《衛(wèi)生化學(xué)》課件14.第七章_超高效液相色譜法1

1、超高效液相色譜法（UPLC）色譜實(shí)驗(yàn)室的新高度Jorgensen博士和楊百翰大學(xué)的M. Lee博士最近都發(fā)表了關(guān)于色譜實(shí)驗(yàn)室未來(lái)分析范圍的深刻見(jiàn)解。他們的研究為分離科學(xué)描繪了一幅新圖景。通過(guò)使用比以前小得多顆粒，使分離過(guò)程達(dá)到了一個(gè)新的終點(diǎn)。范第姆特方程是一個(gè)描述線速度與塔板高度（柱效）關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)式。從圖1可以看出，一旦填料的顆粒大小低于2 m，色譜技術(shù)就能達(dá)到一個(gè)新水平：不僅柱效更高，而且隨著流速的提高不會(huì)使柱效降低。如果使用UPLCTM技術(shù)和2 m以下的顆粒，那么即使在較高的線速度下，效率也能得以保持。更短色譜柱和或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和靈敏度，從而使現(xiàn)在有可能充分利

2、用色譜原理進(jìn)行分離。峰容量被定義為色譜法每單位時(shí)間內(nèi)所能分辨的峰數(shù)量。峰容量和分離速度等性能指標(biāo)得到提高后的色譜法被稱(chēng)為超高效液相色譜法，或UPLC。圖2說(shuō)明了當(dāng)顆粒大小從5 m減小至1.7 m時(shí)，增加的峰容量對(duì)色譜分離性能的影響。 源于更小顆粒的額外效率可帶來(lái)更多的明顯益處。更短的色譜柱或更高的流速加快了速度，同時(shí)小顆粒也提高了分辨率。對(duì)于任何給定的分離，都可通過(guò)調(diào)節(jié)這些變量而達(dá)到速度和分辨率的最佳組合該頭發(fā)的直徑約等于12個(gè)5 m的顆粒，33個(gè)1.7 m的顆粒。圖4顯示出了目前實(shí)驗(yàn)室常用的5 m顆粒與建議用于UPLC柱的更小的1.7 m顆粒的明顯差異。目前，非多孔型1.5 m顆粒已經(jīng)上市。

3、雖然這類(lèi)顆粒效率較高，但它們的缺點(diǎn)是表面積較小。表面積小會(huì)導(dǎo)致載樣量小和保留時(shí)間短。為了與HPLC保持相近的保留時(shí)間和載樣量，UPLC必須使用多孔型顆粒。UPLC需要一種新穎的耐高壓多孔型顆粒。填充床的均勻性也是至關(guān)重要的；特別是當(dāng)較短的色譜柱用以保持分辨率的穩(wěn)定，而同時(shí)又要達(dá)到加快分離速度的目標(biāo)時(shí)。另一項(xiàng)要求是色譜柱的內(nèi)表面必須足夠光滑，以便于填充較小顆粒。應(yīng)重新設(shè)計(jì)色譜柱兩端的篩板，使之既能留住小顆粒又能避免堵塞。3 m是15 cm長(zhǎng)普通色譜柱顆粒大小的極限。這是在色譜柱達(dá)到最佳流速而又不超出市售儀器（使用任何配比的甲醇水混合溶劑）的壓力限制范圍的條件下，運(yùn)行系統(tǒng)所能使用的最小顆粒大小。（

4、注意：迄今為止，用于HPLC的最小顆粒是0.67 m 為了達(dá)到顆粒小、峰容量大的分離效果，需要比目前使用的HPLC儀具有更廣的壓力范圍。在能達(dá)到最大效率的最佳流速下，對(duì)于10 cm長(zhǎng)裝有1.7 m顆粒的色譜柱，計(jì)算得出的壓力降是15,000 psi。因此，需要一個(gè)能在該壓力下傳送溶劑的泵。 在這些條件下，溶劑的可壓縮性將會(huì)變得顯著，特別是在多溶劑和梯度分離條件下。UPLC的溶劑傳送系統(tǒng)應(yīng)不僅僅具有高壓泵抽吸功能，同時(shí)在等度和梯度分離模式下使用各種溶劑，溶劑傳送系統(tǒng)必須能抵消溶劑可壓縮性引起的大范圍潛在壓力波動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)而可重現(xiàn)的流體輸送。普通進(jìn)樣閥，不論是手動(dòng)的還是自動(dòng)的，都不具有極端壓力下

