常見豬病檢測方法(共30頁)

1、PAGE PAGE - 36 -豬病診斷(zhndun)技術(shù)(jsh)規(guī)范(gufn)一、致病性大腸桿菌的檢測1 引用標準參考NY/T 555-2002（動物產(chǎn)品大腸桿菌、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測方法）。2 范圍適用于豬大腸桿菌病的診斷。3 檢測方法3.1 材料3.1.1 營養(yǎng)肉湯3.1.2 營養(yǎng)瓊脂3.1.3 EMB3.1.4 TSI3.1.5 IMViC生化鑒定管3.1.6 小白鼠3.2 分離培養(yǎng)將采集的肝、脾、心血或腸內(nèi)容物等分別接種伊紅美蘭瓊脂平板（同時接種營養(yǎng)肉湯增菌備用），置37 培養(yǎng)1824 h。觀察培養(yǎng)特性，挑取黑色有金屬光澤的菌落，用該菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。如可見到兩

2、端鈍圓并多以單個存在的革蘭氏陰性粗短桿菌，應(yīng)取510個典型菌落再接種于TSI瓊脂。同時挑取典型菌落接種營養(yǎng)瓊脂，37 培養(yǎng)1618 h的菌液用于生化特性鑒定。3.3 生化鑒定挑取上述菌落純培養(yǎng)物接種以下生化培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵管，(361) 培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。3.3.1 靛基質(zhì)試驗：滴加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑0.1 mL于靛基質(zhì)試驗培養(yǎng)基中混合(hnh)，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色環(huán)的為反應(yīng)陽性(yngxng)；出現(xiàn)黃色環(huán)的為反應(yīng)陰性。3.3.2 甲基紅（MR）試驗(shyn)滴加甲基紅指示劑0.2 mL于MR-VP培養(yǎng)基中混合，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)；出現(xiàn)黃色為陰性反應(yīng)。VP試驗滴加VP試

3、劑甲液0.2 mL于MR-VP培養(yǎng)基中混勻，再滴加VP試劑乙液0.1 mL混勻，靜置，觀察結(jié)果。在15 min內(nèi)出現(xiàn)紅色的為陽性反應(yīng)；無顏色變化的為陰性反應(yīng)。陰性結(jié)果1 h后再觀察一次，出現(xiàn)紅色也為陽性反應(yīng)。3.3.4 枸櫞酸鹽試驗：觀察培養(yǎng)基顏色變化，出現(xiàn)藍色為陽性反應(yīng)；不變色為陰性反應(yīng)。3.4 大腸桿菌鑒定結(jié)果應(yīng)符合表1要求。表1 大腸桿菌鑒定結(jié)果靛基質(zhì)MRVP枸櫞酸鹽鑒定+-典型大腸埃希氏桿菌-+-非典型大腸埃希氏桿菌+-+典型檸檬酸鹽桿菌-+-+非典型檸檬酸鹽桿菌-+典型產(chǎn)氣桿菌+-+非典型產(chǎn)氣桿菌出現(xiàn)表1的生化反應(yīng)類型時，如果為組織樣品，由此可初步報告為致病性大腸桿菌。如果為糞便，尿

4、液，飼料，飲水，應(yīng)進一步做致病性試驗。3.4 致病性試驗取經(jīng)營養(yǎng)肉湯37 培養(yǎng)1618 h后的純化菌株培養(yǎng)液，分別腹腔接種體重20g左右的小白鼠，每株接種23只，每只0.3 mL（含菌量約為11012 cfumL），同時用相同數(shù)量的小白鼠接種無菌肉湯作對照。飼養(yǎng)(syng)觀察、記錄死亡數(shù)，并從死亡鼠的心、肝中回收接種菌。在24小時內(nèi)出現(xiàn)死亡(swng)的可報告為致病性大腸桿菌。4 藥敏試驗(shyn)挑選瓊脂平板上典型菌落接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)中，37 培養(yǎng)1618 h，菌液用于藥敏試驗。將肉湯培養(yǎng)物（用標準比濁管比較達相同濁度）稀釋至含菌量為1109 cfumL，搖勻后蘸取菌懸液均勻涂布于瓊脂平

5、板上，然后用無菌鑷子將藥敏片貼附其上，每紙片25張，置37 培養(yǎng)24 后觀察。根據(jù)抑菌圈大小來判定其對藥物的耐受性，選擇敏感藥物。二、沙門氏菌的檢測1 引用標準 參考NY/T 550-2002（動物和動物產(chǎn)品沙門氏菌檢測方法）。2 范圍適用于豬沙門氏菌病的診斷。3 檢測方法3.1 材料3.1.1 SC3.1.2 DHL3.1.3 TSI3.1.4 賴氨酸脫羧酶（LD）3.1.5 鄰-硝基酚-D-半乳糖苷（DNPG）3.1.6 甘露醇糖發(fā)酵管3.2分離培養(yǎng)采集疑似病例的肝、脾、心血或腸內(nèi)容物樣品。無菌剪取肝、脾樣品1 g，投入10 mL SC增菌液中（血液、糞便樣品可以(ky)采適量直接投入10

