基因?qū)嶒?yàn)步驟

1、一基因組DNA的提取一苯酚抽提法凍存血樣室溫融化，吸取500ul血液加入2.0ml的滅菌離心管內(nèi)。向離心管內(nèi)加入1.5ml的PBS緩沖液，顛倒搖勻10min, 12000rpm 4。離心 10min。棄去上清液，重復(fù)上一步驟1-2次（加液后可輕彈管壁使沉淀脫離， 直至出現(xiàn)白色沉淀止）。棄去上清液，加入500ul DNA抽提緩沖液，搖動(dòng)使沉淀脫離管壁。加入Pr酶k10ul （20ul/ml），吹打混勻，55C，水浴過(guò)夜（16T8h， 消化過(guò)程中可不時(shí)輕輕搖勻反應(yīng)液）。反應(yīng)液冷卻至室溫后，加入Tris-平衡酚500ul，搖動(dòng)混勻20min， 12000rpm 4。離心 10min。取上清液移至另一

2、2.0ml的滅菌離心管內(nèi)，加等體積苯酚：氯仿: 異戊醇（25:24:1），顛倒混勻 20min，12000rpm 4。離心 10min。取上清液移至另一2.0的滅菌離心管內(nèi)，加等體積氯仿：異戊醇 （24:1），緩慢顛倒離心管 20min，12000rpm 4。離心 10min。輕輕取上清液移至另一 1.5ml的滅菌離心管內(nèi)，加2倍體積的無(wú)水 冷乙醇（-20C），輕輕上下顛倒混勻，冰浴10-20min，可見(jiàn)DNA沉 淀，12000rpm 4。離心 10min。棄去上清液，沉淀用1ml 70%乙醇吹打洗滌，12000rpm 4。離心 10mino棄去上清液，室溫晾十。加入50ml TE溶解DNA，

3、-20C保存。二DNA濃度與純度的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取2uL待檢NDA溶液和3uL加樣緩沖液混勻，在2.0%的瓊脂糖 凝膠。根據(jù)電泳槽的長(zhǎng)度確定合適的時(shí)間，一般5 V/cm,紫外燈下 觀察電泳結(jié)果，并拍照保存。用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。吸取5uL樣品，加超純水3mL混勻，移入分光光度計(jì)的比色杯中。 用3mL超純水校正零。在260nm和280nm分別讀出光密度。用OD260/OD280 的比值估測(cè)純度，比值大于1.8時(shí)，有RNA，應(yīng)用RNA酶處理；比值 小于1.6,有酚或者蛋白，應(yīng)再次抽提。三基因組DNA的除蛋白純化1.50Oul的DNA溶液中加入20%SDS使其終濃度為0.1%，加入蛋

4、白酶 K至終濃度達(dá)到1O0ug/ml。2.55C保溫10h左右。用等體積苯酚、苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:l )和氯仿分別抽提一次， 12000rpm 4。離心 10min。分相后，吸取上層水相移入另一離心管中。加入2倍體積冰冷無(wú)水乙醇(-20C )沉淀DNA，12000rpm 4C離 心 10mino棄去上清液，DNA沉淀70%乙醇洗滌一次，12000rpm4。離心10min。棄去上清液，室溫晾十。加入50ml TE溶解DNA，-20C保存。四基因組DNA的除RNA純化DNA溶液中加入20mg/mlRNaseA使終濃度達(dá)到50ug/ml，37C保溫30min。用等體積苯酚、苯酚:氯仿:異

5、戊醇（25:24:1）和氯仿分別抽提一次，12000rpm 4。離心 10min。分相后，吸取上層水相移入另一離心管中。加入2倍體積冰冷無(wú)水乙醇（-20C ）沉淀DNA, 12000rpm 4C離心 10mino棄去上清液,DNA沉淀70%乙醇洗滌一次,12000rpm4。離心10min。棄去上清液，室溫晾十。加入50ml TE溶解DNA, -20C保存。五引物設(shè)計(jì)與合成參考魏伍川對(duì)耗牛FSHR基因5端的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行引物設(shè)計(jì)， 設(shè)計(jì)好的引物送生物公司合成。引物設(shè)計(jì)如下：引物堿基數(shù)序列（5至3）擴(kuò)增區(qū)域引物1267GAAAGGACATGCGACAGFSHR5 端CCTCCAGGCTACTTGAT

