國家自然基金面上項目：胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝衰竭

1、二、立論依據(jù) （包括項目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處）對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述項目的科學(xué)意義；對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用情景。重癥肝炎（又稱暴發(fā)性肝功能衰竭）發(fā)生多與肝炎病毒感染、化學(xué)藥物中毒等因素有關(guān)，我國又是病毒性肝炎發(fā)生大國，每年都有相當(dāng)一部分病人患重癥肝炎，每年僅重醫(yī)大附二院傳染科收治的重癥肝炎病人就近幾十例。重癥肝炎以起病急、病情進(jìn)展快、病死率高為特點，目前對它的發(fā)生機制仍未搞清，因此它嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。國內(nèi)現(xiàn)主要以綜合療法治療重癥肝炎，此療法雖對改善疾病的某些癥狀有一定幫助

2、，但并未從根本上改變該病的預(yù)后。國外多以肝移植來治療本病，其近期療效明確而肯定，但遠(yuǎn)期療效因受免疫排斥反應(yīng)的制約而不容樂觀。近兩年國內(nèi)幾家大醫(yī)院也相繼開展了肝移植手術(shù)，但受手術(shù)復(fù)雜性、器官來源以及接受肝移植者需長期服用免疫抑制劑來避免排斥反應(yīng)發(fā)生所造成的高昂藥費和長期使用免疫抑制劑可能造成腎損害等因素的制約，仍限制了此療法的開展。人和哺乳動物的肝臟具有強大的再生功能，2/3肝切除后的動物在10-15天左右殘存肝臟可恢復(fù)到術(shù)前體積，而重癥肝炎患者多表現(xiàn)為缺乏這種再生能力。究其原因除了殘存肝細(xì)胞不能為機體代謝提供足夠的肝功能支持外，激活的免疫細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎癥因子仍不斷造成殘存肝細(xì)胞壞死，甚至殺傷

3、新生肝細(xì)胞，從而嚴(yán)重阻礙了肝臟的再生。近年來越來越多的研究證實肝內(nèi)和浸潤的單核巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎癥因子在造成肝細(xì)胞大量壞死、殺傷新生肝細(xì)胞方面起了極其重要的作用（1，2）。如果抑制或刪除肝內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞，或中和炎癥因子就能大大改善肝臟的再生能力（3，4，5）。在這些研究中人們多使用相應(yīng)的單克隆抗體來刪除或中和單核巨噬細(xì)胞和它們產(chǎn)生的炎癥因子。但單克隆抗體多來自小鼠雜交瘤細(xì)胞，用于人體治療受到限制。急性肝功能衰竭時如能提供一定數(shù)量的外源性肝細(xì)胞和某種能抑制肝內(nèi)單核巨噬細(xì)胞功能的物質(zhì)，起到既阻止殘存肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死和殺傷新生肝細(xì)胞，又能避免外源性肝細(xì)胞遭到排斥，同時還能支撐機體代謝需要，減輕殘

4、存肝細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，使它們有足夠時間再生，達(dá)到治愈肝功能衰竭的目的。眾多的動物實驗已證明肝細(xì)胞移植加免疫抑制劑可滿足這一目的（6，7，8），但免疫抑制劑都是非特異地抑制機體的整個免疫系統(tǒng)，在降低免疫反應(yīng)的同時也降低了機體的抵抗力，常常引起嚴(yán)重的繼發(fā)感染，而且免疫抑制劑多有嚴(yán)重的毒副作用，如臨床常用的環(huán)孢霉素A就有嚴(yán)重的腎毒性，這些在重癥肝炎常是導(dǎo)致病人死亡的危險因素。1994年Hagiya從乳鼠肝臟中分離出一種能促進(jìn)肝臟再生的物質(zhì)，并克隆了它的cDNA，為它取名為肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration，ALR）（9）。我們已從人胎肝組織中克隆出人ALR cD

5、NA，成功構(gòu)建了它的真、原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了高效表達(dá)（10，11）。新近的研究發(fā)現(xiàn)ALR能通過抑制肝內(nèi)NK細(xì)胞的活性來促進(jìn)肝細(xì)胞再生（12，13）。在胎胰島細(xì)胞移植加ALR治療糖尿病大鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，凡在移植細(xì)胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢復(fù)到正常水平，而單獨接受胎胰細(xì)胞移植治療的大鼠無一只血糖恢復(fù)正常，說明ALR使移植的胎胰細(xì)胞避免了排斥反應(yīng)，能存活并發(fā)揮功能（14）。基于這些最新研究成果，我們擬探討胎肝細(xì)胞移植與ALR聯(lián)合運用治療急性肝功能衰竭的可行性及其相關(guān)機制，期望為臨床治療重癥肝炎找到確實有效，又經(jīng)濟可行的治療方法；同時探索胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，評價凍存細(xì)胞作為供者細(xì)

