2020版《中國藥典》液相色譜法檢驗操作規(guī)程(USP)

1、一、目的:液相色譜法檢驗操作規(guī)程編寫/修訂人/日期年 月日部門/姓名審核人/日期年 月日部門/姓名批準(zhǔn)人/日期年 月 日部門/姓名執(zhí)行日期2020年11月01日頒發(fā)部門品質(zhì)部分發(fā)部門品質(zhì)部制訂詳盡的工作程序，規(guī)范檢驗操作，保證檢驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。二、范圍：本操作規(guī)程適用于參考美國藥典標(biāo)準(zhǔn)檢驗品種液相色譜法的測定。三、職責(zé)：1、檢驗員：嚴(yán)格按操作規(guī)程操作，認(rèn)真、及時、準(zhǔn)確地填寫檢驗記錄：2、化驗室負(fù)責(zé)人：監(jiān)督檢查檢驗員執(zhí)行本操作規(guī)程。四、內(nèi)容：1、簡述：液相色譜一詞，如本綱要中所用，是高壓液相色譜和高效液相色譜的同義詞。 LC是一種基于固體固定相和液體流動相的分離技術(shù)。2、固定相：根據(jù)所用的固定相

2、的類型，通過分配、吸附或離子交換過程實現(xiàn)分離。最常 用的固定相是改性二氧化硅或聚合物珠。通過添加長鏈燒類來修飾珠粒。完成分析所需的 具體包裝類型由各個專著中的“L”指定表示（另見下面的色譜柱部分）。珠子的大小通常 也在專著中描述。包裝類型和尺寸的變化包括在本章的系統(tǒng)適用部分中。3、色譜柱：3.1術(shù)語柱包括不銹鋼、內(nèi)襯不銹鋼和聚合物柱，用固定相填充。柱子的長度和內(nèi)徑影響 分離，因此典型的柱子尺寸包括在單獨的專著中。在本章的系統(tǒng)適配部分中討論了列尺寸 的變化。簡編專著不包括適當(dāng)專欄的名稱：這種省略避免了出現(xiàn)對供應(yīng)商產(chǎn)品的認(rèn)可和市 場中的自然變化。請參閱色譜柱以獲取更多信息。3. 2在LC程序中，除

3、另有規(guī)定外，保護(hù)柱可按下列要求使用：（a）保護(hù)柱的長度必須是分 析柱長度的NMT15M （b）內(nèi)徑必須等于或小于分析柱的內(nèi)徑，（c）填料應(yīng)與分析柱（例如， 二氧化硅）相同，并含有相同的結(jié)合相（例如，C18）o在任何情況下，在正式程序中規(guī)定的 所有系統(tǒng)適用性要求必須安裝在保護(hù)柱上。USP-NF測試和測定中使用的填料（L）、#1 （G） 和載體（S）的完整列表位于USP-NF和PF、試劑、指示劑和溶液-色譜柱中。該列表旨在 為色譜學(xué)家在識別個別專著中指定的相關(guān)色譜柱時提供方便的參考。4、流動相：流動相是溶劑或溶劑混合物，如在專著中所定義的。5、裝置：液相色譜儀由包含流動相的儲液器、在高壓下迫使流動

4、相通過系統(tǒng)的泵、將樣 品引入流動相的注射器、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)收集裝置組成。6、梯度洗脫：在色譜過程中連續(xù)改變?nèi)軇┙M成的技術(shù)稱為梯度洗脫或溶劑編程。梯度洗 脫曲線在單獨的專著中作為梯度表提出，其中列出了流動相在規(guī)定時間的時間和比例組 成。7、程序：1用流動載氣平衡柱、注射器和檢測器，直到接收到恒定信號。2通過注射器隔片注射樣本，或使用自動采樣儀。3開始溫度程序。4記錄色譜圖。按規(guī)定作分析。8、色譜圖的定義和解釋：8.1色譜圖：色譜圖是檢測器響應(yīng)、流出物中分析物濃度或作為流出物濃度相對于流出物 體積或時間的度量的其他量的圖形表示。在平面色譜中，色譜可指具有分離區(qū)的紙或?qū)印?8. 2如Figur

