歐洲藥典系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試

1、105Volufne(V2.2.46色譜分離技術(shù)色譜分離技術(shù)是一種多級(jí)分離方法，樣品在固定相和流動(dòng)相之間多次分配，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。固定相一般是附在硅膠或者其它固體載體上的固體或液體，可填充在層析柱上或鋪在薄層版/薄膜上，流動(dòng)相町以是氣體、液體或者超臨界流體。分離原理包括吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等，也可根據(jù)樣品分子的人小、空間體積、質(zhì)量等物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)分離。本章介紹了系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試涉及的參數(shù)定義及計(jì)算方法，分析方法和儀器介紹等已分別在以下章節(jié)做了介紹：紙色譜12.26薄層色譜2.2.27氣相色譜2.2.28液相色譜2.2.29排阻色譜2.2.30超臨界流體色譜12.45該方法

2、做適當(dāng)調(diào)整以符合藥典規(guī)定。色譜圖反應(yīng)檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)、洗脫劑濃度或體積與時(shí)間的關(guān)系等。理想的色譜圖是在平穩(wěn)的基線上各色譜峰彼此分離，呈高斯分布。色譜峰色譜柱中洗脫的單個(gè)組分或者未分離的多個(gè)組分在檢測(cè)器上的響應(yīng)信號(hào)，是色譜圖的一部分。一般用峰面積、峰高h(yuǎn)和半高峰寬Wh、峰高h(yuǎn)和峰寬旳等參數(shù)來(lái)描述色譜峰。高斯峰有如卜關(guān)系（圖2.2.46-1）：Wfl.lSw】保留時(shí)間tR組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人峰所需時(shí)河保留體積Vr組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人峰所需的流動(dòng)相體積，可用保留時(shí)間乘以流速F。Vr=IrXF死時(shí)間切不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人105Volufne(V105Volufne(VPeak1Pea

3、k2VolumeV)Time(f)105Volufne(V105Volufne(VFigure2.2.46.-1.105Volufne(V定義下面分別介紹系統(tǒng)適應(yīng)性和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)參數(shù)定義。有些儀器的軟件系統(tǒng)包含了一些特定參數(shù)的計(jì)算方法（例如性噪比、分離度）。操作人員有責(zé)任確認(rèn)該計(jì)算方法是否符合歐洲藥典要求，如果有差別，應(yīng)對(duì)峰所需時(shí)間死體積VM不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最人峰所需流動(dòng)相體積。VM=twXF排阻色譜中用V。表示（見(jiàn)下面）。保留因子k有時(shí)用容量因子0或者分配比Dm表示，計(jì)算公式如下：_固定相中的組分就士心一一流動(dòng)相中的組分奩鳳表示分配常數(shù)，也叫平衡分配系數(shù)V,表示固定相體積

4、Vm表示流動(dòng)相體積在色譜系統(tǒng)中某組分的保留因子也可按F式計(jì)算：K%_切加流動(dòng)相總時(shí)間tt,當(dāng)組分粒徑小于固定相膠體孔徑的最小尺寸時(shí)，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需時(shí)間(圖2.2.46-2)流動(dòng)相總體積vt,當(dāng)組分粒徑小于固定相膠體孔徑的最小尺寸時(shí)，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需流動(dòng)相體積，可按下式計(jì)算Vt=UXF滯留時(shí)間to：當(dāng)組分粒徑人于固定相膠體孔徑的最人尺寸時(shí)，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需時(shí)間滯留體積Vo：當(dāng)組分粒徑人于固定相膠體孔徑的最人尺寸時(shí)，該組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需體積，可按下式計(jì)算Vo=toXFKo%trt0分配常數(shù)ko：表示排阻色譜中某一組分的洗脫能力，也叫分配系數(shù)，可用下式計(jì)

5、算：105Volufne(V105Volufne(VLGandGC105Volufne(V105Volufne(VSize-exclusionchromatography105Volufne(V105Volufne(VSSEE00202WO5L111Time(f)Figure2.246.-2.1XJ%50-滯留因子rf：在平面色譜中也叫保留因子Rr，表示組分在板上的點(diǎn)到原點(diǎn)之間的距離與溶劑前沿到原點(diǎn)的距離的比值（圖2.2.46-3）oA.mobilephacfrontB.spotC.lineofapplicationFigure2246.3B是分析物的移動(dòng)距離A是溶劑前沿的移動(dòng)距離塔板數(shù)N：可

6、反映柱效，又叫理論塔板數(shù),計(jì)算公式如下：NS4等如是組分的保留時(shí)間，Wh是該物質(zhì)的半高峰寬色譜柱類(lèi)型、柱溫、流動(dòng)相以及化合物類(lèi)型都會(huì)影響理論塔板數(shù)的值滯后體積D：也叫梯度延遲體積，指從流動(dòng)相混合點(diǎn)至柱頭的系統(tǒng)體積，可用以下方法計(jì)算：色譜柱:用適當(dāng)?shù)拿?xì)管（如lmX0.12mm）代替流動(dòng)相：A相是水，B相是0.1%（V/V）的丙酮水時(shí)間minA相體積百分比B相體積百分比0-20100-00-10020-300100流速F：能達(dá)到足夠的反壓為準(zhǔn)（如2ml/min）檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)265nm記錄吸光度到達(dá)最大值的50%時(shí)的時(shí)間tos（圖2.2.45-4）/(05TimeFigure2.2.46.4D

