歐洲藥典系統(tǒng)適應(yīng)性測試

1、105Volufne(V2.2.46色譜分離技術(shù)色譜分離技術(shù)是一種多級分離方法，樣品在固定相和流動相之間多次分配，達(dá)到動態(tài)平衡。固定相一般是附在硅膠或者其它固體載體上的固體或液體，可填充在層析柱上或鋪在薄層版/薄膜上，流動相町以是氣體、液體或者超臨界流體。分離原理包括吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等，也可根據(jù)樣品分子的人小、空間體積、質(zhì)量等物理化學(xué)性質(zhì)來分離。本章介紹了系統(tǒng)適應(yīng)性測試涉及的參數(shù)定義及計(jì)算方法，分析方法和儀器介紹等已分別在以下章節(jié)做了介紹：紙色譜12.26薄層色譜2.2.27氣相色譜2.2.28液相色譜2.2.29排阻色譜2.2.30超臨界流體色譜12.45該方法

2、做適當(dāng)調(diào)整以符合藥典規(guī)定。色譜圖反應(yīng)檢測器的響應(yīng)信號、洗脫劑濃度或體積與時間的關(guān)系等。理想的色譜圖是在平穩(wěn)的基線上各色譜峰彼此分離，呈高斯分布。色譜峰色譜柱中洗脫的單個組分或者未分離的多個組分在檢測器上的響應(yīng)信號，是色譜圖的一部分。一般用峰面積、峰高h(yuǎn)和半高峰寬Wh、峰高h(yuǎn)和峰寬旳等參數(shù)來描述色譜峰。高斯峰有如卜關(guān)系（圖2.2.46-1）：Wfl.lSw】保留時間tR組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人峰所需時河保留體積Vr組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人峰所需的流動相體積，可用保留時間乘以流速F。Vr=IrXF死時間切不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人105Volufne(V105Volufne(VPeak1Pea

3、k2VolumeV)Time(f)105Volufne(V105Volufne(VFigure2.2.46.-1.105Volufne(V定義下面分別介紹系統(tǒng)適應(yīng)性和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)參數(shù)定義。有些儀器的軟件系統(tǒng)包含了一些特定參數(shù)的計(jì)算方法（例如性噪比、分離度）。操作人員有責(zé)任確認(rèn)該計(jì)算方法是否符合歐洲藥典要求，如果有差別，應(yīng)對峰所需時間死體積VM不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人峰所需流動相體積。VM=twXF排阻色譜中用V。表示（見下面）。保留因子k有時用容量因子0或者分配比Dm表示，計(jì)算公式如下：_固定相中的組分就士心一一流動相中的組分奩鳳表示分配常數(shù)，也叫平衡分配系數(shù)V,表示固定相體積

4、Vm表示流動相體積在色譜系統(tǒng)中某組分的保留因子也可按F式計(jì)算：K%_切加流動相總時間tt,當(dāng)組分粒徑小于固定相膠體孔徑的最小尺寸時，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需時間(圖2.2.46-2)流動相總體積vt,當(dāng)組分粒徑小于固定相膠體孔徑的最小尺寸時，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需流動相體積，可按下式計(jì)算Vt=UXF滯留時間to：當(dāng)組分粒徑人于固定相膠體孔徑的最人尺寸時，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需時間滯留體積Vo：當(dāng)組分粒徑人于固定相膠體孔徑的最人尺寸時，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需體積，可按下式計(jì)算Vo=toXFKo%trt0分配常數(shù)ko：表示排阻色譜中某一組分的洗脫能力，也叫分配系數(shù)，可用下式計(jì)

5、算：105Volufne(V105Volufne(VLGandGC105Volufne(V105Volufne(VSize-exclusionchromatography105Volufne(V105Volufne(VSSEE00202WO5L111Time(f)Figure2.246.-2.1XJ%50-滯留因子rf：在平面色譜中也叫保留因子Rr，表示組分在板上的點(diǎn)到原點(diǎn)之間的距離與溶劑前沿到原點(diǎn)的距離的比值（圖2.2.46-3）oA.mobilephacfrontB.spotC.lineofapplicationFigure2246.3B是分析物的移動距離A是溶劑前沿的移動距離塔板數(shù)N：可