5、e 1表示兩種物質(zhì)1和2的典型色譜分離。對于峰1, tRl和tR2是各自的 保留時間：h是高度，h/2是半高度，Wh/2是半高度處的寬度。W1和W2是基線處的峰1 和2的各自寬度?？諝夥迨菤庀嗌V的特征，對應(yīng)于LC中的溶劑前沿。這些空氣峰的保 留時間，或未保留的成分，被指定為TM.Figure 1：兩種物質(zhì)的色譜分離8. 3閉合容積（D）：也被稱為閉合的體積，是洗脫液相遇點和柱頂之間的體積。8. 4保持時間（TM）：保持時間是洗脫未保留組分所需的時間。（參見Figure 1,在基線中 顯示的空氣或未滯留的溶劑峰，）。滯留體積（VM）：滯留體積是洗脫未保留組分所需的流動相的體積。它可以從保持時間

6、和 流速f計算，用mL/mimVM=tMXF3%Qdslda sss在排阻色譜法中，使用符號V0“理論板數(shù)（N） :N是柱效率的量度。高斯提出它是由：N=16（tR/W）2其中，tR是物質(zhì)的保留時間，W是其底部的峰寬，這是通過將峰的相對直邊外推到基線而 獲得的。N值取決于被色譜的物質(zhì)以及操作條件，例如流動相或載氣的流速和溫度、填料 的質(zhì)量、填料在柱內(nèi)的均勻性，以及毛細(xì)管柱的厚度、固定相膜的厚度和柱的內(nèi)徑和長度。 在使用電子積分器的情況下，通過方程可以方便地確定理論板的數(shù)目：其中肌，二是半高度的峰值寬度。然而，在爭議的情況下，只有基于峰值寬度在基線的方程 將被使用。峰：峰是從柱中洗脫單個組分時檢

7、測器響應(yīng)的色譜記錄部分。如果分離不完全，則可以將 兩個或更多個組分洗脫為一個未分解的峰。8.5峰-谷比建川）：當(dāng)兩個峰之間沒有達(dá)到基線分離時，p/v可被用作相關(guān)物質(zhì)測試的系 統(tǒng)適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)。如Figure 2 ,表示兩種物質(zhì)的部分分離，其中L是在小峰的外推基線 之上的高度，H、是在分離次要和主要峰的曲線的最低點處的外推基線之上的高度：p/v = HJHV相對延遲（RreD：相對延遲是分析物行進(jìn)的距離與參考化合物同時行進(jìn)的距離的比率（參 見Figure 3）,并用于平而色譜。Figures：典型的平面色譜法8.6相對保留（尸：在相同條件下獲得的組分相對于另一組分的調(diào)整保留時間的比率，用 作參考：廠

8、加廠t/亡tjf其中也是從感興趣化合物的注射點測得的保留時間；加是從用作參考的化合物的注射點 測得的保留時間；t乂是在該程序中定義的非保留標(biāo)記的保留時間，均在同一柱上的實驗條 件。7相對保留時間（RRT）：也稱為未調(diào)行相對保留。在USP中通常是在未經(jīng)調(diào)整的相對 保留條件下進(jìn)行的，除非另有說明。RRT tic/ 標(biāo)符號珠也用于指定未調(diào)整的相對保留值。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分率:V28.8延遲因子（RF）：延遲因子是斑點中心移動的距離與流動相同時移動的距離的比值,用于平而色譜。使用Figure 3中的符號:Rpb/a9保留因子（K）：保留因子也稱為容量因子（k ）。定義為: K二固定相物質(zhì)量/流動相物質(zhì)含

