PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用課件

1、PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用張雪梅檢驗(yàn)系臨床生化教研室主要參考書CW迪芬巴赫、GS德弗克斯勒美主編 。PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南 黃留玉主編。PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用 尹一兵主編。分子診斷學(xué)目 錄PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的衍生技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用一、PCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugDNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反

2、應(yīng)體系PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物

3、2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95第2輪開(kāi)始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 重復(fù)30輪后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)

4、的發(fā)明PCR的完善1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制然而，采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善

5、1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀實(shí)驗(yàn)步驟（1）在0.5ml PCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510 PCR Buffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH2

6、O16.315.3Total2020（2）PCR反應(yīng)程序(1) 94變性5min，(2) 94變性1min， (3) 52 退火1min， (4) 72 延伸1min。 (5) 72 延伸10min。重復(fù)(2)-(4)30次PCR結(jié)果：1、對(duì)照(無(wú)模板)；26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）PCR產(chǎn)物的電泳鑒定PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，14 小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度

7、要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA（1）模板單、雙鏈DNA均可，多種來(lái)源。質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般人基因組100ng DNA模板（100L）。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)的影響因素1)反應(yīng)體系LambdaDNA，模板量分別為100pg,10pg,1pg,100fg,10fg（2）引物 引物是與待擴(kuò)增DNA片斷兩翼互補(bǔ)的一段特異的寡核苷酸片斷。 引物是PCR反應(yīng)中最關(guān)鍵的因素，因此引物序列的設(shè)計(jì)對(duì)于PCR是否成功是非常重要的。 引物設(shè)計(jì)的原則：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序

8、列。序列的查找可在相關(guān)的網(wǎng)址，如/pubmed 查找各種目的序列。同源性比較可以在www.ncbi.nih/blast.cgi進(jìn)行在線比較或通過(guò)OMIGA、Clustal X等軟件進(jìn)行兩兩或多序列的比較。引物序列同源性比對(duì)（2）引物長(zhǎng)度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列（二聚體）。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無(wú)嚴(yán)格限制。3535限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)常用軟件主要有：Primer Premier 5.0 Oligo 6primer 3The P

9、rimer GeneratorNet Primer 1. 將序列輸入軟件中（2）在表中粘貼序列（1）新序列兩個(gè)方法選擇序列文件所在位置（2）打開(kāi)原有的序列文件 在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列 點(diǎn)擊左上角的“Primer”按鈕2. 設(shè)置相關(guān)參數(shù)3. 得到的引物結(jié)果Hairpin: 引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer: 同一種引物是否會(huì)形成二聚體False primiring: 引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體正向和反向引物的互換正向和反向引物的評(píng)價(jià)正向和反向引物的信息每點(diǎn)擊左邊紅色的按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯可對(duì)引物進(jìn)

10、行增加或減少堿基用鍵盤輸入5個(gè)堿基引物的信息改動(dòng)后引物的信息重新回到雙引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34. 輸出引物序列引物純度：公司合成引物常用的純化方式C18脫鹽、OPC 純化、PAGE純化、HPLC純化。 普通PCR：OPC純（95%） 較長(zhǎng)引物（大于50個(gè)堿基） ：PAGE純（95%） 經(jīng)過(guò)修飾或標(biāo)記的引物：HPLC純（ 99%,但價(jià)格昂貴）引物濃度：0.1-0.5 mol/L，濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降。合成內(nèi)容產(chǎn)量(OD)發(fā)貨時(shí)間(工作日)純化方式價(jià)格(￥)普通引物合

11、成(12kb）的功能較強(qiáng)。 Pfu DNA聚合酶 ：具有35外切酶活性的校對(duì)功能，催化DNA合成的忠實(shí)性比Taq聚合酶高12倍，但不適于2kb的片斷擴(kuò)增。2）其他的耐熱聚合酶（4）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系

12、中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 95oC 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸 70-75oC， 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加二、PCR的衍生技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 反向PCR（inverse PCR） 巢氏PCR（nesting PCR） 原位PCR（in situ

13、 PCR） 多重PCR（multiplex PCR） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） 不對(duì)稱PCR（asymmertric PCR） 錨定PCR（anchored PCR） 長(zhǎng)片段PCR（long fragment PCR） 熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增1、逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR) 影響因素（1）模板對(duì)RT-PCR的影響 對(duì)RNA制品的純度和完整性要求都極為嚴(yán)格 （2）逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RT-PCR的影響 M