6、 mL增菌液），361 培養(yǎng)(piyng)1824 h。取一接種(jizhng)環(huán)增菌液劃線接種于DHL瓊脂平板上，361 培養(yǎng)1824 h。觀察平板上菌落生長形態(tài)。沙門氏菌在DHL平板上呈無色半透明，產(chǎn)硫化氫（H2S），菌落中心黑色或幾乎全黑色。3.3 生化鑒定挑取DHL平板上可疑菌落35個，每個菌落先洗入TSI培養(yǎng)基冷凝水中，繼而在斜面上劃線接種并高層穿刺接種。再挑取同一菌落依次接種氨基酸脫羧酶發(fā)酵試驗（LD）和ONPG，甘露醇糖發(fā)酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困難，可用接種環(huán)醮取TSI培養(yǎng)基中冷凝水接種其余生化管，361 培養(yǎng)1824 h（挑取菌落后的平板，應(yīng)置于4 冰箱保留

7、48 h以備復(fù)查）。按表1記錄反應(yīng)結(jié)果，對照表2進行判定。凡符合表2生化反應(yīng)模式，可報告為沙門氏菌。表1 生化反應(yīng)結(jié)果判定生化管TSILDONPGMAN底a斜面b硫化氫第一次顏色記錄符合黃+黃+黑+紫+深黃+黃+第二次顏色記錄符號紅-紅-無黑色-黃-無色或淡黃-紫-a “底”觀察葡萄糖反應(yīng)。b “斜面”觀察乳糖和蔗糖反應(yīng)。表2 生化檢測沙門氏菌屬判定表序號TSILDONPGMAN判定底斜面硫化氫ABaCDbEcFdG+-+-+-+-+-+-+-+-+-沙門氏菌亞種、沙門氏菌亞種b、15a沙門氏菌亞種a、15b、15少數(shù)沙門氏菌亞種少數(shù)沙門氏菌亞種甲型副傷寒沙門氏菌非沙門氏菌a含1硫化氫陽性的大

8、腸埃希氏菌，可加試靛基質(zhì)加以鑒別，其中大腸桿菌陽性，沙門氏菌陰性。b賴氨酸陰性的沙門氏菌主要有：甲型副傷寒、傷寒、豬霍亂沙門氏菌孔成道夫變種、雞等。c 硫化氫陰性的沙門氏菌主要有：甲型副傷寒、傷寒、豬霍亂、豬傷寒、仙臺、貝塔、巴布亞、雞、馬流產(chǎn)、山夫登堡、都柏林登。d可直接用（O）單因子血清證實，以排除雷極氏普羅菲登斯菌登。4 藥敏試驗(shyn)挑選DHL平板上典型菌落接種營養(yǎng)(yngyng)肉湯培養(yǎng)中，361 培養(yǎng)(piyng)1618 h，菌液用于藥敏試驗。將肉湯培養(yǎng)物（用標準比濁管比較達相同濁度）稀釋至含菌量為1109 cfumL，搖勻后蘸取菌懸液均勻涂布于瓊脂平板上，然后用無菌鑷子將

9、藥敏片貼附其上，每紙片25張，置361 培養(yǎng)24 后觀察。根據(jù)抑菌圈大小來判定其對藥物的耐受性，選擇敏感藥物。三、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測1 引用標準 自定標準。2 范圍適用于豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷。3 材料3.1 綿羊血瓊脂3.2 牛乳培養(yǎng)基。4 組織染色鏡檢對疑似病例的腸道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直桿狀，兩端鈍圓，單在或成雙，無鞭毛，不運動。芽孢大而卵圓，位于菌體中央或近端，多數(shù)菌株可形成莢膜。5 分離培養(yǎng)可將腸道內(nèi)容物接種血平板，37 厭氧培養(yǎng)1824 h后觀察。菌落特點：魏氏梭菌在血平板上可形成直徑25 mm、圓形、邊緣整齊、灰色至灰黃色、表面光滑半透明、圓屋頂狀菌落，有雙層溶血環(huán)?？赏ㄟ^

10、鏡檢對形態(tài)進一步確定。6 生化(shn hu)鑒定對牛乳(ni r)培養(yǎng)基的“暴烈(boli)發(fā)酵”。7 腸內(nèi)毒素檢查采集空腸后段或結(jié)腸前段內(nèi)容物，加適量生理鹽水稀釋，經(jīng)離心沉淀后取上清液分成兩份，一份加熱（60 30min）。兩份上清液分別靜脈注射家兔（13ml）或小鼠（0.10.3ml）。如有毒素存在，不加熱組動物常于數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)死亡，而加熱組動物不死亡。8 報告因為正常人畜腸道內(nèi)存在此菌，并且發(fā)病菌主要靠在腸道內(nèi)產(chǎn)生毒素致病，細菌本身并不侵入機體。因此只有細菌分離和腸毒素檢查都符合，并結(jié)合臨床癥狀才能報告產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。鑒別A型和C型要靠中和保護試驗。四、豬痢疾診斷1 引用標準參考