9、量K二固定相分離時間/流動相分離時間組分的保留因子可以從色譜圖中確定：仁（益一涼/ tx8.10保留時間（Tr）：在液相色譜中，保留時間tR被定義為樣品注射到洗脫樣品區(qū)出現(xiàn) 最大峰值響應(yīng)之間的時間。TR可以用作識別的參數(shù)。色譜保留時間是它們所代表的化合物的特征，但不是唯一的。樣品和參考物質(zhì)的保留時間 的重合可以用作構(gòu)建身份簡檔的部分標(biāo)準(zhǔn)，但是其本身可能不足以建立身份。給定化合物 的絕對保留時間可以從一個色譜圖變化到下一個色譜圖。11保留體枳（VR）：保留體積是用于洗脫組分所需的流動相的體積。它可以從保留時間 和流速在mL/min中計算：12 及分辨率：分辨率是混合物中兩個組分的分離，計算為：抬

10、2X （土-為）/（比.+應(yīng)）其中，正和標(biāo)是兩個組分的保留時間，他和W，是通過將峰的相對直邊外推到基線而獲得 的峰基處的對應(yīng)寬度。在使用電子積分器的情況下，通過方程可以方便地確定分辨率：抬L 18X孑生/13分離因子（。）：分離因子是對兩個相鄰峰計算的相對保留度（按照慣例，分離因子的 值總是1）：a -k：/k214對稱因子（AS）峰的對稱因子，也稱尾部因子（網(wǎng)和y4）是通過以下來計算的:其中，稿心是在5%高度處的峰值的寬度，f是從峰值最大值到峰值前沿的距離，該距離是 在峰值高度的點5用處從基線測量的。Figure4：不對稱色譜峰15拖尾因子（t）:見對稱因子。9、系統(tǒng)適用性9.1系統(tǒng)適合性測

11、試是液體色譜方法的一個組成部分。這些試驗用于驗證色譜系統(tǒng)對于預(yù) 期的分析是足夠的。2測試基于這樣的概念，即設(shè)備、電子、分析操作和分析的樣品構(gòu)成可被這樣評價的積 分系統(tǒng)。3可能影響色譜行為的因素包括：1流動相的組成、離子強度、溫度和表觀pH值3. 2流速、柱尺寸、柱溫和壓力3.3固定相特性，包括色譜載體類型（顆?；蛘w）、顆?；虼罂壮叽?、孔隙率和比 表而積。3. 4反相和其他表而改性的固定相，化學(xué)修飾的程度（如端蓋、碳負(fù)荷等）。3. 5分辨率，Rs,是理論板數(shù)，n （也稱為效率），分離因子，和容量因子，K。注：所 有的術(shù)語和符號都在前面的部分定義和色譜圖的解釋中定義。對于給定的固定相和流動 相

12、，可以指定N,以確保緊密洗脫的化合物彼此分離，建立系統(tǒng)的一般分辨率，并確保從 藥物中分離出內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。這是一個不可靠的方法來確保分辨率比直接測量。柱效率在一定 程度上反映了峰值銳度，這對于痕量組分的檢測是很重要的。4對標(biāo)準(zhǔn)制劑或其他標(biāo)準(zhǔn)溶液的重復(fù)注射進(jìn)行比較，以確定是否滿足精度要求。除非個 別專著中另有規(guī)定，否則如果要求為2.0席或更小，則使用來自分析物的五次重復(fù)注射的 數(shù)據(jù)來計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差領(lǐng)SD；如果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差要求為m,則使用來自六次重復(fù)注射的 數(shù)據(jù)。礦石大于2機(jī)5對于藥物物質(zhì)專著中的測定，其中純物質(zhì)的值為100%,并且沒有說明最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏 差，對于參考溶液的一系列注射計算最大允許用RS