6、胞的可行性，為今后臨床應(yīng)用時出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法；并通過本研究觀察在急性肝損傷時血和肝組織中ALR和TNF-、IL-1等炎癥因子的變化關(guān)系，進(jìn)一步闡明ALR的作用機理。本課題如獲成功必將為重癥肝炎患者帶來福音，產(chǎn)生巨大的社會效益及經(jīng)濟效益。顧長海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科學(xué)技術(shù)出版社，1997；11-21 2Nikola LV, Lorenzo P, Alessandro A, et al. Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunology 1995; 154:6

7、324-63383Blazka ME, Elwell MR, Holladay SD, et al. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: ole of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996; 24:181-189 4Tamura F, Masuhara A, Sakaida I, et al. FK506 promates liver regeneration by suppressing natural kill

8、er cell activity. J Gastroenterol Hepatol 1998; 13:703-708Boulton RA, Alison MR, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70% partial hepatectomy in rats following selective kuffer cell depletion. J Hepatol 1998; 29:271-280Takeshita K, Ishibashi H, Suzuki M, et a

9、l. Hepatocellular transplantation for metabolic support in experimental acute ischemic liver failure in rats. Cell Transplant 1993; 2:319-324Demetriou AA, Reisner A, Sanchez J, et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatectomized rats. Hepatology 1988; 8:1006

10、-1009Mito M, Susano M, Sawa M, et al. Hepatocyte transplantation for hepatic failure. Transplant Rev 1993; 7:35-43Michio Hagiya, Antonio Francavilla, Lorenzo Polimeno, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombi

11、nant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:8142-8146中華肝臟病雜志。1999; 7(3)中華肝臟病雜志 2000；8（1）Francavilla A, Vujanovic NL, Polimeno L, et al. The in vivo effect of hepatotrophic factors augmenter of liver regeneration, hepatocyte growth factor, and insulin-like g

12、rowth factor-II on liver natural killer cell functions. Hepatology 1997; 25:411-415Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 2000; 35:112-119Ada

13、ms GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rats of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation 1998; 65:32-36 3 三、研究方案研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)：通過本研究探討胎肝細(xì)胞移植與ALR聯(lián)合運用治療急性肝功能衰竭的可行性及其相關(guān)機制，期望為臨床治療重癥肝炎找到確實有效，又經(jīng)濟可行的治療方法。同時探索胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，評價凍存細(xì)胞作為

14、供者細(xì)胞的可行性，為今后臨床應(yīng)用時出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法。同時通過觀察在急性肝損傷時血和肝組織中ALR和TNF-、IL-1等炎癥因子的變化關(guān)系來進(jìn)一步闡明ALR的作用機理。研究內(nèi)容：a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型；b：型膠原酶灌注消化胎鼠肝臟制備胎肝細(xì)胞；c：電轉(zhuǎn)化帶有HBV-S基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-S入胎肝細(xì)胞；d：ELISA法或免疫組化法檢測含pCDNA3.1-S的胎肝細(xì)胞體外培養(yǎng)時表達(dá)HBsAg的情況；e：比較經(jīng)不同凍存條件、不同凍存時間處理后，胎肝細(xì)胞復(fù)蘇存活率；f：用ELISA法和免疫組化法檢測造模組和正常鼠血及肝組織中的ALR，了解ALR的變化

15、情況；g：用組氨酸親和層析柱純化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)的大鼠ALR；h：比較不同治療組與對照組間、不同治療組間動物存活率的差別；i：比較不同治療組與對照組間、不同治療組間肝臟生化指標(biāo)、常規(guī)病理變化；j：免疫組化法檢測不同治療組存活動物肝組織內(nèi)HbsAg的表達(dá)及分布，以判斷移植細(xì)胞的存活情況；k：用ELISA法和Northern blot檢測不同處理組動物血中和肝組織內(nèi)TNF-、IL-1水平及它們的mRNA表達(dá)情況，探討ALR的作用機理；l：比較不同治療組與對照組間、不同治療組間腎臟生化指標(biāo)、常規(guī)病理變化。 擬解決的關(guān)鍵問題：重癥肝炎的高死亡率一直困擾著臨床醫(yī)生，除肝移植外至今仍無有效治