11、NY/T 545-2002。2 范圍適用于豬痢疾（SD）的實驗室診斷。3 糞便中Sh顯微鏡檢查3.1 材料3.1.1 器材：顯微鏡，暗視野鏡頭，玻片及蓋玻片，酒精燈等3.1.2 染色液：結(jié)晶紫染色液或稀釋的石炭酸復(fù)紅。3.1.3 樣品：病豬新鮮糞便（含粘）或直腸拭子或大腸內(nèi)容物及黏膜3.2 操作方法3.2.1 染色樣品制作：取樣品直接抹片，干燥，火焰固定，以1.2.2結(jié)晶紫液或稀釋復(fù)紅染色2 min3 min，水洗，吸干后待檢。3.2.3 懸滴樣品制作：取樣品少許(shox)懸于生理鹽水，待檢。每份樣品(yngpn)最少制片2張3.2.4 顯微鏡檢查：染色(rns)樣品以油鏡直接觀察，懸滴樣品

12、在暗視野4001000倍鏡頭下觀察。3.3 結(jié)果判定典型Sh菌體長6 m8.5 m，呈25個密螺旋體，兩端尖銳，呈蛇樣活潑運動。當視野中有數(shù)量（35條以上）Sh樣菌體時，在獲培養(yǎng)前，可作為診斷的重要參考。4 分離培養(yǎng)和鑒定4.1 材料準備4.1.1 器材：厭氧培養(yǎng)裝置及使用方法，細菌學(xué)實驗常規(guī)器材，外科手術(shù)器材，微孔濾器和0.65 m濾膜。4.1.2 試驗動物：小鼠（20 g左右）4.1.3 試劑：PBS(0.01M，pH7.2)，生理鹽水，多粘菌素，TSA。4.1.4 樣品：病豬新鮮糞便或大腸粘膜刮取物（含粘液）。對死豬或撲殺豬大腸分段結(jié)扎（每段10cm），分離取出。樣品應(yīng)盡早分離培養(yǎng)，也可

13、04 保存47 d。4.2 操作方法4.2.1 樣品種Sh鏡檢將樣品少許摸片染色或作成懸滴標本，鏡檢，觀察Sh有無活力。含菌量少且無活力者，則難以分離成功。4.2.2 分離培養(yǎng)4.2.2.1 直接劃線分離法：即取樣品直接在TSA上劃線接種若干皿。4.2.2.2 集菌法：先將樣品以生理鹽水或PBS作1：5稀釋，2000 r/min，棄去沉淀。將上清液再以60008000 r/min離心20 min。取沉淀劃線接種TSA若干皿。4.2.2.3 稀釋法：將樣品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀釋至10-610-8。取各梯度稀釋液各1滴，分別劃線接種于TSA上，（每梯度稀釋液最少接種3皿）。接種后的培養(yǎng)皿

14、置厭氧罐內(nèi)進行厭氧培養(yǎng)。若上述稀釋液中加入多粘菌素200 U/mL300 U/mL，可提高分離率。4.3 結(jié)果(ji gu)判定4.3.1 觀察(gunch)每隔24 d開罐檢查一次，共24次，觀察(gunch)有無溶血區(qū)及溶血菌落。致病性Sh呈強溶血，一般看不見菌落。當培養(yǎng)條件適宜時，再溶血區(qū)可見到云霧狀菌苔。無害蛇樣螺旋體等呈弱溶血。4.3.2 移植純化先作溶血區(qū)內(nèi)物質(zhì)涂片，染色鏡檢。如見Sh樣菌體，可在無菌落溶血區(qū)內(nèi)移取小塊瓊脂劃線于TSA若干皿。如此每隔2天移植一次，一般24次后即可純化和保存。4.3.3豬蛇樣螺旋體鑒定4.3.3.1 溶血試驗將豬蛇樣螺旋體、無害蛇樣螺旋體或毛腸蛇樣螺

15、旋體及被檢菌株，分別劃線于同一TSA上不同區(qū)內(nèi)，經(jīng)48 h培養(yǎng)后，觀察比較其溶血程度。4.3.3.2 腸致病性試驗每菌株至少接種6只小鼠，將小鼠停飼24 h后，每只每次灌服1 mL（含菌35億），次日再灌服一次，15 d后剖檢觀察盲腸病變。感染后50出現(xiàn)腹瀉和病變者，則為致病性Sh。五、豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)1 引用標準參考NY/T 564-2002。2 范圍適用于豬巴氏桿菌病的檢測。3 材料3.1 改良馬丁氏瓊脂3.2 馬丁氏肉湯3.3 常用生化培養(yǎng)基。4 組織(zzh)染色鏡檢用肝臟組織或心血(xnxu)摸片或純培養(yǎng)物染色呈陰性，瑞氏染色呈兩極濃染的球桿菌。5 病原分離(fnl)鑒定將瀕死前

