單一時和培育基中含有高或較高濃度物質(zhì)時，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有能夠產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會使培育基中的蔗糖水解為單糖，從而改動培育基的浸透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培育基約升高043倍。培育基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培育基值小于5.5，其水解量更

20、多，培育基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大加強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。 防止高壓滅菌培育基變化的方法：(1)經(jīng)常留意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培育基成分的資料，及時采取有效措施。(2)設(shè)計培育基配方時盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如防止運用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA替代IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)留意pH值對高壓滅菌下培育基中成分的影響等。(3)配制培育基時應(yīng)留意成分的適當(dāng)分組與參與的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后參與。(4)留意高壓滅菌后培育基pH值的變化及回復(fù)動態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。

21、這樣在實驗中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。 灼燒滅菌用于無菌操作的器械 在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，運用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立刻便用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 干熱滅菌玻璃器皿及耐熱器具干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱程度，通常采用170繼續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并枯燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應(yīng)漸進升溫，到達頂定溫度后記錄時間。烘箱內(nèi)放置的物

22、品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時延續(xù)電后，待充分冷涼，才干翻開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源耗費太大，浪費時間。 過濾滅菌不耐熱的物質(zhì) 一些生長調(diào)理劑，如赤霉素、玉米素、零落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處置，通常采用過濾滅菌方法。防細菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45m以下，當(dāng)溶液經(jīng)過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需求過濾滅菌的液體量大時，常運用抽濾安裝；液量小時，可用注射器。運用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。 紫外線和熏蒸滅菌空間(

23、1)紫外線滅菌 在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生構(gòu)造變化，引起細菌的染色體變異，呵斥死亡。紫外線的波長為200300nm，其中以260nm的殺菌才干最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的才干很弱，所以只適于空氣和物體外表的滅菌，而且要求距照射物以不超越1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌 用加熱熄滅、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w形狀分散到空氣中，以殺死空氣和物體外表的微生物。這種方法簡便，只需求把消毒的空間封鎖嚴(yán)密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間封鎖嚴(yán)密，按58mlm3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏

24、蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進展加熱熏蒸，但效果不如甲醛。 化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白量變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其外表張力，添加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。普通說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必需溶解于水才干發(fā)揚作用，所以要制成水溶形狀，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度普通是濃度越大，殺菌才干越強，但石炭酸和酒精例外。噴霧滅菌物體外表物體外表可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物資料外表等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%1%的新潔爾滅也可以。植物資料外表用消毒劑滅菌從外界

25、或室內(nèi)選取的植物資料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培育基，便會呵斥培育基污染。因此，植物資料必需經(jīng)嚴(yán)厲的外表滅菌處置，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培育基上，這一過程叫做接種。 第一步，將采來的植物資料除去不用的部分，將需求的部分仔細洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把資料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視資料清潔程度而宜。易漂浮或細小的資料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時特別有用。洗時可參與洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物外表的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物

26、質(zhì)是外表活性物質(zhì)吐溫。第二步是對資料的外表浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，預(yù)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物資料外表被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的資料，假照實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的資料，那么可只用70%酒精處置稍長的時間。處置完的資料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部資料。第三步是用滅菌劑處置。外表滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取12種運用見表。滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時間（min）去除的難易效果

27、次氯酸鈣910530易很好次氯酸鈉2530易很好氯化汞0.1158較難最好抗菌素450mg/L3060中較好常用滅菌劑運用濃度及效果比較表上述滅菌劑應(yīng)在運用前暫時配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來到達滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗34次即可；由于用升汞液滅菌的資料，難以對升汞殘毒較難去除，所以該當(dāng)用無菌水涮洗810次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時，把瀝干的植物資料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒人消毒溶液，不時用玻璃棒悄然攪動，以促

28、進資料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前12min，開場把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要留意勿使資料倒出，傾凈后立刻倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時間是從倒人消毒液開場，至倒入無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果，以便矯正。滅菌液要充分浸沒資料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中運用很多資料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫80或Tnton X效果較好，這些外表活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸人到滅菌的資料外表。但吐溫加人后對資料的損傷也在添加，應(yīng)留意吐溫的用量和滅菌時間，普通參與滅菌液的O.5%，即在100ml參與15滴。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗

29、要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。 二、無菌操作接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和任務(wù)人員本身引起，接種室要嚴(yán)厲進展空間消毒。接種室內(nèi)堅持定期用1%3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進展擦洗。除了運用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在運用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進展： (1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并翻開其內(nèi)紫外燈進展滅菌；(2)在接種前20min，翻開超凈任務(wù)臺的風(fēng)機以及臺上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手

30、，在緩沖間換好公用實驗服，并換穿拖鞋等；(4)上任務(wù)臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭任務(wù)臺面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培育皿要過火烤干；(6)接種時，接種員雙手不能分開任務(wù)臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7)接種終了后要清理干凈任務(wù)臺，可用紫外燈滅菌30min。假設(shè)延續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。三、接種 (1)將初步洗滌及切割的資料放人燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或濾紙上。(2)資料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對資料進展適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切

31、成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含l2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培育基上。詳細操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎程度拿著，使試管囗接近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。假設(shè)用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，悄然插入培育基。假設(shè)是葉片直接附在培育基上，以放13塊為宜。至于資料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無一致要求。放置資料數(shù)量如今傾向少放，經(jīng)過統(tǒng)計以為：對外植體每次接

32、種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培育基和人力，一旦培育物污染可以丟棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。第二節(jié) 培育和馴化 指把培育資料放在培育室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化構(gòu)成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。 1培育方法(1)固體培育法 即用瓊脂固化培育基來培育植物資料的方法。是如今最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但營養(yǎng)分布不均，生長速度不平衡，并常有褐化中毒景象發(fā)生。(2)液體培育法 即用不加固化劑的液體培育基培育植物資料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需求經(jīng)過攪動或振動培育液的方法以確保氧

33、氣的供應(yīng)，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進展培育，其速度普通為50-100rmin，這種定期浸沒的方法，既能使培育基均一，又能保證氧氣的供應(yīng)。 2培育步驟(1)初代培育 初代培育旨在獲得無菌資料和無性繁衍系。即接種某種外植體后，最初的幾代培育。初代培育時，常用誘導(dǎo)或分化培育基，即培育基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培育建立的無性繁衍系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培育時發(fā)育的方向可分為：1)頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動生長，從而構(gòu)成 一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的構(gòu)造。在幾個月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個枝條轉(zhuǎn)接繼代，反復(fù)芽苗

34、增殖的培育，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培育基上，就能得到可種植到土壤中去的完好的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以經(jīng)過這種方式來進展再生繁衍，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁衍方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代堅持原種類特性的一種繁衍方式。適宜這種再生繁衍的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌生后取枝條也可以。莖尖培育可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進展接種。在實踐操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培育，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用

35、靠培育定芽得到的培育物普通是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴繁時主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，構(gòu)成芽叢。 2)不定芽的發(fā)育在培育中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，構(gòu)成愈傷組織的細胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織構(gòu)成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先構(gòu)成芽，后構(gòu)成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的才干如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培育的條件下，培育基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了延續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物構(gòu)成不定芽的才干被大大地激發(fā)起來。許多種類的

36、外植體外表幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁衍的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物貯藏器官能劇烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量構(gòu)成不定鱗莖。在不定芽培育時，也常用誘導(dǎo)或分化培育基。用靠培育不定芽得到的培育物，普通采用芽叢進展繁衍，如非洲菊、草莓等。3)體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也經(jīng)過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織外表產(chǎn)生，也可從外植體外表已分化的細胞中產(chǎn)生，或從懸浮培育的細胞中產(chǎn)生，也可從外植體外表已分化的

37、細胞中產(chǎn)生，或從懸浮培育的細胞中產(chǎn)生。 (2)繼代培育在初代培育的根底上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需求進一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揚快速繁衍的優(yōu)勢。繼代培育是繼初代培育之后的延續(xù)數(shù)代的擴繁培育過程。旨在繁衍出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能到達邊繁衍邊生根的目的。繼代培育的后代是按幾何級數(shù)添加的過程。假設(shè)以2株苗為根底，那么經(jīng)10代將生成210株苗。繼代培育中擴繁的方法包括：切割莖段、分別芽叢、分別胚狀體、分別原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培育物。這種方法簡便易行，能堅持母種特性。培育基常是MS0根本培育基；分別芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培育基常是