14、LV逆轉(zhuǎn)錄酶能合成大于2kb的較長(zhǎng)cDNA，但對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV逆轉(zhuǎn)錄酶差。 （3）逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)RT-PCR的影響 隨機(jī)引物：原核細(xì)胞多用 oligo(dT)：真核細(xì)胞多用 基因特異性的引物（GSP）：特異性強(qiáng)，廣譜性低 例子： S.pn的轉(zhuǎn)化對(duì)PsaA基因mRNA表達(dá)的影響a、RNA的提?。?野生型和轉(zhuǎn)化缺陷型S.pn都誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，采用Qiagen試劑盒進(jìn)行總RNA提取。 b、cDNA的制備： 取RNA 2l，隨機(jī)引物1l，DEPC水9l，混勻后，70變性5min，立即置于冰上。然后順序加入逆轉(zhuǎn)錄buffer 5l，dNTP 1.5l, RNasin 0.5l, DEPC水5l, 逆轉(zhuǎn)錄酶

15、M-MLV 1l。混勻后于37，1小時(shí)，得到cDNA。c、PCR擴(kuò)增: PsaA的引物3L，cDNA 1L，Tag plus酶0.2L，共30L體系。循環(huán)參數(shù)：94 30秒，55 40秒，72 45秒，循環(huán)30次。用16s rRNA的PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)物，2%瓊脂糖電泳。 電泳結(jié)果用軟件Quantity-one 3.2進(jìn)行半定量比較，結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析16S(463bp)PsaA(254bp)圖2， 2號(hào)菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時(shí)間PsaA mRNA的表達(dá)。 1 2 3 4 5 6 7圖1， 2號(hào)菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時(shí)間PsaA 的RT-PCR電泳圖。li

16、ne1: Marker2. line2-4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 was added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP. *2、反向PCR (inverse PCR) 用反向的引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用：（1）用于測(cè)序的DNA大片段的克?。?）獲得啟動(dòng)子序列（3）小質(zhì)粒的定點(diǎn)突變（4）鑒定插入失活基因或體內(nèi)誘導(dǎo)基因已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示

17、意圖轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒引物即可直接對(duì)X片斷進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列Xdw序列質(zhì)粒引物質(zhì)粒引物質(zhì)粒引物例子：S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因序列的獲得3、多重PCR(multiplex PCR) 用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物 圖1 第1、2、3組引物多重PCR電泳圖 1：正常對(duì)照；2：DL2000 marker；310：檢出的缺失型患者 杜氏/貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 一種常見(jiàn)的致死性神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)的X連鎖隱性遺傳病，其基因突變中缺失最常見(jiàn)，約占55%65%，缺失分布的位點(diǎn)較多，隨地域及民族的差異而有不同特點(diǎn) 4、突變PCR（1）隨機(jī)突變

18、：應(yīng)用：構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體 策略：易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）。利用Taq DNA聚合酶等耐熱DNA聚合酶不具有35校對(duì)功能的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，從而產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。加入次黃嘌呤核苷酸并限制某一種核苷酸的用量，從而促進(jìn)DNA聚合酶選擇其它3種核苷酸或次黃嘌呤核苷酸，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生突變。（2）定點(diǎn)突變（1）5端引入突變：通過(guò)修飾上游引物的5 端，即可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。（2）序列中的單位點(diǎn)突變：采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR)（A）為5端

19、引入突變 （B）為單堿基突變例子：S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建 S.Pn的ply為一細(xì)胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗： 首先設(shè)計(jì)4個(gè)引物：（M1和M2完全重疊）P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IP2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho IM1: 5-GGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATG-3 M2: 5-CATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACC-3 突變位點(diǎn)M2M1P2P1555335為酶切位點(diǎn)序列以基因組

20、DNA 為模板，以P1和M1為引物擴(kuò)增出ply上游片斷，以P2和M2為引物擴(kuò)增出ply下游片斷以上下游片斷為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)出全長(zhǎng)酶切后克隆到質(zhì)粒中保存（3）多位點(diǎn)突變策略：多次重疊PCR關(guān)鍵：重疊引物的設(shè)計(jì)（每對(duì)突變引物需要部分重疊，方向相反）。5、原位PCR (In Situ PCR) 原位PCR是由Hasse等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。

21、操作步驟1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2. PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù) 通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程；結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。如何定量？Ct值的概念Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 為什么要用Ct值定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開(kāi)始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品

22、間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。 C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；C(t)值具重現(xiàn)性熒光強(qiáng)度循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系定量原理初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值）Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度1、熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料SYBR Green

23、I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green I 1）內(nèi)摻式染料5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green I 優(yōu)點(diǎn)使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物 沒(méi)有序列特異性 可以用于不同的模板 便宜 靈敏例子：熒光定量PCR檢測(cè)肺炎鏈球菌comE基因轉(zhuǎn)錄水平 方法流程：1、標(biāo)準(zhǔn)品制備：普通PCR擴(kuò)增出comE基因片斷裝入克隆質(zhì)粒定量稀釋為109拷貝作為標(biāo)準(zhǔn)品備用2、定量