16、或死后數(shù)小時內(nèi)以無菌手術(shù)采取病死豬的心血、肝臟組織，接種于改良馬丁氏瓊脂斜面，進行分離。培養(yǎng)1824 h后，改良馬丁瓊脂斜面生長純粹的培養(yǎng)物，呈微藍色菌臺或菌落。馬丁肉湯培養(yǎng)物生長為均勻渾濁，不產(chǎn)生菌膜。6 生化鑒定本菌發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多數(shù)發(fā)酵蔗糖，不發(fā)酵乳糖、肌醇、菊糖、水楊素及鼠李糖，吲哚試驗和氧化酶試驗陽性。7 診斷判定根據(jù)臨床癥狀和病理變化，加上涂片染色鏡檢，可對本病作出初步的診斷，但確診要靠病原分離鑒定。六、豬鏈球菌病診斷技術(shù)1 引用標準參考GB/T 199 15.2-2005和GB/T 199 15.9-20052 范圍適用于豬鏈球菌病診斷。3 材料3.1 綿羊血瓊脂4

17、組織染色鏡檢對最急性和急性病例，無菌采取集病死豬的心、肝、脾、肺、腎和淋巴結(jié)等組織做觸片，姬姆薩染色，鏈球菌可見較純的單個或成雙的圓形或橢圓形球菌, 有少量形成短鏈和長鏈，如見鏈球菌則表明病料中可能含有鏈球菌。5 病原分離鑒定無菌取心、肝、脾、肺、腎或淋巴結(jié)內(nèi)部組織劃線接種(jizhng)普通瓊脂綿羊血平板，361培養(yǎng)(piyng)242 h，如果菌落生長(shngzhng)緩慢，可延長至482 h后觀察。如果是豬鏈球菌2型，培養(yǎng)24 h，在普通瓊脂綿羊血平板形成圓形、微凸、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的菌落，直徑0.3 mm1mm，大多數(shù)菌株呈溶血，部分菌株產(chǎn)生溶血。將可疑菌落做革蘭氏染

18、色和過氧化氫酶試驗。本菌為革蘭氏陽性球菌，菌體直徑l固體培養(yǎng)物以雙球菌為多，少量呈3個5個排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以鏈狀為主，無芽孢，能形成莢膜。本菌過氧化氫酶試驗均為陰性。菌落生長特征、革蘭氏染色、菌體形態(tài)和過氧化氫試驗符合者，可初步確定為鏈球菌。6 生化鑒定 經(jīng)初步鑒定后，做5乳糖、海藻糖、七葉苷、甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉等糖發(fā)酵試驗。7 PCR鑒定是否為豬鏈球菌2型 必要時進行豬鏈球菌2型毒力因子PCR檢測。7.1 儀器：臺式高速（12000 r/min）離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支

19、，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL（與擴增儀配套）塑料管。7.2 試劑7.2.1 細菌DNA提取試劑盒7.2.2 2.5 mmol/L dNTP7.2.3 10PCR Buffer7.2.4 25 mmol/L MgCl27.2.5 10 pmol/L引物7.2.6 Taq DNA聚合酶7.2.7 50TAE（保存液）和1TAE（使用液）7.2.8 瓊脂糖：電泳(din yn)級7.2.9 CYBgreen7.3 PCR引物根據(jù)豬鏈球菌2型溶血(rn xu)素基因設(shè)計引物，引物序列如下，其目的片斷(pindun)長度為495 bp。sl

20、y1：5-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3(1542)sly2：5-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3(2036)7.4 DNA提取 利用對數(shù)生長期的液體培養(yǎng)物，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書進行。7.5 PCR擴增反應(yīng)體系25L：細菌總DNA 5.0L10 pmol/L的上游引物 1.0L10 pmol/L的下游引物 1.0L2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0L10PCR Buffer 2.5L25 mmol/L的MgCl2 2.0L5 U的TaqDNA聚合酶 0.3L雙蒸水補至25L。循環(huán)參數(shù)：95 預(yù)變性 5 min；94 變性 1 min；56 退

21、火 1 min； 共35個循環(huán)，72 延伸 1 min； 72 延伸10 min，4 保存。7.6 電泳檢測取1.5g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取810l PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液和CYBgreen混合后加樣，進行電泳。電壓大小根據(jù)電泳槽長度來確定，一般控制在3 V/cm5V/cm，電泳時間為30 min35 min。將電泳好的凝膠放紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。陽性(yngxng)對照的PCR產(chǎn)物電泳后在495 bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后沒有條帶，試驗結(jié)果成立。在試驗結(jié)果

