微生物學(xué)課件：10微生物感染的實驗室診斷

1、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部Peking University Health Science Center 微生物感染的實驗室診斷Laboratory diagnosis of microorganism infectionP157實驗室診斷的意義明確患者的臨床診斷選擇有效的治療措施預(yù)防疾病繼續(xù)傳播與流行判斷患者預(yù)后實驗室診斷方法分類鏡下直接觀察病原微生物分離、培養(yǎng)和鑒定病原微生物的抗原檢測特異性RNA或DNA片段檢測抗體和細(xì)胞免疫指征的檢測樣本的采集、運(yùn)輸、樣本前期處理形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物學(xué)等方法檢查出病原微生物及其型別動物實驗、細(xì)菌毒素檢測和藥物敏感性實驗細(xì)菌感染的實驗室診斷采集操

2、作：無菌操作 ，做好標(biāo)記采集部位：組織、血、尿液、糞便、痰、腦脊液、分泌物、嘔吐物、胸腹穿刺物及解剖樣品等 采集時機(jī)：根據(jù)病程發(fā)展的不同階段采集不同部位的樣品 運(yùn)輸：應(yīng)遵循安全、快捷的原則 前期處理：濃縮 標(biāo)本采集和運(yùn)送 形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌的培養(yǎng)特征觀察：顏色、氣味、溶血性、菌落形態(tài)、細(xì)菌動力及在液體、半固體、固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài) 顯微鏡檢查法：形態(tài)、基本結(jié)構(gòu)、染色性、排列方式、數(shù)量 非染色檢查法 染色檢查法負(fù)染色檢查法 細(xì)菌分離培養(yǎng)法 臨床標(biāo)本細(xì)菌分離：分區(qū)劃線細(xì)菌培養(yǎng)挑取單菌落，純培養(yǎng)鑒定細(xì)菌感染的實驗室診斷程序 免疫學(xué)檢查 免疫沉淀反應(yīng) 凝集反應(yīng) 補(bǔ)體結(jié)合試驗 免疫標(biāo)記技術(shù) 生物化學(xué)檢查

3、糖代謝試驗 糖發(fā)酵試驗 甲基紅試驗 V-P試驗 蛋白質(zhì)代謝試驗 硫化氫產(chǎn)生試驗?zāi)蛩胤纸庠囼炋荚春偷蠢迷囼?枸櫞酸鹽利用試驗 呼吸酶類試驗過氧化氫酶試驗氧化酶試驗 分子生物學(xué)檢查 G+C測定技術(shù) 核酸雜交技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) 質(zhì)粒指紋圖譜技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)生物學(xué)檢查 噬菌體裂解試驗 細(xì)菌素分型技術(shù) 抗菌譜試驗 動物實驗及細(xì)菌毒素檢測 小鼠豚鼠家兔* LD50* ID50藥物敏感性試驗 紙片擴(kuò)散法 液體稀釋法 E測定法(E test) 自動化藥敏測定法 耐藥基因測定法 病毒感染的實驗室診斷 標(biāo)本的采集和送檢標(biāo)本采集部位：鼻咽分泌液或痰液 、腦脊液 、糞便 、血液 標(biāo)本采集時間

4、發(fā)病早期或急性期標(biāo)本運(yùn)送對熱不穩(wěn)定，裝有冰塊或干冰的容器內(nèi)立即送檢 加入青霉素、鏈霉素等抗生素 ，抑制細(xì)菌和真菌生長形態(tài)學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡檢查 包涵體（inclusion）：某些病毒感染宿主細(xì)胞后,可在細(xì)胞核或漿內(nèi)出現(xiàn)一個或數(shù)個、呈圓形或不規(guī)則、大小不一、嗜酸性或嗜堿性的結(jié)構(gòu) 電鏡檢查 直接電鏡法 免疫電鏡法 輪狀病毒負(fù)染的電鏡照片病毒分離和培養(yǎng) 動物接種小白鼠、大白鼠、豚鼠、兔、雞、猴，采用鼻腔、腦內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈等方式 雞胚培養(yǎng)組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)： 23代 用于診斷和疫苗制備 二倍體細(xì)胞培養(yǎng)：40 10代 傳代細(xì)胞培養(yǎng)：無限傳代 用于分離多種病毒，但不能

5、用于制備疫苗 絨毛尿囊膜接種（痘病毒單純皰疹病毒）卵黃囊接種（蟲媒病毒）羊膜腔接種（流感病毒初次分離）尿囊腔接種（流感病毒、腮腺炎病毒）氣室病毒生長繁殖的指標(biāo)與鑒定 細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)紅細(xì)胞吸附 紅細(xì)胞凝集 干擾作用 細(xì)胞代謝反應(yīng)空斑形成單位（PFU） 細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE) 培養(yǎng)的單層細(xì)胞接種病毒后導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生圓縮、溶解、脫落等病變的現(xiàn)象。 病變細(xì)胞正常細(xì)胞red bloodcell紅細(xì)胞吸附virus+susceptiblecells+viral proteins expressedon the cell me

6、mbranered bloodcell紅細(xì)胞凝集virus+susceptiblecells+viruses releasedfrom the cells virus A+susceptiblecellsvirus B+CPE (-)virus B+CPE (+)susceptiblecells病毒干擾作用空 斑 plaque由病毒感染細(xì)胞后在培養(yǎng)瓶的瓊脂層上形成的一個壞死病灶空斑形成單位 PFU (plaque formation unit)每毫升空斑形成單位 病毒蛋白的檢測 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 免疫熒光技術(shù) 酶免疫技術(shù) 固相放射免疫技術(shù) 蛋白印記分析 Enzyme Immuno Assay (EIA) Ex. Sandwich immunoassayAgAb 病毒核酸的檢測 核酸分子雜交技術(shù) 核酸分子擴(kuò)增技術(shù) 基因芯片技術(shù) 血清學(xué)診斷 補(bǔ)體結(jié)合試驗 中和