13、D：tsos. n-i其中K是常數(shù)（0.349）,由表達(dá)式的（0.6/42） X （如#）得到,其中K 6八/2表示B=l. 0 注射6次后所需的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分比；B是在個體專著的定義中給出的上限-100樂n 是數(shù)字；參考溶液的重復(fù)注入（3WW6）, m.皿 是學(xué)生在90$概率水平（雙面）上的n-1 自由度。6除非另有規(guī)定，允許的最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過可重復(fù)性要求表中給出的適當(dāng)值。此 要求不適用于相關(guān)物質(zhì)的測試。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差要求Number of Individual Injections3456B(%)Maximum Permitted RSD2.00.410.590.730.852.50

14、.520.740.921.063.00.620.891.101.277對稱因子AS是峰對稱性的度量，對于完全對稱的峰是統(tǒng)一的：并且它的值隨著尾隨 變得更加明顯（參見Figure 4）而增加。在某些情況下，可以觀察到小于1的值。由于 峰值對稱性偏離了 1的值，因此，積分和精度變得不那么可靠。8信噪比（S/N）是一個有用的系統(tǒng)適用性參數(shù)。S/N的計算如下：S/2H/h其中，H是從峰值頂點到基線所測量的峰值的高度，在距離上外推到半高處的峰值寬度的 5倍：h是在距離上觀察到的最大噪聲值和最小噪聲值之間的差，距離是峰值的半高處的 寬度的5倍，并且，如果可能的，同樣位于等高峰的周圍（見Figure 5）。

15、Figures：噪聲和色譜峰，S/N比的組成部分這些系統(tǒng)適應(yīng)性測試是通過從單個專著中指定的標(biāo)準(zhǔn)溶液或其他溶液的重復(fù)注射中收集數(shù)據(jù)來執(zhí)行的。9除卻專著中的參數(shù)規(guī)定外，還可使用其他合適的操作條件。為了滿足系統(tǒng)的適宜性要求，對指定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整可能是必要的。為符合系統(tǒng)適用 性要求而對色譜系統(tǒng)進(jìn)行的調(diào)整不能用于補償色譜柱故障或系統(tǒng)故障。只有在適合性試驗 中使用的所有化合物都有合適的標(biāo)準(zhǔn)（包括參考標(biāo)準(zhǔn)）時，才允許進(jìn)行調(diào)整：調(diào)整或柱改變 產(chǎn)生滿足程序規(guī)定的所有系統(tǒng)適應(yīng)性要求的色譜圖。9. 10如果為了滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求而需要調(diào)整操作條件，則除另有規(guī)定外，否則下列清 單中的每一項都是可以考慮的最大變化：

16、這些變化可能需要額外的驗證數(shù)據(jù)。為了驗證該 方法在新條件下的適用性，評估可能受變化影響的相關(guān)分析性能特征。多次調(diào)整會對系統(tǒng) 性能產(chǎn)生累積影響，在實現(xiàn)之前需要仔細(xì)考慮。在某些情況下，可能希望使用與程序規(guī)定 的那些尺寸不同的HPLC柱（不同的長度、內(nèi)徑和/或粒度）。無論哪種情況，固定相的化 學(xué)特性（“L”指定）的改變將被認(rèn)為是對該方法的修改，并且需要完全驗證。梯度洗脫中 流動相組成的調(diào)整可能導(dǎo)致選擇性的改變，不推薦使用。如果需要進(jìn)行調(diào)整，則允許改變 塔填料（保持相同的化學(xué)性質(zhì)）、初始等容保持時間（當(dāng)規(guī)定時）和/或停留體積調(diào)整。在 下而的文本中注意到梯度調(diào)整的附加余量。9.11流動相的pH值（HPL