22、成立的前提下，如果樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在495 bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，判為該菌株含有豬鏈球菌2型溶血素基因。七、副豬嗜血(sh xu)桿菌（Hps）PCR診斷(zhndun)技術(shù)1 引用標準自定標準。2 范圍副豬嗜血桿菌診斷。3材料3.1 儀器：臺式高速（12000 r/min）離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL（與擴增儀配套）塑料管。3.2 試劑3.2.1 TSA培養(yǎng)基3.2.2 TSB培

23、養(yǎng)基3.2.3 10 mmol/L Tris/1 mmol/L EDTA溶液中3.2.4 溶菌buffer (0.0005%Tween20，0.24 mg/mL proteinaseK和0.1 mol/L Tris，pH8.5)3.2.5 2.5 mmol/L dNTP3.2.6 10PCR Buffer3.2.7 25 mmol/L MgCl23.2.8 10 pmol/L引物3.2.9 50TAE（保存(bocn)液）和1TAE（使用(shyng)液）3.2.10 Loading Buffer3.2.11 瓊脂糖3.2.12 CYBgreen4 操作方法4.1 鏡檢對從臨床癥狀疑似副豬嗜血

24、桿菌病的發(fā)病仔豬的肺和脾作組織(zzh)觸片，革蘭氏染色，副豬嗜血桿菌鏡檢呈革蘭氏陰性小球桿菌。4.2 分離培養(yǎng)取出患病仔豬病變肺、氣管分泌物、胸水、腹水及脾組織，劃線接種于TSA平板。37 ，5%CO2培養(yǎng)2448。副豬嗜血桿菌呈無色、透明、濕潤、光滑的露珠樣細小菌落，革蘭氏染色呈陰性小球桿菌，老齡培養(yǎng)物呈多形態(tài)(細小桿狀、短鏈狀和長絲狀)。4. 3 PCR引物設(shè)計 HP 16S1：5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 HP 16S2：5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3該引物擴增出編碼16SrRNA的DNA部分片段，長度為822 bp。 tbpA55：5-TTAGCCT

25、TGCTCTTCTTAGCC-3 tbpA33：5-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3 該引物擴增出編碼轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A的DNA部分片段，長度為1.9 kb。4.4 細菌DNA提取將TSA平板上典型菌落接種TSB，37 過夜培養(yǎng)，取對數(shù)生長期分離菌懸浮于10 mmol/L Tris/ 1 mmol/L EDTA溶液中，10000 r/min離心5min；棄上清，沉淀用溶菌buffer重懸；56 作用30 min；最后煮沸15 min；12000 r/min離心5min；收集上清，-20 保存?zhèn)溆?。注：DNA的提取可以用試劑盒，按試劑盒操作說明進行，以節(jié)省時間，減少DNA損失。4

26、.5 編碼16S rRNA的DNA部分(b fen)片段的擴增反應(yīng)(fnyng)體系25L：細菌(xjn)總DNA 2.0L10 pmol/L的上游引物 1.0L10 pmol/L的下游引物 1.0L2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0L無Mg2+緩沖液 2.5L25 mmol/L的MgCl2 1.5L5 U的TaqDNA聚合酶 0.3L雙蒸水補至25L。循環(huán)參數(shù)：95 預(yù)變性 5 min；94 變性 30 s；59退火 30 s； 共30個循環(huán)，72 延伸 90 s；72 延伸 10 min。4.6 編碼tbpA的DNA部分片段的擴增反應(yīng)體系同4.5，循環(huán)參數(shù)為：94 預(yù)變性 5

27、min;94 變性 1 min； 50 退火 1 min； 共30個循環(huán)72延伸 2 min；最后72 延伸 10 min。4.7 結(jié)果分析與判定4.7.1 1瓊脂糖凝膠板的制備稱取1 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。4.7.2 加樣取68 L PCR擴增產(chǎn)物(chnw)和23 L加樣緩沖液和適量(shling)CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳至少(zhsho)加1孔陽性對照的擴增產(chǎn)物作為對照，沒有陽

28、性對照的情況下，一定加Marker。4.7.3 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。4.8.4 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大小（820 bp和1.9 kb）一致，則該樣品判定為陽性。5 診斷判定同份樣品在2個PCR中全部陽性的才可以判為本豬（群）已經(jīng)感染Hps，根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判定豬群是否發(fā)病。八、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）PCR檢測技術(shù)1 引用標準自定標準。2 范圍 適用于PRR

29、S的PCR診斷。3材料3.1 儀器：組織勻漿機；低溫臺式高速（12000 r/min）離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL（與擴增儀配套）塑料管。3.2 試劑3.2.1 Trizol試劑3.2.2 氯仿3.2.3異丙醇3.2.4 反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶M-MLV（200 U/L）3.3.5 75%乙醇(y chn)3.2.6 0.1%焦碳酸(tn sun)二乙酯（DEPC）水溶液3.2.7 2.5 mm