16、療方法。我們擬通過本研究探明胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝衰竭的可行性，希望能為重癥肝炎的治療找到突破性方法。探索胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，評價凍存細(xì)胞作為供者細(xì)胞的可行性，為今后臨床應(yīng)用時出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法。同時可進(jìn)一步闡明ALR的作用機理、在急性肝損傷時的變化規(guī)律以及明確它在肝臟的細(xì)胞來源。4擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析（1）研究方法、技術(shù)路線、實驗方案： D-氨基半乳糖制備 膠原酶消化胎鼠肝 凍存、復(fù)蘇 大鼠急性肝衰竭模型 制備胎肝細(xì)胞 純化的大鼠ALR 電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pCDNA3.1-S 至胎肝細(xì)胞 對照組 FLCCsA FLCALR FLC ALR 比

17、較各項檢測指標(biāo) 如果FLCALR組有效， 再與凍存細(xì)胞進(jìn)行治療比較 注：圖中FLC為胎肝細(xì)胞；CsA為環(huán)孢霉素A；ALR為肝再生增強因子。 （2）可行性分析：本課題的難點是消化分離胎肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞的凍存復(fù)蘇、獲取大量純品ALR和鑒定移植的胎肝細(xì)胞存活狀況。對于前兩項相信通過反復(fù)摸索實驗條件一定能獲得滿意結(jié)果。由于本課題是我們前一自然科學(xué)基金項目的延續(xù)。我們已構(gòu)建了人和大鼠ALR的真、原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功地將其在真核和原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高效表達(dá)菌株，只要將表達(dá)產(chǎn)物用帶鎳離子的層析柱分離就可得到大量純品ALR。我們研究所已構(gòu)建了一系列含HBV-S基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，只要將這

18、些表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胎肝細(xì)胞再用于移植，就能區(qū)判定移植細(xì)胞的存活情況。此外我們還完成了人和大鼠ALR的多克隆和單克隆抗體的制備，為檢測血和肝組織中的ALR提供了檢測手段，要完成本課題研究應(yīng)不成問題。本項目的創(chuàng)新之處首次探討胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝功能衰竭的可行性；首次觀察急性肝損傷時血和肝組織內(nèi)ALR的表達(dá)變化情況及它對TNF-、IL-1等炎癥產(chǎn)生的影響；首次探討胎肝細(xì)胞低溫保存和復(fù)蘇條件，以及作為移植供者細(xì)胞的可行性。54. 年度研究計劃及預(yù)測進(jìn)展2002年112月：完成動物肝損傷模型建立的預(yù)實驗、ALR表達(dá)的肝內(nèi)定位； 完成胎肝細(xì)胞的制備、胎肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、HbsAg表達(dá)的鑒定； 完成大鼠A

19、LR的表達(dá)及純化； 完成不同保存條件、不同保存時間胎肝細(xì)胞復(fù)蘇存活率比較；2003年112月：完成胎肝細(xì)胞移植與ALR聯(lián)合治療大鼠急性肝衰的療效評價； 完成新分離與凍存胎肝細(xì)胞與ALR聯(lián)合治療大鼠急性肝衰的療效評價； 完成不同處理組動物血及肝組織內(nèi)TNF-、IL-1變化的比較； 2004年1 6月：完成所有的研究工作。 612月：總結(jié)資料，發(fā)表文章及申報成果。預(yù)期研究成果 通過本研究探明胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝衰竭的可行性，如能成功將為臨床治療重癥肝炎找到了突破性方法，這必將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。同時探索出胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，為今后臨床應(yīng)用時出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法

20、。通過本研究還進(jìn)一步闡明ALR的作用機理、在急性肝損傷時的變化規(guī)律，為重組人ALR今后的臨床應(yīng)用前景作出科學(xué)評估并提供實驗依據(jù)。研究成果將以論文形式發(fā)表在中華系列或國際刊物上（預(yù)計完成論文4-7篇），并申報相應(yīng)的科技成果獎。6 四、研究基礎(chǔ)1. 與本項目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績本課題為我們前一“自然科學(xué)基金項目“的延續(xù)。在前一課題中我們已完成人ALR讀碼框的cDNA克隆及測序，與國外報道的大量鼠ALR讀碼框的核苷酸及氨基酸序列比較，其同源性分別為86.5%和85.6%，構(gòu)建了人ALR的真、原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功地將其在真核和原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高效表達(dá)菌株和重組的