5、的耐用功能。進(jìn)樣的可重現(xiàn)性和線性的典型性能標(biāo)準(zhǔn)是分析應(yīng)用所需要的為保護(hù)色譜柱免受極端壓力波動(dòng)的影響，進(jìn)樣過(guò)程應(yīng)盡可能排除脈沖干擾。儀器的系統(tǒng)體積要小，以減小所檢測(cè)樣品可能的區(qū)帶展寬。在快速進(jìn)樣循環(huán)中，UPLC能以最大速度、較大的樣品通量進(jìn)行工作 理論情況下，配備1.7 m顆粒的UPLC系統(tǒng)能產(chǎn)生半峰寬小于1秒的檢測(cè)峰。這給UPLC檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。首先，檢測(cè)器必須具有較高的采樣速率，以在檢測(cè)峰通過(guò)時(shí)捕捉足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)，從而對(duì)分析物的檢測(cè)峰進(jìn)行準(zhǔn)確而可重現(xiàn)的識(shí)別（和積分）檢測(cè)器必須有最小的擴(kuò)散體積，以確保分離效率不降低。檢測(cè)器的光學(xué)部件也必須具有能體現(xiàn)UPLC靈敏度優(yōu)勢(shì)的性能指標(biāo)。從概念上講，對(duì)于不

6、同的檢測(cè)技術(shù)，UPLC檢測(cè)的靈敏度應(yīng)是HPLC分離靈敏度的2-3倍（圖5）。例如，質(zhì)譜檢測(cè)會(huì)極大得益于UPLC的性能特征,使與UPLC相連的質(zhì)譜儀的靈敏度至少提高3倍 在進(jìn)行高峰容量的色譜分析時(shí)，降低分析物的色譜展寬可能有助于提高靈敏度除了化學(xué)、泵、進(jìn)樣器和檢測(cè)器之外，還需要對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行考慮。系統(tǒng)的體積至關(guān)重要。如果要在色譜分析過(guò)程中保持UPLC分離的高性能，則UPLC的系統(tǒng)總體積必須大大低于目前的HPLC系統(tǒng).如：考慮連接管和接頭配件UPLC技術(shù)能實(shí)現(xiàn)提高液相色譜速度、分辨率和靈敏度的承諾，為每次分析提供更多的信息；因此，該技術(shù)將會(huì)得到實(shí)驗(yàn)室的廣泛認(rèn)可。超高效液相色譜法（UPLC）相對(duì)于高效液

7、相色譜法（HPLC）的優(yōu)勢(shì)所在：1.速度超高效液相色譜法（UPLC）采用新型全多孔球形1.7m反相固定相，該固定相是應(yīng)用“雜化顆粒技術(shù)”（hybrid particle technology，HPT）合成的，并由此制備了高柱效的ACQUITY UPLC色譜柱。這使得在常規(guī)高效液相色譜需要30分鐘時(shí)間的樣品分析在超高效液相色譜短短為僅需5分鐘，并呈現(xiàn)出色譜柱柱效達(dá)20萬(wàn)塊/m理論塔板數(shù)的超高柱效。 2.靈敏度我們知道UPLC色譜柱中使用的是1.7m固定相，分離獲得的色譜峰半蜂寬小于1s，這就對(duì)檢測(cè)器的要求是極高的。AQUITY UPLC使用采樣速度達(dá)40點(diǎn)/s，池體積僅為500nL（約為HPLC