17、C）：用于制備流動相的水性緩沖液的pH可調(diào)行到指定值或范圍 的0.2單位內(nèi)。適用于梯度和等度分離。在緩沖液中的鹽濃度（HPLC）：如果滿足pH值的變化（見上文），在制備用于流動相的水 性緩沖液中所用的鹽的濃度可以調(diào)節(jié)到10%以內(nèi)。適用于梯度和等度分離。9. 12流動相組分比例（HPLC）：以下調(diào)整限值適用于流動相的次要組分（指定為50%或更 少）。這些組分的量可以通過30與相對調(diào)節(jié)。然而，任何分量的變化不能超過10%絕對 值（即，相對于總移動相位）?？梢哉{(diào)節(jié)三元混合物中的一個次要組分。下而給出了二元 和三元混合物的調(diào)整實例。9. 13二元混合物規(guī)定比例50 : 50, 50的30由的絕對值為1

18、5機(jī)，但這超出了任一分量絕對10%絕對允許變 化。因此，移動相位比只能在40:60-60:40的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。規(guī)定比例2 ： 98,2的30%的絕對值為0. 6%o因此,最大允許調(diào)整在1. 4 ： 98. 62. 6 ： 97. 4 的范圍內(nèi)。9. 14三元混合物規(guī)定比例60:35:5,對于第二組分，35席的30$是10. 5%的絕對值，這超過了任何組分10與 的絕對值的最大允許變化。因此，第二組分只能在25$45%絕對值范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)行。對 于第三個分量，5的30$是絕對的1.5機(jī)在所有情況下，使用足夠數(shù)量的第一組分來給出 總共 100%個。因此,50:45:5 -70:25:5?；蛘?58

19、.5: 35: 6.5 -61.5: 35: 3.5 的混合 物范圍將滿足要求。9. 15紫外-可見光檢測器（HPLC）的波長：不允許偏離過程中指定的波長。由探測器制造 商指定的過程或另一個驗證的過程，用于驗證檢測器波長中的誤差最多3納米。9. 16固定相9. 17柱長（HPLC）：見下面的顆粒大?。℉PLC）。9. 18柱內(nèi)徑（HPLC）：線性速度保持恒定時可調(diào)節(jié)。見下面（HPLC）流速。9. 19顆粒大小（HPLC）：對于等度分離，只要柱長（L）與粒徑（dp）的比例保持恒定或 在規(guī)定L/dp比在-25%至+50舟之間，可以修改柱的顆粒大小和/或長度?；蛘撸P(guān)于對表面 多孔顆粒應(yīng)用粒度調(diào)整）

20、，如果理論板（N）的數(shù)量相對于規(guī)定柱在-25%至+50$以內(nèi)，則可 以使用L和dp的其它組合。當(dāng)調(diào)整結(jié)果導(dǎo)致更大數(shù)量的理論板產(chǎn)生較小的峰體枳時，應(yīng) 謹(jǐn)慎。這可能需要調(diào)整以最小化由于儀器管道、檢測器單元體枳和采樣率以及注入體積等 因素引起的柱外帶展覽。當(dāng)專著中沒有提到粒徑時，必須使用USP列定義中的最大粒徑來 計算該比率。對于梯度分離，長度、柱內(nèi)徑和顆粒尺寸的變化是不允許的。9. 20流速（HPLC）：當(dāng)顆粒大小改變時，流速可能需要調(diào)整，因為較小的顆粒柱對于相同 的性能（如通過降低板高度測量的）將需要較高的線速度。柱直徑和粒徑變化的流速變化 可由：FmRX dp】其中艮和艮分別是原始條件和修改條

21、件的流速，心和&二是各自的柱直徑，心和&二是顆 粒尺寸。當(dāng)在等度分離中，23-Mm至V3-M顆粒發(fā)生變化時，在線性速度的額外增加（通過調(diào)行 流速）是合理的，條件是塔效率不會下降20席以上。類似地，V3im和3-Mm顆粒改變時 可能需要進(jìn)一步降低線速度（流速），以避免柱效率降低20%以上。梯度分離不允許F、DC 和DP的變化。此外，流量可調(diào)節(jié)50% （僅等度分離）。例子：調(diào)整柱長、內(nèi)徑、粒度和流速可以結(jié)合起來使用，以給出等效條件（相同的N）, 但壓力和運行時間不同。下表列出了一些更流行的列配置，通過調(diào)整這些變量來提供等效 效率（N）。Length (, mm)ColumnDiameter (de