6、反映柱效，又叫理論塔板數(shù),計(jì)算公式如下：NS4等如是組分的保留時間，Wh是該物質(zhì)的半高峰寬色譜柱類型、柱溫、流動相以及化合物類型都會影響理論塔板數(shù)的值滯后體積D：也叫梯度延遲體積，指從流動相混合點(diǎn)至柱頭的系統(tǒng)體積，可用以下方法計(jì)算：色譜柱:用適當(dāng)?shù)拿?xì)管（如lmX0.12mm）代替流動相：A相是水，B相是0.1%（V/V）的丙酮水時間minA相體積百分比B相體積百分比0-20100-00-10020-300100流速F：能達(dá)到足夠的反壓為準(zhǔn)（如2ml/min）檢測器：檢測波長265nm記錄吸光度到達(dá)最大值的50%時的時間tos（圖2.2.45-4）/(05TimeFigure2.2.46.4D

7、豈XF切丸亍怙，to預(yù)設(shè)為20minF為流速，單位為ml/min對稱因子A色譜峰的對稱因子（圖2.2.46-5）按卞式計(jì)算W0.05表示在二十分之一峰高處峰寬d表示二十分之一峰高處到峰頂點(diǎn)投射到水平線之間的距離兀值為1表示峰絕對對稱，人于1則為拖尾峰，小于1則為前置峰分離度&兩組分之間的分離度（12.46-1）計(jì)算公式如下R5=1.18切2切1whlrh2tR2tRl如1和tR2是色譜峰的保留時間Whi和Wfa2是半高峰寬在定量平面色譜中，用移動距離代替保留時間來計(jì)算兩組分之間的分離度，計(jì)算公式如下：=1.183Wh1+Wh2Rfi和Rk是色譜峰的阻滯因子Will和Wh2是半高峰寬a是溶劑前沿

8、到基線的距離峰谷比(p/v)做有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)適應(yīng)性測試時，如果兩峰之間的基線分離效果不好，可以用峰谷比作為評價(jià)依據(jù)(圖2.2.46-6)oHp表示基線以上最小峰的最高點(diǎn)到基線的距離Hr表示基線以上最小峰和主峰之間的最低點(diǎn)到基線的距離相對保留因子r相對保留因子的計(jì)算公式如卞：tRst+tM阮表示待測峰的保留時間氐七表示參照峰的保留時間切表示滯留時間未調(diào)整相對保留因子2計(jì)算公式如下:除非另有規(guī)定，相對保留因子和未調(diào)整的相對保留因子的值基本一致在平面色譜中,用滯留因子Rfh和R/代替保留時間和上比信噪比(S/N)小的噪音峰會影響定量分析的精密度。信噪比計(jì)算公式如下：S/N=ftH表示組分的峰高，在參

9、比溶液的色譜圖中,測量從信號峰的最高點(diǎn)到基線之間的距離。該信號峰的峰寬至少人于半高峰寬的5倍(圖2.2.46-7)oh表示色譜圖中噪音峰的最高點(diǎn)到最低點(diǎn)之間的距離系統(tǒng)重現(xiàn)性系統(tǒng)重復(fù)性表示至少連續(xù)進(jìn)樣三次后，所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：；(%)琴國至y7n-lyi表示內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)方法中的峰面積、峰高或者面積比的值y表示平均值n表示值的個數(shù)系統(tǒng)適應(yīng)性用于測試的成分應(yīng)該明確，能滿足系統(tǒng)性能和含量測定的要求。系統(tǒng)適應(yīng)性測試反映了色譜系統(tǒng)的性能，是建立分析方法不可或缺的一部分。柱效、保留因子、分離度、相對保留因子和對稱因子等參數(shù)用來描述柱子的性能。這些參數(shù)可能從以下方面影響色譜行為：流動相的組成

10、、離子強(qiáng)度、溫度和pH值流速、色譜柱尺寸、柱溫和柱壓固定相特性，包扌舌填充劑類型、填充劑粒徑、孔徑、比表面積反相材料類型或者對固定相表面進(jìn)行其它的結(jié)構(gòu)修飾除非另有規(guī)定，還需滿足以卞要求：在相關(guān)物質(zhì)測定或含量測定中，用于定量的參照色譜峰，其對稱因子取值范鬧必須在0.8到1.5之間如果某成分的純度為100%,則可容許的參比溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最人值計(jì)算公式如下：片（）nux.翎匸90%n-1K是常數(shù)0.349,由公式咅乂畔計(jì)算而來，捋表示當(dāng)B=1.0時，六次進(jìn)樣后的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分?jǐn)?shù)B表示方法中規(guī)定的含量上限減去100%n表示進(jìn)樣次數(shù)（3n6）*1表示雙側(cè)檢驗(yàn)、置信度為90%、自由度為n-1時的t值