24、檢測(cè)comE基因表達(dá)水平：提取RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA與成10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品一起作為模板，同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果得到其表達(dá)的絕對(duì)量。圖1 comE基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖2 comE基因熒光定量PCR融解曲線 表1 D39菌株在CSP誘導(dǎo)后不同時(shí)間的comE基因mRNA表達(dá)批次comE/16SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.111230.01240.40730.0160*：p0.05，CSP誘導(dǎo)10min時(shí)comE的表達(dá)量較0min和20min時(shí)顯著增高實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Oligo 1: Fluores

25、ceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRET Probe）2）序列特異性探針雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 特別適合于SNP檢測(cè)與 Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單是目前應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)TACCGGGGGTTACGAACGGTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C CSNP檢測(cè)RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（Molecular Beacon Probe）535353533RQ5

26、RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（Amplifluor Probe）3）引物特異性探針2、熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較靈敏度高 靈敏的熒光檢測(cè)較電泳檢測(cè)靈敏度高特異性高 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性定量準(zhǔn)確 全程監(jiān)控，準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量無(wú)需跑膠，自動(dòng)化程度高4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀3、熒光定量 PCR儀 熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。 PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝 凱利穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：

27、PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念。 它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul RabinowPCR技術(shù)的應(yīng)用研究與生產(chǎn)基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，腫瘤診斷法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析其他1) 基因克隆重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA基因片段酶切PCR擴(kuò)增染色體DNA連接基因工程產(chǎn)品大腸桿菌胰島素重組體 +胰島素基因染色體DNAPCR擴(kuò)增 我國(guó)已批準(zhǔn)生產(chǎn)的部分生物技術(shù)藥物名稱 作 用 rhu EPO 產(chǎn)生紅細(xì)胞rhu IFN1b (外用) 病毒性角膜炎rh

28、u IFN1b 乙肝、丙肝rhu IFN2a 乙肝、丙肝、皰疹等rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝rhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等rhu IFN2a (栓劑) 婦科病rhu IFN2b (凝膠劑) 皰疹等rhu IFN 類風(fēng)濕人胰島素 糖尿病rhu GCSF 刺激產(chǎn)生白細(xì)胞rhu GMCSF 刺激產(chǎn)生白細(xì)胞、骨髓移植rhu GH 矮小病乙肝疫苗 預(yù)防乙肝rhu EGF(外用) 燒傷、創(chuàng)傷EGF 衍生物 燒傷、創(chuàng)傷rhu IL2 癌癥輔助治療rhu IL2 125Ser 癌癥輔助治療bFGF(外用) 創(chuàng)傷、燒傷RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 單 抗乳膏劑 銀屑病痢疾疫苗 預(yù)防痢疾

29、Sequencing by synthesis (Illumina/Solexa)： read length 80-150bp, 1G/run. 2)基因測(cè)序dioldiol1st cycle denaturation1st cycle annealingdioldioln=35total1st cycle extensiondioldioldioldiol2nd cycle denaturation2nd cycle annealingdioldioldioldioldioldiol2nd cycle extensionPCRPCR3)基因檢測(cè)A內(nèi)源性病變基因正常人A病 人外源性基因正常人

30、(-)病 人 (+)-地中海貧血癥 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ amplification refractory mutation system，ARMS）進(jìn)行檢測(cè)（1）內(nèi)源性基因檢測(cè)遺傳病的診斷300bp1000bp800bp圖1，珠蛋白ARMS檢測(cè)結(jié)果11、2分別為正常樣本的N產(chǎn)物和M產(chǎn)物，3、5、7為檢測(cè)樣本的N產(chǎn)物, 4、6、8為相應(yīng)M產(chǎn)物。圖2，珠蛋白ARMS檢測(cè)結(jié)果2 1為N產(chǎn)物，2為M產(chǎn)物對(duì)照產(chǎn)物861bp囊性纖維化病(CF) 鐮刀型細(xì)胞貧血癥 （2）外源性基因檢測(cè)病原體的診斷丙型肝炎病毒（HCV）感染的診斷HBV感染的傳統(tǒng)診斷主要采用免疫測(cè)定法檢測(cè)血清標(biāo)本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（兩對(duì)半），免疫學(xué)方法雖然比較簡(jiǎn)單，但只能提供血清中的HBV間接證據(jù)，無(wú)法證明是否具有傳染性，且敏感性較低。目前的熒光定量PCR方法多采用TaqMan探針，一般根據(jù)HBV基