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1、基因高表達利用高表達質(zhì)粒載體pCaEXP通過基因同源重組方法構建SODs基因高 表達的VX2瘤株肝癌模型。一、材料、試劑和儀器高表達質(zhì)粒載體pCaEXP,大腸桿菌,培養(yǎng)基(按配方配制酵母浸膏 蛋白月東葡萄糖培養(yǎng)基),限制性內(nèi)切酶;Pyrobest DNA olymerase、 DNA Marker DL2000、Goldview核酸染料,質(zhì)粒DNA小量抽提試劑 盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒,瓊脂糖,小量酵母菌總R NA抽提試劑盒, Real Time RT-PCR 所用試劑;Real Time PCR儀,F(xiàn)R-200紫外與可見分析裝置,電泳槽,高 速冷凍離心機,恒溫振蕩培養(yǎng)箱。二、方法步驟為了實現(xiàn)
2、SODs基因的高表達,將SODs基因完整開放閱讀框(ORF) 連接于高表達質(zhì)粒載體pCaEXP中MET3啟動子的后面,以實現(xiàn)MET3 對SODs基因ORF的控制。1、首先用基因組抽提試劑盒抽提SODs基因組,在SODs基因組中用含 有Bam H I和Pst I酶切位點的引物P1和P2擴增SODs基因ORF全長。2、使用上述兩個酶分別酶切SODs基因的ORF和pCaEXP質(zhì)粒,酶切 產(chǎn)物純化后使用T4 DNA ligase進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) 大腸桿菌DH5a,在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選,挑取 陽性克隆擴增后采用質(zhì)粒抽提試劑盒小量抽提質(zhì)粒,然后對所抽提 的高表達質(zhì)粒載體p
3、CaEXP-SPE 1采用酶切方法進行鑒定。基因敲除基因敲除兔肝癌模型制備,方法有很多種,如傳統(tǒng)ES打靶、 TALEN、CRISPR/Cas9,還有 TetraOneTM 基因敲除。以 CRISPR/Cas9 技術為例:一、材料、試劑和儀器sgRNA; UCA試劑盒(對sgRNA/Cas9進行活性檢測),質(zhì)粒載體, sgRNA/Cas9 mRNA,PCR試劑盒,其他常規(guī)試劑;全自動生化分析儀,微量移液器,電熱恒溫水浴箱,超凈工作臺, 凝膠圖像掃描儀,微波爐,混勻器,離心機,生物顯微鏡。二、方法步驟EGE技術(基于Crispr cas9技術)設計構建識別靶序列的sgRNA;設計構建致靶基因切割的
4、EGE系統(tǒng)載體質(zhì)粒;利用UCA試劑盒對sgRNA/Cas9進行活性檢測;設計構建打靶載體;體外轉(zhuǎn)錄 sgRNA/Cas9 mRNA;兔肝癌原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶載體;獲得Fo代兔,利用PCR對Fo代兔進行基因型鑒定;獲得F1代兔,利用PCR和southern blot雜交技術對F1代兔進 行基因型鑒定。細胞培養(yǎng)一、材料、試劑和儀器 主要儀器與試劑勻膠機,光刻機,體視顯微鏡,倒置熒光顯微鏡,等離子鍵合機, 酶標儀,圖像處理軟件,CO培養(yǎng)箱,水浴鍋,灌流泵,大容量離心 機,超凈工作臺,移液器等;海藻酸鈉,氯化鈣,檸檬酸鈉,熒光素鈉,胰蛋白酶,小牛血清, RPMI-1640培養(yǎng)
5、基,胰蛋白酶,L-谷氨酰胺SU-8光刻膠及顯影液, Sylgard184型聚二甲基硅氧烷,染色劑,以及青霉素與鏈霉素。二、方法步驟HBSS 溶液:取 HBSS 47. 5 m L,分別加入 0. 5 mol / L EGTA0. 05 m L和1 mol / L HEPES2. 5 m L,充分均勻,4C保存?zhèn)溆?。SFM培養(yǎng)液:取RPMI-1640培養(yǎng)基45 m L,分別加入50以g / m L 青鏈霉素0. 5 m L,10 mg /m L鏈霉素0. 25 m L,滅活小牛血清5 m L,200 mmol/L L-谷氨酰胺0. 5 m L,充分混勻備用。將細胞接種于培養(yǎng)皿中37C,5% CO2培養(yǎng)箱
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