21、人ALR。此后又完成了大鼠ALR讀碼框的cDNA克隆和真、原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)。去年我們又進(jìn)一步完成了由重慶市衛(wèi)生局資助的針對人和大鼠ALR的多克隆和單克隆抗體的制備。此外，我們研究所已構(gòu)建了一系列含HBV-S基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。這些成果的取得為本課題的研究提供了可靠的物質(zhì)保障。課題申請者長期從事病毒性肝炎的發(fā)病機理及治療的研究。作為課題的主研人員之一曾參加過研究所承擔(dān)的國家“六.五”、“七.五”、“八.五”有關(guān)病毒性肝炎防治的攻關(guān)課題研究，多次榮獲國家科委、衛(wèi)生部、四川省和重慶市的科技進(jìn)步獎。9093年底作為訪問學(xué)者赴英國伯明翰大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝病中心從事免疫抑制藥物FK506作用

22、機理的課題研究，回國后又承擔(dān)了國家教委優(yōu)秀青年教師基金和國家自然科學(xué)基金資助的“肝細(xì)胞生長多肽基因克隆及其對免疫系統(tǒng)影響”的課題研究。申請者具有扎實的分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論知識，極強的科研能力和實驗技能，課題組主要成員均有長期從事實驗研究的工作經(jīng)歷，這為本課題能順利進(jìn)行提供了可行的人員和技術(shù)力量的保證。2. 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況） 我所為國家教委重點學(xué)科，我所為衛(wèi)生部臨床藥理實驗基地和重慶市分子生物學(xué)重點實驗室，擁有良好的工作條件和許多精密儀器。其主要設(shè)備有：超速離心機、液相閃爍計數(shù)儀、高速冷凍離心機、臺式高速

23、冷凍離心機2臺、全波長分光光度儀、-射線能譜儀、CO2培養(yǎng)箱3臺、PCR儀2臺、超凈工作臺、多功能電泳儀、核酸測序儀、低溫冰凍離心機、超低溫冰箱、電轉(zhuǎn)化儀、凝膠成像系統(tǒng)、高壓和常壓層析系統(tǒng)、超聲破碎儀、蛋白質(zhì)電泳裝置、熒光顯微鏡、細(xì)胞收集器、倒置顯微鏡、多功能掃描儀等。73. 申請者和項目組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關(guān)的主要論著目錄*和獲得學(xué)術(shù)獎勵情況及在本項目中承擔(dān)的任務(wù)；青年科學(xué)基金申請者還應(yīng)注明學(xué)位論文名稱及導(dǎo)師姓名與工作單位8篇* 論文：作者題目刊名年份卷（期）頁碼 專著：作者書名出版者年份8 五、經(jīng)費預(yù)算支 出 科 目金 額（萬元）計 算 根 據(jù) 及 理 由1

24、. 合 計200（一）科研業(yè)務(wù)費25實驗動物0.8大白鼠、胎鼠各200只(15元/只)及飼料等文獻(xiàn)檢索,資料復(fù)印0.3論文發(fā)表,會議,成果鑒定0.8臨工費0.6300元/月20月 (二)實驗材料費158生化試劑40D-氨基半乳糖、IV膠原酶、組氨酸親和柱等免疫學(xué)試劑25IL-1、TNF-檢測Kit，ELISA和免疫組化檢測試劑分子生物學(xué)試劑45DIG-標(biāo)記、總RNA提取Kit，引物合成, Taq酶, dNTP,細(xì)胞培養(yǎng)25DEME、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、液氮、CO2等其他常用試劑15細(xì)菌培養(yǎng)基、Hank氏液、常用試劑等低值易耗物品08細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)檢測板、細(xì)菌培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等（