22、, mm)Particle Size (dp, pm)Relative ValuesUdpFNPressureRun Time250461025,000050802331504.6530,0001.01.01.01.015021530,000021010101004.63.528,6001.41.01.90.5100213528,60003101905754.62.530,0002.01.04.00.375212530,00004104003504.61.729,4002.91.08.50.150211729,40006108501例如,如果專著中規(guī)定150mmX4. 6mm； 5-Mm的柱在

23、1著mL/min卜一操作，用75mmX2. 1mm：2. 5-Pm的柱在1. 5mL/minX0. 4=0. 6mL/min下操作的可以預(yù)期得到相同的分離，同時壓力 增加約4倍，運行時間減少到原來的30軋9. 21注射體枳（HPLC）：注射體枳可根據(jù)它可接受的精度，線性和檢測限度調(diào)整。注意， 過量的注入體枳會導(dǎo)致不可接受的帶展寬，導(dǎo)致N和分辨率降低。適用于梯度和等度分離。9.22柱溫（111：）：柱溫可調(diào)節(jié)10。建議采用控制柱溫以提高保留時間的控制和再現(xiàn) 性。適用于梯度和等度分離。23除非另有規(guī)定，否則從分析物峰確定系統(tǒng)適宜性參數(shù)。樣品物質(zhì)的Rr、&或心的測量值與參考化合物和混合物獲得的值相差

24、不超過從參考化合 物的重復(fù)測定中統(tǒng)計確定的可靠性估計。在信息專著中可以提供相對保留時間，以幫助峰 值識別。沒有適用于相對保留時間的接受標(biāo)準(zhǔn)。適用性測試用于確定最終操作系統(tǒng)的有效性，它應(yīng)該接受這個測試。根據(jù)需要注射 適當(dāng)?shù)闹苿?，以便在整個過程中證明適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)適用性（如專著中方法的色譜系統(tǒng)部分所 述）。該制劑可以是標(biāo)準(zhǔn)制劑或含有已知量的分析物和用于控制分析系統(tǒng)的任何附加材料（例 如，賦形劑或雜質(zhì)）的溶液。每當(dāng)色譜系統(tǒng)（設(shè)備、流動相組分或其他組分）或關(guān)鍵試劑 發(fā)生顯著變化時，就需要重新建立系統(tǒng)的適用性。沒有樣品分析是可接受的除非系統(tǒng)的適 用性已經(jīng)被證明。10、定量：在定量過程中，忽略溶劑和試劑引起的

25、峰或由流動相或樣品基質(zhì)產(chǎn)生的峰。在線性范圍內(nèi)，峰面積和峰高通常與化合物洗脫量成正比。峰面積和峰高通常由電 子積分器測量，但是可以通過更經(jīng)典的方法來確定。峰值區(qū)域通常被使用，但如果峰值下 擾發(fā)生，則可能不那么精確。測量的成分與任何干擾成分分離。峰值尾部和前端被最小化, 并且在可能的情況下避免在其它峰的尾部上測量峰值。盡管優(yōu)選將雜質(zhì)峰與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖中具有相似濃度的峰進(jìn)行比較，但是雜質(zhì)測試 可以基于對雜質(zhì)引起的峰響應(yīng)的測量，并以藥物峰而積的百分比表示。該標(biāo)準(zhǔn)可以是藥物 本身，在對應(yīng)于例如0.5%雜質(zhì)的水平上，假定類似的峰值響應(yīng)。當(dāng)必須以更大的確定性 確定雜質(zhì)時，使用雜質(zhì)本身的標(biāo)準(zhǔn)或基于雜質(zhì)相對于主要組分的響應(yīng)應(yīng)用校正因子。外部標(biāo)準(zhǔn)方法：通過將樣品溶液得到的響應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的響應(yīng)進(jìn)行比較，確定