30、ol/L dNTP3.2.8 10PCR Buffer3.2.9 25 mmol/L MgCl23.2.10 10 pmol/L引物3.2.11 50TAE（保存液）和1TAE（使用液）3.2.12 Loading Buffer3.2.13 瓊脂糖3.2.14 Oligo(dT)18（50 mol/L）3.2.15 CYBgreen4 操作步驟4.1 樣品采集取疑似豬的肺臟、淋巴結(jié)和脾臟病變部位組織，-20 保存?zhèn)溆谩?.2 樣品處理取部分組織樣品，磨碎并用0.01M PBS（PH 7.27.4）稀釋成1: 5乳劑（或?qū)⒉×嫌眉舻都舫尚K，放入5 mL青霉素小瓶，進一步剪碎，按5倍體積的0.0

31、1M PBS后，用勻漿機勻漿），-20保存?zhèn)溆没蛄⒓从糜赗NA提取。4.3 RNA的提取取處理好的稀釋樣品200300 L，加入700 L TRIZOL試劑，渦懸混勻，在1530 溫育23 min；加入200 L的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，1530溫育23 min，28 12000 g離心15 min；轉(zhuǎn)移水相500 L到一新的離心管中，加入0.5 mL的異丙醇，1530作用10 min，28 12000 g離心10 min；棄去上清液，加入75%乙醇1.0 mL，振搖，28 7500 g離心5 min；棄去上清，干燥(gnzo)沉淀物（室溫約5 min）；加入(jir)20 L

32、DEPC水溶解(rngji)，-20 保存或立即使用（置冰上）。4.4 引物設(shè)計根據(jù)文獻和PRRSV代表株VR2332和LV設(shè)計了一對引物：PRRSV N1： 5-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3PRRSV N2： 5-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-34.5 RT總體積為10 L，反應(yīng)體系如下：5RT buffer 2.0 LdNTP（10 mmol/L） 0.25 LOligo(dT)18 0.5 LRNA 模板 7 L混勻離心，65 作用10 min，冰上冷卻，加入M-MLV （200 U/L） 0.25 L，421h，冰上冷卻后作為PCR模板。4.6 PCRPCR

33、反應(yīng)總體積為25 L，包括：2條PRRSV引物（10 pmol/L） 各1 LMg+(25 mmol/L) 1.5 LdNTP (2.5 mmol/L) 2.0 L10Buffer 2.5 LTaq 酶（5 U/L） 0.2 L模板cDNA 5 L滅菌雙蒸水 11.8 L瞬時離心混勻，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95預(yù)變性 5 min；94 45 min；51 45 min； 共35個循環(huán)，72 1 min；72延伸 10 min。將PCR產(chǎn)物(chnw)放4 保存(bocn)或立即做瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物。4.7 結(jié)果(ji gu)分析與判定4.7.1 1.5瓊脂

34、糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。4.7.2 加樣取68 L PCR擴增產(chǎn)物和23 L加樣緩沖液和和適量CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產(chǎn)物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。4.7.3 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。4.7.4 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如

35、某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大?。?00 bp或430 kb）一致，則該樣品判定為陽性。5 診斷判定PCR檢測結(jié)果陽性，表明該豬（群）已感染PRRSV，根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判定豬群是否發(fā)病。九、古典豬瘟（CSFV）PCR檢測技術(shù)1 引用標準自定標準。2 范圍適用于古典豬瘟（CSFV）的PCR診斷。3材料3.1 儀器(yq)：組織勻漿(yn jin)機；低溫臺式高速（1300020000 r/min）離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳(din yn)儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；

36、可調(diào)移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL（與擴增儀配套）塑料管。3.2 試劑3.2.1 Trizol試劑3.2.2 氯仿3.2.3 異丙醇3.2.4 反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200 U/L）3.3.5 75%乙醇3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液3.2.7 2.5 mmol/L dNTP3.2.8 10PCR Buffer3.2.9 25 mmol/L MgCl23.2.10 10 mol/L引物3.2.11 50TAE（保存液）和1TAE（使用液）3.2.12 Loadin

37、g Buffer3.2.13 瓊脂糖3.2.14 BSA(0.4 mg/mL)7.2.15 CYBgreen4 操作方法4.1 病料采集：可用于檢測的病料包括扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟和母豬流產(chǎn)胎兒及死胎(扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟)，-20 保存?zhèn)溆谩?.2 病料處理：取部分材料0.52.0 g于無菌研缽，磨碎并用PBS（0.01M, PH 7.27.4）稀釋成1: 5乳劑（或?qū)⒉×嫌眉舻都舫尚K，放入5 mL青霉素小瓶，進一步剪碎，按5倍體積的PBS后，用勻漿機勻漿），-20 保存?zhèn)溆没蛄⒓从糜赗NA提取。4.3 RNA提取(tq)取處理好的稀釋(xsh)樣品200300 L，加入(jir)700 L