38、分化培育基。假設(shè)芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人MS0培育基中，待到稍大時，再別分開來繼續(xù)培育。增殖運用的培育基對于一種植物來說每次幾乎完全一樣由于培育物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以可以按幾何級數(shù)增殖；在快速繁衍中初代培育只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培育那么是經(jīng)常性不停的進展過程。但在到達相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，那么應(yīng)思索使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖資料的分流，消費出廢品。 培育過程中常出現(xiàn)的問題及處理方法初代培育外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其外表開場褐變，有時甚至?xí)拐麄€培育基褐變的景象。它的出現(xiàn)是由

39、于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)分散到培育基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培育。 褐變的主要緣由植物種類 研討闡明，在不同種類間的褐變景象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差別，因此，有些花卉種類的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉種類的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培育過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的種類分別進展處置。生理形狀 由于外植體的生理形狀不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。普通來說，處于幼齡期的植物資料褐變程度較淺，而從曾經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。普

40、通來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。培育基成分 濃度過高的無機鹽會使某些欣賞植物的褐變程度添加，此外，細胞分裂素的程度過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變景象加深。培育條件不當(dāng) 假設(shè)光照過強、溫度過高、培育時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培育的外植體的褐變程度。減輕褐變景象發(fā)生的方法選擇適宜的外植體 普通來說，最好選擇生優(yōu)點于旺盛的外植體，這樣可以使褐變景象明顯減輕。適宜的培育條件 無機鹽成分、植物生長物質(zhì)程度、適宜溫度、及時繼代培育均可以減輕資料的褐變景象。運用抗氧化劑 在培育基中，運用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP

41、等抗氧化劑可以較為有效地防止或減輕很多外植體的褐變景象。另外，運用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。延續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的資料可間隔1224h的培育后，再轉(zhuǎn)移到新的培育基上，這樣經(jīng)過延續(xù)處置7-l0d后，褐變景象便會得到控制或大為減輕。 繼代培育時資料的玻璃化實際闡明，當(dāng)植物資料不斷地進展離體繁衍時，有些培育物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種景象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁衍系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。由于出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁衍系數(shù)大為降低。在不同的種類、種類間，試管苗的玻璃化程度也有所差別。當(dāng)培育基上細胞分裂素程

42、度較高時，也容易出現(xiàn)玻璃化景象。在培育基中添加少量聚乙烯醇、零落酸等物質(zhì)，可以在一定程度上減輕玻璃化的景象發(fā)生。 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉外表無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物程度較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進展正常移栽。這種情況主要是由于培育容器中空氣濕度過高，透氣性較差呵斥的，其詳細處理的方法為： 添加培育基中的溶質(zhì)程度，以降低培育基的水勢； 減少培育基中含氮化合物的用量； 添加光照； 添加容器通風(fēng)，最好進展CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的景象有明顯的作用； 降低培育溫度，進展變溫培育，有助于減輕試管苗玻璃化的景象發(fā)生； 降低培育基中細胞分裂素含量，可以思索參與適量零落酸。 3生根

43、培育當(dāng)資料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培育物分流到生根培育階段。假設(shè)不能及時將培育物轉(zhuǎn)到生根培育基上去，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁堵而使無效苗增多呵斥丟棄浪費。根培育是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培育可采用12或者1/4MS培育基，全部去掉細胞分裂素，并參與適量的生長素(NAA、IBA等)。誘導(dǎo)生根方法：將新梢基部浸入50或10010-6I IBA溶液中處置48h；在含有生長素的培育基中培育4-6d；直接移入含有生長素的生根培育基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前二種方法對新生根的生長發(fā)育那么更為有利。而第三種對幼根的生長有抑制造用。其緣由

44、是當(dāng)根原始體構(gòu)成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，那么不利于幼根的生長發(fā)育。不過這種方法比較可行。 另外也可采用以下方法就可生根：延伸在增殖培育基中的培育時間；有意降低一些增殖倍率，減少細胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法那么沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻嘤圃?，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處置，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時，那么需求在培育基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 從胚狀體發(fā)育成的小苗，經(jīng)常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長。但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗

45、數(shù)特別多，并且個體較小，所以也常需求一個低濃度或沒有植物激素的培育基培育的階段，以便壯苗生根。 試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了勝利地將苗移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗順應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以1820為宜。實際證明植物生長的溫度過高不但會牽涉到蒸騰加強。而且還牽涉到菌類易繁殖的問題。溫度過低使幼苗生長緩慢，或不易成活。春季低溫時苗床可加設(shè)電熱線，使墓質(zhì)溫度略高于氣溫23，這不但有利于生根和促進根系興隆，而且還有利于提早成活。 移植到試管外的植物苗光強度應(yīng)比移植前培育有所提高，并可順應(yīng)強度較高的漫射光，(約4000h左右)，以維持光協(xié)作用所需光照強度。但光線過強

46、刺激蒸騰加強，會使水分平衡的矛盾更鋒利。 二、試管苗移栽馴化試管苗移栽是組織培育過程的重要環(huán)節(jié)，這個任務(wù)環(huán)節(jié)做不好，就會呵斥前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)選擇適宜的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才干確保整個組織培育任務(wù)的順利完成。 試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供應(yīng)、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形狀等方面都與自然條件生長的正常小苗有著很大的差別。所以必需經(jīng)過煉苗，例如經(jīng)過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地順應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形狀、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適宜于自然環(huán)境，只需這樣才干保證試管苗順利移栽勝利。 從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不興隆

47、，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超越普通苗。由此可知，試管苗更適宜于高濕的環(huán)境生長，當(dāng)將它們移栽到試管外環(huán)境時，試管苗失水率會很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形狀特點，那么必需經(jīng)過與外界相順應(yīng)的馴化處置另外，對栽培馴化基質(zhì)要進展滅菌，由于試管苗在無菌的環(huán)境中生長，對外界細菌、真菌的抵御才干極差。為了提高其成活率，在培育基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200-500倍液，以進展滅菌處置。 ，通常采取的措施有：對外界要添加濕度、減弱光照；對試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐漸降低空氣濕度等。 移栽用基質(zhì)

48、 適宜于栽種試管苗的基質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處置，并不利于雜菌繁殖的特點，普通可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。為了添加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時需按比例搭配，普通用珍珠巖，蛭石，草炭土或腐殖土比例為1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1:1。這些介質(zhì)在運用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽?h烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習(xí)性來進展配制，這樣才干獲得稱心的栽培效果。以下引見幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。 (1)河砂:河砂分為粗砂、細砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為12mm。細砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為0.10.2mm。河砂的特點是排

49、水性強，但保水蓄肥才干較差，普通不單獨用來直接栽種試管苗。(2)草炭土:草炭土是由堆積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長時間的腐爛所構(gòu)成，其保水性好，蓄肥才干強，呈中性或微酸性反響，但通常不能單獨用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以運用。(3)腐殖土:腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所構(gòu)成。一種是自然構(gòu)成，一種是人為呵斥，人工制造時可將秋季的落葉搜集起來，然后埋人坑中，灌水壓實令其腐爛。第二年春季將其取出置于空氣中，在經(jīng)常噴水保濕的條件下使其風(fēng)化，然后過篩即可獲得。腐葉上含有大量的礦質(zhì)營養(yǎng)、有機物質(zhì)，它通常不能單獨運用。摻有腐殖土的栽培基質(zhì)有助于植株發(fā)根。移栽前的練苗移栽前可將培育物不開口移到自

50、然光照下鍛煉23d，讓試管苗接受強光的照射，使其長得壯實起來，然后再開口練苗12d，經(jīng)受較低濕度的處置，以順應(yīng)未來自然濕度的條件。移栽和幼苗的管理從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培育基，要全部除去，以防殘留培育基繁殖雜菌。但要悄然除去，應(yīng)防止呵斥傷根。栽植時用一個筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，留意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實，栽前基質(zhì)要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。保證空氣濕度達90%以上。 (1)堅持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件，使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培育瓶的條件，讓小苗一直堅持挺拔的形狀