8、池體積的1/20）的新型光導(dǎo)纖維傳導(dǎo)得流通池，當(dāng)光束通過(guò)光導(dǎo)纖維進(jìn)入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全析射特征，不損失光能最，而使檢測(cè)靈敏度比HPLC增加23倍。光源可使用可變波長(zhǎng)的紫外光或二極管陣列系統(tǒng)。 3.自動(dòng)化對(duì)于UPLC的進(jìn)樣系統(tǒng)，常規(guī)的手動(dòng)進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣閥都不能滿足系統(tǒng)需求了。在UPLC中為保護(hù)色譜柱不受極端高壓力波動(dòng)的影啊，進(jìn)樣過(guò)程應(yīng)當(dāng)相對(duì)無(wú)壓方波動(dòng)，進(jìn)樣系統(tǒng)的死體積必須足夠小，以降低樣品譜帶的擴(kuò)展。 UPLC的自動(dòng)化進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)有了新突破：針內(nèi)針進(jìn)樣探頭（XYZZ）為高速進(jìn)樣機(jī)械裝里，可快速進(jìn)樣。針內(nèi)針的含義是使用液相色譜管路（PEEK材料）充當(dāng)進(jìn)樣針以減少死體積，而“外針”是

9、一小段硬管，用來(lái)扎破樣品瓶蓋；壓力輔助進(jìn)徉。為了降低進(jìn)樣時(shí)的交叉污染，采用一強(qiáng)、一弱的雙溶劑的進(jìn)樣針清洗步驟，這兩種洗針溶劑需同時(shí)得到良好的脫氣。 此技術(shù)可保證可靠、重現(xiàn)的進(jìn)樣；在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)，可安置96位或384位樣品盤(pán)。每個(gè)位置可放置2或4mL樣品瓶。新型的樣品組織器可接受21個(gè)樣品盤(pán)的編程。 與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白質(zhì)、肽、代謝組學(xué)分析及其它一些生化領(lǐng)域里將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。另外，在天然產(chǎn)物的分析方面，使用UPLC與質(zhì)譜檢測(cè)器連接，會(huì)對(duì)天然產(chǎn)物分析，特別是中藥研究領(lǐng)域的發(fā)展是一個(gè)極的促進(jìn)。 在提到“蛋白組學(xué)”或“

10、代謝組學(xué)”時(shí)，與沒(méi)有“組”的差別從分析的角度說(shuō)就是樣品量極大，需要在短時(shí)間分析成千上萬(wàn)的樣品。UPLC不損失分離度的高速度優(yōu)點(diǎn)在里就能充分體現(xiàn)。多生化樣品及天然產(chǎn)物都十分復(fù)雜， Waters UPLC 超高效液相色譜超高效液相色譜儀 Nexera UHPLC LC-30A 通量最大化：1、 超高速/超高分離度分析承受最大壓力高達(dá)130MPa。2、 超快速進(jìn)樣通過(guò)重疊進(jìn)行，使進(jìn)樣時(shí)間最短，每次進(jìn)樣僅需10秒。3、 樣品容量最大化Nexera換架器，可處理多達(dá)4600種樣品；多路系統(tǒng) （MPX）。 性能最優(yōu)化：1、 微量分析時(shí)，交叉污染最小化以最小的接觸面積通過(guò)進(jìn)樣針；可以使用多種溶劑（最多4種）

11、徹底清洗樣品流路和進(jìn)樣針表面。 2、 以最小的體積，精確并準(zhǔn)確地進(jìn)樣使用高分辨率計(jì)量泵直接進(jìn)樣；計(jì)量泵獨(dú)立于流路之外。3、 在超快速條件下，保證良好的梯度重現(xiàn)性高分辨率梯度控制；MiRC混合器的有效混合機(jī)制 4、 適用于UHPLC的均衡色譜柱加熱IHB控制的柱間溫度分布最小化；通過(guò)微體積預(yù)熱器，有效預(yù)熱。擴(kuò)展性最大化1、 可升級(jí)的UHPLC組件設(shè)計(jì)通過(guò)組合常用的HPLC組件，可以自由地配置系統(tǒng)。2、 使用自動(dòng)進(jìn)樣器，對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)前處理可以進(jìn)行柱前衍生、內(nèi)標(biāo)物添加以及樣品稀釋。 3、 高溫分析柱溫最高達(dá)150；高溫促使新技術(shù)的應(yīng)用，比如綠色色譜法（Green LC）。 4、 高速LCMS分析與