11、除非另有規(guī)定，可允許的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值不能超過卞表（表2.2.46-1）的值，此規(guī)定不適用于有關(guān)物質(zhì)測試。表2.2.46-1重復(fù)性要求進(jìn)樣次數(shù)3456B(%)最人容許標(biāo)準(zhǔn)偏差2.00.410.590.730.852.50.520.310921.063.00.620.891.101.27測試有關(guān)物質(zhì)時，定量限度與此表相等或小于表中數(shù)值測試員要根據(jù)一些致變因素來選擇合適的方案驗(yàn)證色譜系統(tǒng)，以保證在測試過程中色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性不受影響。色譜條件的調(diào)整為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性，在不對分析方法做根本改變的情況下，可對色譜參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。在梯度洗脫時，改變洗脫條件會導(dǎo)致基線漂移，不利于色譜峰的劃分識別，甚至?xí)霈F(xiàn)

12、假峰和延長洗脫時間。因此要改變梯度洗脫的條件時，需重新驗(yàn)證方法的有效性。系統(tǒng)適應(yīng)性是定性分析或含量測定結(jié)果的有效保障。市售液相色譜柱的固定相材料類型多樣，可滿足不同色譜行為需要，為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，可對色譜條件做適當(dāng)調(diào)整。但是在反相色譜系統(tǒng)中，調(diào)整色譜參數(shù)不能總是達(dá)到既定要求，這時可選擇替換色譜柱。網(wǎng)站EDQM上有各種柱子的性能信息，可根據(jù)分析需要選擇合適的色譜柱。一般文件會明確規(guī)定一些重要參數(shù)以滿足系統(tǒng)適應(yīng)性。薄層色譜和紙色譜展開劑的組成：對其中較少的組分，調(diào)整范I制為相對差值30%或絕對差值2%,可選其中較大的一種，但任何組分的絕對差值不得超過10%。例如含量為10%的組分，按相對差值3

13、0%計(jì)算其可調(diào)范I韋I在按絕對差值2%計(jì)算可調(diào)范|制在8%-12%,固可按相對差值計(jì)算的范I制來調(diào)整。假如一組分含量為5%,按相對差值計(jì)算其可調(diào)范I制在35-6.5%,按絕對差值計(jì)算其可調(diào)范閑在3-7%,此時可按絕對差值范I制調(diào)整，但是改變范圍絕對不能超過10%。除非另有規(guī)定，流動相水相pH值可調(diào)范I制在0.2個單位，非離子溶劑可調(diào)范圍在1個單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調(diào)范I制在10%。點(diǎn)樣體積：如果薄層板或?qū)游黾埖牧６攘己茫?-lOm）,點(diǎn)樣體積可為規(guī)定的10-20%液相色譜：等度洗脫流動相組成：對其中較少的組分，調(diào)整范閑為相對差值30%或絕對差值2%,可選其中較人的一種，但任何組分的絕對差值

14、不得超過土10%。除非另有規(guī)定，流動相水相pH值可調(diào)范|韋|在0.2個單位，非離子溶劑可調(diào)范圍在1個單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調(diào)范I制在10%。流速：一般可在50%范圍內(nèi)調(diào)整，如果改用人尺寸的柱子，調(diào)整范圍可適當(dāng)加大。色譜柱參數(shù)固定相：不能改變固定相填料類型（例如不能用C8柱替換C18柱）粒徑：最多可將粒徑減小到原來的50%,但是不能增加填料粒徑色譜柱尺寸：長度：可調(diào)范圍50%內(nèi)徑：可調(diào)范圍25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以下公式做適當(dāng)調(diào)整：F：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/min11：方法中規(guī)定的柱長，單位mmb：改變后的柱長，單位mmdi：方法中規(guī)定的