51、。堅持小苗水分供需平衡首先營養(yǎng)缽的培育基質(zhì)要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭設(shè)小拱棚，以減少水分的蒸發(fā)，并且初期要常噴霧處置，堅持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)57d后，發(fā)現(xiàn)小苗有長趨勢，可逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，將拱棚兩端翻開通風(fēng)，使小苗順應(yīng)濕度較小的條件。約15d以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，逐漸減少澆水，促進小苗長得粗壯。(2)防止菌類繁殖。由于試管苗原來的環(huán)境是無菌的，移出來以后難以堅持完全無菌，因此，應(yīng)盡量不使菌類大量繁殖，以利成活。所以應(yīng)對基質(zhì)進展高壓滅菌或烘烤滅菌?？梢赃m當(dāng)運用一定濃度的殺菌劑以便有效地維護幼苗，如多菌靈、托布津，濃度8001000倍，噴藥宜7l0d一次。

52、在移苗時盡量少傷苗，傷口過多，根損傷過多，都是呵斥死苗的緣由。噴水時可參與0.1%的尿素，或用12MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生長與成活。 (3)一定的溫、光條件。試管苗移栽以后要堅持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18200C，冬春季地溫較低時，可用電熱線來加溫。溫度過低會使幼苗生長緩慢，或不易成活。溫度過高會使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡遭到破壞，并會促使菌類繁殖。另外在光看管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報紙等，以防陽光灼傷小苗和添加水分的蒸發(fā)。當(dāng)小植株有了新的生長時，逐漸加強光照，后期可直接利用自然光照。促進光合產(chǎn)物的積累，加強抗性，促其成活。(4)堅持基質(zhì)適當(dāng)

53、的通氣性。要選擇適當(dāng)?shù)念w粒狀基質(zhì)，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利根系呼吸。綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只需把水分平衡、適宜的介質(zhì)、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的。 愈傷組織callus的構(gòu)成和形狀發(fā)生 植物的脫分化方式有兩種，器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型，在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細胞中，無須閱歷愈傷組織階段，但大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細胞中發(fā)生的。 一 愈傷組織構(gòu)成的條件雖然如全能性所言，發(fā)育和分化過程并不導(dǎo)致細胞全能性的喪失，但是，在一個完好的植物中，每個分化細胞都是某個器官和組織中的一個成員，它只能

54、在與其周圍成員相互協(xié)調(diào)和彼此制約當(dāng)中，恰如其分地發(fā)揚整個植株所賦予它的一定的功能，而不具備發(fā)揚其全能性的外部條件。然而，這些細胞假設(shè)是一旦脫離了母體植株，擺脫了原來所遭到的遺傳上的控制和生理上的制約，在不定期下的培育條件下，就會發(fā)生一種回復(fù)變化，從而失去分化形狀，變?yōu)榉稚毎?，實現(xiàn)脫分化過程。然后，這些脫分化細胞經(jīng)過延續(xù)的有絲分裂，構(gòu)成愈傷組織離體隔離。大量研討闡明，幾乎一切高等植物的各種器官，如根、莖、葉和花等，以及各種組織，如皮層、莖髓和構(gòu)成層等，離體后在適當(dāng)條件下，都能產(chǎn)生愈傷組織。由此可見，愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源和種類，而是培育條件，其中激素的種類和濃度最為重要。當(dāng)

55、然，外植體的類型和外植物體原來在植株上所處的位置反映了內(nèi)源激素程度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響也不能忽視。二愈傷組織構(gòu)成的過程外植體中已分化的活細胞，在外源激素的誘導(dǎo)下經(jīng)過脫分化后構(gòu)成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個時期誘導(dǎo)期、分裂期和構(gòu)成期。誘導(dǎo)期：細胞分裂的預(yù)備期誘導(dǎo)期是細胞預(yù)備進展分裂的時期。接種的外植體資料的細胞通常都是成熟細胞，處于靜止形狀，細胞大小沒有多大變化，外觀無明顯特征，但細胞內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，王凱基等1981在研討離體培育的油橄欖莖段時發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)合成代謝活潑，RNA含量迅速添加，細胞核體積明顯增大。誘導(dǎo)期的長短，因植物種類和外植體的生理情況和外部要素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好幾天