38、 TRIZOL試劑，渦懸混勻，在1530 溫育23 min；加入200 L的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，1530溫育23 min，28 12000 g離心15 min；轉(zhuǎn)移水相500 L到一新的離心管中，加入0.5 mL的異丙醇，1530作用10 min，28 12000 g離心10 min；棄去上清液，加入75%乙醇1.0 mL，振搖，28 7500 g離心5 min；棄去上清，干燥沉淀物（室溫約5 min）；加入20 L DEPC水溶解，-20 保存或立即使用（置冰上）。4.4 引物設(shè)計根據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2004年在Genbank中公開發(fā)表的序列DQ127910設(shè)計的引物，產(chǎn)物大小

39、為374bp，引物序列如下：gE1: 5-CCACCCGACGCTACGATTGT-3gE2: 5-CTGGCATCCATCATTCCCTG-34.5 RT以提取到的組織總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20L。反轉(zhuǎn)錄體系如下：RNA 7 L10 mol/L引物(gE1/gE2) 1 L于70水浴中5分鐘，然后室溫冷卻10分鐘；再加入： dNTP (10 mM) 1 L5M-MLV buffer 4 LBSA(0.4 mg/mL) 5 LM-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 L 混均后，37水浴45-60分鐘。-20保存。4.6 PCR擴增反應(yīng)cDNA 5.0 L10PCR buffer 2.5 L

40、dNTP (2.5 mM) 2.0 LMgCl2（25 mM） 1.5 L上游(shngyu)引物（10 mol/L） 1.0 L下游(xiyu)引物（10 mol/L） 1.0 LTaq DNA聚合酶（5 U） 0.2 L滅菌(mi jn)雙蒸水 1.8 L配好反應(yīng)液后，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，循環(huán)參數(shù)如下：95 5 min94 45 min;56 45 min; 共35個循環(huán)72 1 min；72 10 min將PCR產(chǎn)物放4 保存或立即做瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物。4.7 結(jié)果分析與判定4.7.1 1.5瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱

41、融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。4.7.2 加樣取68 L PCR擴增產(chǎn)物和23 L加樣緩沖液和適量CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產(chǎn)物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。4.7.3 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。4.7.4 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔

42、的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大?。?70 bp）一致，則該樣品判定為陽性。5 診斷(zhndun)判定如果是在免疫后20 d采集的樣品，PCR檢測結(jié)果陽性，表明該豬（群）已感染野毒，根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判定(pndng)豬群是否發(fā)病。十、豬細小(xxio)病毒(PPV)PCR診斷技術(shù)1 引用標準自定標準。2 范圍 適用于豬細小病毒（PPV）病的PCR診斷。3材料3.1 儀器：臺式高速離心機；DNA擴增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括120 L 2支，20200L 1支，2001000L 1支；與移液器匹配的滴頭；1

43、.5 mL離心管；0.5 mL或0.2 mL（與擴增儀配套）塑料管。3.2 主要試劑3.2.1 TEN緩沖液3.2.2 10SDS3.2.3 20 mg/mL 蛋白酶K3.2.4 飽和酚3.3.5 酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）3.2.6 氯仿：異戍醇（24：1）3.2.7 純乙醇3.2.8 2.5 mmol/L dNTP3.2.9 10PCR Buffer3.2.10 25 mmol/L MgCl23.2.11 10 mol/L引物3.2.12 50TAE（保存(bocn)液）和1TAE（使用(shyng)液）3.2.13 Loading Buffer3.2.14 瓊脂糖3.2.15 C

44、YBgreen4 操作步驟：4.1 樣品(yngpn)的采集：采集病豬的淋巴結(jié)、脾臟、肝臟置-20 保存。4.2 樣品處理和DNA提取所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1: 5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70 反復(fù)凍融3次，7000 r/min離心5 min。取上清液472.5 l,加入25 l 10SDS和2.5 l的20 mg/mL 蛋白酶K，50 水浴搖床上放置2 h。加入等量的飽和酚500 l，渦旋20 s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次。用氯仿：異戍醇（24:1）再抽提一次。用乙醇沉淀，真空抽干后加入20 l雙蒸水溶解，-20貯存?zhèn)溆谩?.3

45、引物根據(jù)GenBank中公開發(fā)表的序列，設(shè)計擴增豬細小病毒VP2基因部分片段，序列如下：P1: 5-CAGAATCAGCAACCTCAC-3P2: 5-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-34.4 PCR 反應(yīng)體系25l，組成如下： 引物 各1.0l 25mM MgCl2 1.5 l dNTPs 2.0 l10緩沖液 2.5 l Taq聚合酶 0.2 l DNA模板 3.0 l 滅菌(mi jn)去離子水 13.8 l 擴増條件(tiojin)為：94 變性3 min，進入(jnr)循環(huán)，94 45 s，54 45 s，72 60 s，30個循環(huán)后，72 延伸10 min。4.5 結(jié)果分

46、析與判定4.5.1 1.5瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。4.5.2 加樣取68 L PCR擴增產(chǎn)物和23 L加樣緩沖液和和適量CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴增產(chǎn)物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。4.5.3 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。4.5.4 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫

47、外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大?。?40 bp）一致，則該樣品判定為陽性。十一、口蹄疫(FMDV)PCR診斷技術(shù)1 引用標準參考GB/T18935-2003和OIE FMDV參考實驗室的方法（NB: VERSION ADOPTED MAY 2006）。范圍 適用于FMDV O型和Asia I型的PCR診斷。3 樣品采集3.1 水泡液和水泡皮：用一次性注射器抽取水泡液，用灼燒的止血鉗封死注射器前端，放入保鮮盒，加冰貯存(zhcn)送檢；將水泡皮剪下，放入干凈青霉素瓶中，放入保鮮

48、盒加凍貯存送檢。3.2 組織臟器(zn q)：如血液、淋巴結(jié)、肌肉等。取樣后放入干凈青霉素瓶或干凈食袋中，于保鮮盒內(nèi)加冰貯存送檢。3.3 鼻咽拭子：用滅菌(mi jn)的棉簽采集后，放保鮮袋中加冰貯存送檢。4 樣品處理 4.1 水泡皮、臟器等：取1-2 g用無菌PBS緩沖液（0.04 M, pH7.2-7.4）沖洗干凈，剪碎、研磨，用PBS稀釋成1:21:5的懸液置4 冰箱過夜。8000 rpm離心5 min，取上清液為檢測材料。4.2 鼻咽拭子：加入2 mL PBS緩沖液，充分擠壓，取出棉簽8000 rpm離心5 min，取上清液。4.3 血液、水泡液：血液可直接作檢測材料；水泡液于8000

49、 rpm離心5 min后取上清，若量太少可適當加入PBS緩沖液。5 PCR診斷5.1 引物根據(jù)Genbank中AsiaI Jiangsu株自行設(shè)計引物，片段大小約330 bp，序列如下：Asia1: 5-ACTCACCCAGCCCAAGAGCAC-3Asia2: 5-GCGTGCAAGGGCGGCGAGATC-3根據(jù)武漢大學(xué)在Genbank中公開發(fā)表的序列自行設(shè)計，擴增片段大小約350 bp，序列如下：O1: 5-GTCAAGCCACAGGAACAGG-3O1: 5-AGAGTTCTTTCTGCCTTCTGAGC-35.2 RNA提取取處理好的稀釋樣品200300 L，加入700 L TRIZ

50、OL試劑，渦懸15 s混勻，室溫靜止3 min；加入200 L的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，室溫靜止3 min，28 20000 g離心15 min；轉(zhuǎn)移(zhuny)水相500L到一新(y xn)的離心管中，加入0.5 mL的異丙醇，混勻，室溫(sh wn)靜止10 min，28 20000 g離心10 min；棄去上清液，加入70%乙醇1.0 mL，振搖，28 20000 g離心10 min；棄去上清，干燥沉淀物（室溫約5 min）；加入20 L DEPC水溶解，-20 保存或立即使用（置冰上）。5.3 RTRNA 7 L10 mol/L引物(gE1/gE2) 1 L于70水浴中

51、5 min，然后室溫冷卻10分鐘；再加入： dNTP (10 mM) 1 L5M-MLV buffer 4 LBSA(0.4 mg/mL) 5 LM-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 L 混均后，37水浴45-60分鐘。-20保存。5.4 PCR擴增反應(yīng)cDNA 5.0 L10PCR buffer 2.5 L dNTP (2.5 mM) 2.0 L MgCl2（25 mM） 1.5 L上游引物（10 mol/L） 1.0 L下游引物（10 mol/L） 1.0 LTaq DNA聚合酶（5 U） 0.2 L滅菌雙蒸水 11.8 L配好反應(yīng)液后，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，循環(huán)參數(shù)如下：94 5 min94

52、 45 min;AsiaI型53 ，O型 58 45min; 共35個循環(huán)72 1 min；72 10 min。將PCR產(chǎn)物(chnw)放4 保存或立即(lj)做瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物。5.5 結(jié)果分析(fnx)與判定5.5.1 1.5瓊脂糖凝膠板的制備稱取1.5 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。5.5.2 加樣取68 L PCR擴增產(chǎn)物和23 L加樣緩沖液和適量CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電

53、泳至少加1孔陽性對照的擴增產(chǎn)物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。5.5.3 電泳電壓80100 V，或電流4050 mA，電泳3040 min。5.5.4 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大?。?30或350 bp）一致，則該樣品判定為陽性。十二、豬孢子球蟲診斷技術(shù)1 引用標準參考GB/T 18647-2002。2 范圍適用于豬球蟲病的實驗室診斷。3 病原檢查3.1 材料準備3.1.1 飽和鹽水。3.1.2 60目尼龍(nlng)膜或鋼絲網(wǎng)、100 mL量杯、10 mL燒杯、5 mL玻璃瓶、吸管、鑷子、天平、離心機、顯微鏡、