25、三）協(xié)作費07病理切片制作、病理診斷等（四）項目組織實施費10占總經(jīng)費的5% 注: 預(yù)算支出科目按下列順序填寫: 1. 科研業(yè)務(wù)費 2. 實驗材料費 3. 儀器設(shè)備費 4. 實驗室改裝費 5. 協(xié)作費 6. 項目組織實施費。開支范圍詳見國家自然科學(xué)基金資助項目財務(wù)管理辦法第二章。9 六、申請者正在承擔(dān)的其它研究項目 （攀登計劃、863計劃、攻關(guān)任務(wù)和各部委、省市任務(wù)等項目的名稱及編號、任務(wù)來源、起止年月、負(fù)責(zé)或參加以及與本申請項目的關(guān)系等情況） 作為課題負(fù)責(zé)人正在執(zhí)行教育部骨干教師基金教技司（2000）65文資助的研究。起止日期：2000.12002.12。此研究屬ALR系列研究之一。七、申請

26、者承擔(dān)（負(fù)責(zé)或參加）國家自然科學(xué)基金資助項目的情況批準(zhǔn)號項目名稱起止年月負(fù)責(zé)或參加進(jìn)展或完成情況1996年1月1998年12月負(fù)責(zé)已完成10 對申請者負(fù)責(zé)的前一個已結(jié)題科學(xué)基金資助項目（項目名稱及批準(zhǔn)號）完成情況，后繼研究進(jìn)展及與本申請項目的關(guān)系加以詳細(xì)說明。另附該已結(jié)題項目研究工作總結(jié)摘要（300字）及已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁復(fù)印件（限三篇）。申請者負(fù)責(zé)的由自然科學(xué)基金資助的已于98年12月結(jié)題?，F(xiàn)已構(gòu)建大鼠ALR的原核表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究ALR的生物學(xué)功能和作用機理打下基礎(chǔ)。ALR是近年才發(fā)現(xiàn)并克隆的一種新的促肝細(xì)胞生長因子，人ALR是最近兩年由國內(nèi)學(xué)者率先克隆成功的，所以對它的生物學(xué)功能

27、才剛剛起步。從在體內(nèi)的廣泛分布來看，它的生物學(xué)功能應(yīng)遠(yuǎn)不止限于促肝細(xì)胞生長，其作用部位也不應(yīng)限于肝臟。目前即使是它在肝臟損傷后再生時的作用機理的研究也少有報道。我們希望通過本課題研究進(jìn)一步闡明它的作用機理以及與臨床肝損傷后肝再生的關(guān)系，為它今后的臨床應(yīng)用提供切實可靠的實驗依據(jù)。結(jié)題項目研究工作總結(jié)摘要：以人胎肝總RNA為模板，用RT-PCR和基因重組技術(shù)克隆了人ALR閱讀框cDNA，它全長378個核苷酸，編碼125個氨基酸。與大鼠ALR和人ALR閱讀框的核苷酸序列同源性分別為86.5和99.2。將克隆片段分別裝入pET-11a和pcDNA3質(zhì)粒中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-11a-hALR和真

28、核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-hALR，并在大腸桿菌BL21（DE3）和COS-7細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。在BL21（DE3）中的表達(dá)量占菌體蛋白量的20%，分子量約為15KD，用轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞勻漿測活，僅細(xì)胞勻漿有刺激活性。在體外它能刺激HepG2、QGY等肝源性細(xì)胞增殖，不能使L929細(xì)胞增殖。首次觀察了重組人ALR在體外對人外周血淋巴細(xì)胞在PHA刺激下產(chǎn)生IL-2和T13細(xì)胞（NK細(xì)胞系瘤株）在LPS刺激下產(chǎn)生IL-1、TNF-的影響，發(fā)現(xiàn)它對以上兩種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子均無影響。 八、申請者承諾 我保證上述填報內(nèi)容的真實性。如果獲得資助，我與本項目組成員將嚴(yán)格遵守國家自然科學(xué)基金

29、委員會的有關(guān)規(guī)定，切實保證研究工作時間，按計劃認(rèn)真開展研究工作，按時報送有關(guān)材料。 申請者（簽章） 年 月 日11 九、推薦意見 （不具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請者，須有兩名具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家推薦。推薦時，請認(rèn)真負(fù)責(zé)地介紹申請者及其項目組成員的業(yè)務(wù)基礎(chǔ)、研究能力、科研態(tài)度及研究條件等。項目組成員不能做推薦者） 推薦者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位： 推薦者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位：12十、申請者所在單位及合作單位的審查與保證申請者所在單位學(xué)術(shù)委員會的審查意見（包括：對項目的意義、特色和創(chuàng)新之處及申請者的研究水平與學(xué)風(fēng)簽署具體意見）重癥肝炎的高死亡率一直困擾著臨床醫(yī)生，除肝移植外至今仍無有