15、柱內(nèi)徑，單位mmd3：改變后的柱內(nèi)徑，單位mm柱溫：10C,除非另有說明，操作時的柱溫需明確規(guī)定檢測波長：不能改變進(jìn)樣體枳：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況下可減少進(jìn)樣體積，但不能增加進(jìn)樣體枳液相色譜：梯度洗脫梯度洗脫不像等度洗脫，要改變洗脫條件的話需要慎重考慮流動相：只有在滿足卞列條件時才可對流動相組成做微小調(diào)整：滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求主峰的洗脫時間改變范闈不超過方法中規(guī)定的15%改變后的流動相洗脫能力不能比方法中規(guī)定的差如果改變條件不能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，則需考慮滯留體積和換色譜柱滯留體枳：實(shí)驗(yàn)儀器的布局能顯著改變分離度、保留時間和相對保留時間等。如有此情況，可能是滯留體積過人。在開始梯度洗脫程序之

16、前，會有一段等度洗脫過程?？紤]到規(guī)定的方法與實(shí)際使用方法中的滯留體積有差異，可在等度洗脫時調(diào)整開始梯度洗脫的時間。測試員有責(zé)任使等度洗脫時間適應(yīng)所用的分析儀器。如果方法中規(guī)定了滯留體積，梯度洗脫的開始時間可根據(jù)卜面公式換成實(shí)際開始時間：D：滯留體積，單位mlDo：實(shí)際滯留體積，單位mlF：流速，單位ml/min如果沒有等度洗脫這個步驟也不影響數(shù)據(jù)的有效性，那么此步驟可以省略流動相pH,不能改變緩沖液鹽濃度：不能改變流速：色譜柱尺寸改變時可改變流速（公式見前面）色譜柱參數(shù)固定相：不能改變填料類型不能改變粒徑大小色譜柱尺寸：長度：可調(diào)范圍70%內(nèi)徑：可調(diào)范圍25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以下

17、公式做適當(dāng)調(diào)整：Fi：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/min11：方法中規(guī)定的柱長，單位mm4：改變后的柱長，單位mm山：方法中規(guī)定的柱內(nèi)徑，單位mmd2：改變后的柱內(nèi)徑，單位mm柱溫：5C,除非另有說明，操作時的柱溫需明確規(guī)定檢測波長：不能改變進(jìn)樣體積：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況卞可減少進(jìn)樣體積，但不能增加進(jìn)樣體積氣相色譜色譜柱參數(shù)固定相：粒徑：（填充柱）最多可減少50%,不能增大粒徑尺寸薄膜厚度：（毛細(xì)管柱）可調(diào)范I制從-50%到+100%色譜柱尺寸：長度：可調(diào)范圍70%內(nèi)徑：可調(diào)范圍50%流速：50%柱溫：10%進(jìn)樣體積和分流體積：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情

18、況下可做適當(dāng)調(diào)整超臨界流體色譜流動相組成：填充色譜中，對其中較少的組分，調(diào)整范闈為相對差值30%或絕對差值2%,可選其中較大的一種，但是毛細(xì)管色譜系統(tǒng)不能調(diào)整流動相。色譜柱參數(shù)固定相：粒徑：（填充柱）最多可減少50%,不能增大粒徑尺寸色譜柱尺寸：長度：可調(diào)范圍70%內(nèi)徑：可調(diào)范圍525%（填充柱）可調(diào)范圍50%（毛細(xì)管柱）流速：一般可在50%范圍內(nèi)調(diào)整柱溫：5C,除非另有說明，操作時的柱溫需明確規(guī)定進(jìn)樣體枳：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況F可減少進(jìn)樣體積，但不能增加進(jìn)樣體枳定量分析定量分析中，流動相中各溶劑或者試劑產(chǎn)生的色譜峰可以忽略。檢測器靈敏度。檢測器靈敏度是指單位濃度或質(zhì)量的物質(zhì)在檢測器上的信號輸出。相對檢測響應(yīng)因子，一般叫響應(yīng)因子，表示某組分與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對響應(yīng)因子之比，也稱作校正因子外標(biāo)法。通過比較待測物質(zhì)和參考物質(zhì)的色譜峰面積來計(jì)算待測物濃度內(nèi)標(biāo)法。將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加到分析樣品混合物和參照物中的分析方法。內(nèi)標(biāo)物的選擇要符合一些要求：不與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，性質(zhì)穩(wěn)定，能與其它雜質(zhì)有效分離，該物質(zhì)色譜峰不會與雜質(zhì)或待測物質(zhì)色譜峰重合。通過比較測試液中待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積/峰高比和參比液中待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積/峰高比來計(jì)算待測物濃度標(biāo)準(zhǔn)化程序。某物質(zhì)的百分含量為該峰的峰面積占所有峰的峰面積的比例，計(jì)算時應(yīng)排除溶劑峰