12、超快速LCMS、LCMS-2020相結(jié)合。頭發(fā)中煙堿和可替寧的超高效液相色譜測(cè)定煙堿( nicotine)是煙草中的主要生物堿, 是導(dǎo)致吸煙成癮的物質(zhì)動(dòng)因, 也是評(píng)價(jià)人體攝入煙草煙霧的常用指標(biāo)。可替寧是煙堿在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物, 是評(píng)價(jià)煙草煙霧攝入量的生物標(biāo)志物 測(cè)定發(fā)樣中煙堿和可替寧的含量水平可以反映人群較長(zhǎng)期對(duì)煙草煙霧的暴露情況, 可以為流行病學(xué)調(diào)查提供定量依據(jù), 用于評(píng)價(jià)煙草煙霧對(duì)人體健康的影響。本文了UPLC法測(cè)定主動(dòng)吸煙人群和被動(dòng)吸煙人群頭發(fā)中的煙堿和可替寧試驗(yàn)日本島津超快速液相色譜儀Prominenece UFLC快速分析作為重要技術(shù)課題一直以來(lái)都在使用，但伴隨LCMS的迅速普及，

13、提高性價(jià)比成為迫在眉睫的問(wèn)題，成為了加緊快速化的重要因素?？焖俜治黾纯s短分析時(shí)間，通常通過(guò)縮短色譜柱或提高流動(dòng)相的流量來(lái)達(dá)到目的使用小粒徑的填料 通過(guò)這個(gè)方法將使快速分離成為可能。但是，由于色譜柱里流動(dòng)阻力的增加，儀器各部件和色譜柱所承受的壓力也將顯著地增加高溫分離 較高的溫度可以加速物質(zhì)的擴(kuò)散，同時(shí)可以減小色譜柱里的流動(dòng)阻力，也使得快速分離成為可能。高溫分析在降低柱壓方面很有效，但是高溫引起色譜柱的劣化、導(dǎo)致樣品分解等不足在應(yīng)用時(shí)需要引起注意。UFLC通過(guò)以下特性支持快速分析：小柱管和小體積的流通池降低了柱外峰展寬效應(yīng)。使用2.2m顆粒大小的色譜柱自動(dòng)進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)10秒鐘10l的超快速進(jìn)樣支持

14、高達(dá)85的高溫分析。溫度與快速分析：隨著柱溫升高，理論塔板數(shù)增加，柱效增高，柱壓降低。 溫度對(duì)化合物的影響：高溫分析在降低柱壓方面很有效，但是高溫引起色譜柱的劣化、導(dǎo)致樣品分解等不足在應(yīng)用時(shí)需要引起注意。高溫分析只是作為快速分析的輔助手段加以運(yùn)用。具備高采樣頻率的檢測(cè)器，可以實(shí)現(xiàn)快速的數(shù)據(jù)獲取而不會(huì)丟失信息。專(zhuān)門(mén)的色譜方法轉(zhuǎn)換軟件，使常規(guī)色譜條件轉(zhuǎn)換為UFLC條件簡(jiǎn)單易行，保證分析方法的通用性。 快速分析的重現(xiàn)性 在快速分離中要取得成分保留時(shí)間的重現(xiàn)性要比常規(guī)分析中更加困難。保留時(shí)間的重現(xiàn)性（RSD）和時(shí)間的平方根成反比增大，所以需要比常規(guī)分析更為嚴(yán)格的送液性能。Prominence UFLC

15、可以保證送液分辨率 3nL/min的微沖程送液、梯度送液時(shí)控制響應(yīng)為0.1秒的卓越送液能力，可以發(fā)揮極為優(yōu)越的保留時(shí)間重現(xiàn)性。 什么是高通量 快速液相色譜的目標(biāo)就是高通量，也就是說(shuō)每天或每小時(shí)有更多的樣品被分析。為了實(shí)現(xiàn)高通量，不僅要縮短單個(gè)樣品分析時(shí)間，而且整個(gè)循環(huán)進(jìn)樣和分析時(shí)間也必須優(yōu)化。追求快速化的本意不僅是縮短分析時(shí)間，而且是縮短分析周期。Prominence UFLC的樣品注入速度為10秒，使得分析周期得以大為縮短。PTC衍生氨基酸的UFLC分析多環(huán)芳烴(PAHs)的UFLC分析 2004年waters推出了UPLC（UltraPerformance LC）2005年jasco推出了XPLC2006年shimadzu推出了UFLCthermo fisher推出了UHPLC超高效液相色譜 (Ultra-High Per