6、A引物2332GTAGCCTGGAGGAAGACAFSHR5 端CTCCCAGACAAATAGCAGA引物3372TCTGCTATTTGTCTGGGAGT第1外顯子GCCACGCTGTTGTTCC六引物溶液的配制將引物管進(jìn)行瞬間離心，加入（公司DNA合成報(bào)告單上的nmol 數(shù)X10）ul滅菌雙蒸水，配制成100uM的濃度，充分振蕩5-10min， 在4C放置24小時(shí)，使其充分溶解，然后再稀釋成實(shí)驗(yàn)濃度10 uM。七 建立最佳的PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件PCR的反應(yīng)體系如下表:反應(yīng)體系成分（濃度）體積（單位：ul）模板2.5Taq混合酶25上、下游引物（10uM）各1.5重蒸水19.5總體積50注

7、：Taq 混合酶溶液組成:Taq 酶（0.05U/ul）;PCR Buffer（3mM）;dNTPs（各 0.4mM）。35個(gè)循環(huán)三對(duì)引物的退火溫度分別對(duì)應(yīng)為：55C、53C、51C。八PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳稱(chēng)取2g瓊脂糖加入到盛有100ml 1 X TBE的燒杯中，在微波爐中加熱至溶。待溶化的膠稍微冷卻后加入EB至終濃度0.5 g/ml，即制成2.0% 的瓊脂糖凝膠。用合適的梳子形成加樣孔，待膠凝固后，放入電泳槽，加入1 XTBE 電泳緩沖液，至少高于膠面。將待檢測(cè)的PCR產(chǎn)物和加樣緩沖液（漠酚藍(lán)）以1:2的比例混合均 勻，加入點(diǎn)樣孔。根據(jù)電泳槽的長(zhǎng)度確定合適的時(shí)間，一般5 V/cm。凝膠

8、成像儀下檢測(cè)結(jié)果。九非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳三對(duì)引物均38.5%丙烯酰胺（37.5： 1）凝膠貯存液制備；第一、二對(duì)引物使用14%非變性聚丙烯酰胺凝膠工作液，第三對(duì)引物使用10% 非變性聚丙烯酰胺凝膠工作液。以下以14%非變性聚丙烯酰胺凝膠工 作液為例，介紹實(shí)驗(yàn)步驟。洗凈玻璃板和間隔片并用無(wú)水乙醇擦洗晾十。在制膠架上安裝玻璃與間隔片。在燒杯中加入38.5%丙烯酰胺凝膠貯存液（37.5： 1）13ml，5 X TBE7ml，10%過(guò)硫酸銨210 ul，TEMED 50ul，加蒸餾水補(bǔ)充至35ml，混 勻后迅速灌膠。當(dāng)灌膠至玻璃板上沿1cm時(shí)停止灌膠，插入梳子，室溫聚合20min 左右，隨時(shí)觀察凝

9、膠聚合情況并補(bǔ)加丙烯酰胺。凝膠聚合好后，向電泳槽加入0.5 X TBE，用注射器沖洗點(diǎn)樣孔。預(yù)電泳10min，同時(shí)準(zhǔn)備點(diǎn)樣。取2ul PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加8ul SSCP變性緩沖液，離心混 勻，98C變性 10min。迅速冰浴10min，用10 ul點(diǎn)樣槍點(diǎn)樣。在該引物適合的溫度、電壓、時(shí)間下進(jìn)行電泳。三對(duì)引物適合的溫度、電壓、時(shí)間如下表:引物溫度電壓時(shí)間引物122C200V15h引物218 C150V12h引物325 C300V12h十硝酸銀染色凝膠在去離子水中沖洗1遍。用銀染固定液浸泡凝膠，輕輕搖晃10min，倒去銀染固定液。用銀染染色液浸泡凝膠，輕輕搖晃10min，倒去銀染染色液。凝膠在