56、，新穎的菊芋塊莖那么只需22h，但菊芋塊莖經(jīng)過5個月的貯藏后，誘導(dǎo)期那么須延伸到40h以上。分裂期：細胞從開場分裂到繼續(xù)分裂的時期分裂期是指細胞經(jīng)過一分為二的分裂，不斷增生子細胞的過程。外植體的細胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，其外層細胞開場迅速分裂，使細胞脫分化。分裂期主要表現(xiàn)如下：1.細胞的數(shù)目迅速添加。如胡蘿卜培育7天后，細胞數(shù)可添加10倍。2.每個細胞平均鮮重下降。這是由于細胞鮮重的添加不如細胞數(shù)目的添加快的緣故。3.細胞體積小，內(nèi)無液泡，好像根尖和莖尖的分生組織細胞特性。4細胞的核和核仁增大到最大。 5.細胞中RNA含量減少，而DNA含量堅持不變。 6. 隨著細胞不斷分裂和組織生長，細胞的總干重、蛋

57、白質(zhì)和 核酸含量大大添加，新細胞壁的合成極快?？傊?，分裂期的愈傷組織的共同特征是：細胞分裂快，構(gòu)造疏松，短少有組織的構(gòu)造，維持其不分化的形狀。構(gòu)成期：從愈傷組織到器官發(fā)生構(gòu)成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后構(gòu)成了無序構(gòu)造的愈傷組織的時期。進入構(gòu)成期后，細胞的平均大小相對穩(wěn)定，不再減少，細胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層部分細胞的分裂，結(jié)果構(gòu)成瘤狀或片狀的擬分生組織meristemoid，稱做分生組織結(jié)節(jié)。分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長中心，或者進一步分化為維管組織結(jié)節(jié)由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細胞作平周分裂成為構(gòu)成層狀細胞，并構(gòu)成了部分維管組織如管胞、纖維細胞等，但不構(gòu)成維

58、管系統(tǒng)。由于此期細胞分裂已根本停頓，細胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開場構(gòu)成一些不同形狀和功能的細胞，因此有人又將此期稱為分化期。 愈傷組織的繼代培育脫分化細胞不斷進展分裂，從而構(gòu)成了愈傷組織，愈傷組織在培育基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必需轉(zhuǎn)移到新穎培育基上培育。這個過程叫做繼代。經(jīng)過繼代培育，可使愈傷組織無限期地堅持在不分的增殖形狀。然而，假設(shè)讓愈傷組織留在原培育基上繼續(xù)培育而不繼代，它們那么不可防止地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的構(gòu)造。 三 愈傷組織的生長 普通來說，愈傷組織的增殖生長只發(fā)生在不與瓊脂接觸的外表，而與瓊脂接觸的一面極少細胞增殖，只是細胞分化構(gòu)成嚴(yán)密

59、的組織塊。它是愈傷組織外表或近外表瘤狀物生長的結(jié)果。愈傷組織之間的質(zhì)地有顯著不同，有的很松脆，有的很堅實，且這兩類愈傷組織可相互轉(zhuǎn)變。其方法是：參與高濃度的生長物質(zhì)，可使堅實的愈傷組織變?yōu)樗纱唷７粗?，減低或除去生長物質(zhì)，那么松脆的愈傷組織可以轉(zhuǎn)變?yōu)閳詫崱Ｋ纱嘤鷤M織都有大量的分生組織上中心，進展活潑的細胞分裂，為大而未分化的細胞所分開；而不脆確實良愈傷組織很少分化，大都是高度液泡化的細胞。脆的愈傷組織是進展懸浮培育最適宜的資料，稍經(jīng)機械振蕩，即可使組織分散成單細胞或少數(shù)幾個細胞組成的小細胞團。在培育中細胞產(chǎn)生迅速增殖，而堅實的愈傷組織中的細胞間被果膠質(zhì)緊緊地粘著，因此往往不能構(gòu)成良好的懸浮系統(tǒng)

60、。愈傷組織的質(zhì)地不同是由其內(nèi)部構(gòu)造上的差別所引起的。堅實致密的愈傷組織內(nèi)無大的細胞間隙，而由管狀細胞組成維管組織；松脆愈傷組織內(nèi)有大量的細胞間隙，細胞陳列毫無次序。生長旺盛的愈傷組織普通呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。 外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理情況而有很大差別，如煙草、胡蘿卜等脫分化較易，而禾谷類的脫分化較難；花器脫分化較易，而莖葉較難；幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。一個多細胞外植體通常包含著各種不同類型的細胞，因此，由它所構(gòu)成的愈傷組織也是異質(zhì)性的，其中不同的組分細胞具有不同的構(gòu)成完好植株或器官的才干，即不同的再分化才干