7、豈XF切丸亍怙，to預(yù)設(shè)為20minF為流速，單位為ml/min對(duì)稱因子A色譜峰的對(duì)稱因子（圖2.2.46-5）按卞式計(jì)算W0.05表示在二十分之一峰高處峰寬d表示二十分之一峰高處到峰頂點(diǎn)投射到水平線之間的距離兀值為1表示峰絕對(duì)對(duì)稱，人于1則為拖尾峰，小于1則為前置峰分離度&兩組分之間的分離度（12.46-1）計(jì)算公式如下R5=1.18切2切1whlrh2tR2tRl如1和tR2是色譜峰的保留時(shí)間Whi和Wfa2是半高峰寬在定量平面色譜中，用移動(dòng)距離代替保留時(shí)間來(lái)計(jì)算兩組分之間的分離度，計(jì)算公式如下：=1.183Wh1+Wh2Rfi和Rk是色譜峰的阻滯因子Will和Wh2是半高峰寬a是溶劑前沿

8、到基線的距離峰谷比(p/v)做有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試時(shí)，如果兩峰之間的基線分離效果不好，可以用峰谷比作為評(píng)價(jià)依據(jù)(圖2.2.46-6)oHp表示基線以上最小峰的最高點(diǎn)到基線的距離Hr表示基線以上最小峰和主峰之間的最低點(diǎn)到基線的距離相對(duì)保留因子r相對(duì)保留因子的計(jì)算公式如卞：tRst+tM阮表示待測(cè)峰的保留時(shí)間氐七表示參照峰的保留時(shí)間切表示滯留時(shí)間未調(diào)整相對(duì)保留因子2計(jì)算公式如下:除非另有規(guī)定，相對(duì)保留因子和未調(diào)整的相對(duì)保留因子的值基本一致在平面色譜中,用滯留因子Rfh和R/代替保留時(shí)間和上比信噪比(S/N)小的噪音峰會(huì)影響定量分析的精密度。信噪比計(jì)算公式如下：S/N=ftH表示組分的峰高，在參

9、比溶液的色譜圖中,測(cè)量從信號(hào)峰的最高點(diǎn)到基線之間的距離。該信號(hào)峰的峰寬至少人于半高峰寬的5倍(圖2.2.46-7)oh表示色譜圖中噪音峰的最高點(diǎn)到最低點(diǎn)之間的距離系統(tǒng)重現(xiàn)性系統(tǒng)重復(fù)性表示至少連續(xù)進(jìn)樣三次后，所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：；(%)琴國(guó)至y7n-lyi表示內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)方法中的峰面積、峰高或者面積比的值y表示平均值n表示值的個(gè)數(shù)系統(tǒng)適應(yīng)性用于測(cè)試的成分應(yīng)該明確，能滿足系統(tǒng)性能和含量測(cè)定的要求。系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試反映了色譜系統(tǒng)的性能，是建立分析方法不可或缺的一部分。柱效、保留因子、分離度、相對(duì)保留因子和對(duì)稱因子等參數(shù)用來(lái)描述柱子的性能。這些參數(shù)可能從以下方面影響色譜行為：流動(dòng)相的組成

10、、離子強(qiáng)度、溫度和pH值流速、色譜柱尺寸、柱溫和柱壓固定相特性，包扌舌填充劑類(lèi)型、填充劑粒徑、孔徑、比表面積反相材料類(lèi)型或者對(duì)固定相表面進(jìn)行其它的結(jié)構(gòu)修飾除非另有規(guī)定，還需滿足以卞要求：在相關(guān)物質(zhì)測(cè)定或含量測(cè)定中，用于定量的參照色譜峰，其對(duì)稱因子取值范鬧必須在0.8到1.5之間如果某成分的純度為100%,則可容許的參比溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最人值計(jì)算公式如下：片（）nux.翎匸90%n-1K是常數(shù)0.349,由公式咅乂畔計(jì)算而來(lái)，捋表示當(dāng)B=1.0時(shí)，六次進(jìn)樣后的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差百分?jǐn)?shù)B表示方法中規(guī)定的含量上限減去100%n表示進(jìn)樣次數(shù)（3n6）*1表示雙側(cè)檢驗(yàn)、置信度為90%、自由度為n-1時(shí)的t值

11、除非另有規(guī)定，可允許的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值不能超過(guò)卞表（表2.2.46-1）的值，此規(guī)定不適用于有關(guān)物質(zhì)測(cè)試。表2.2.46-1重復(fù)性要求進(jìn)樣次數(shù)3456B(%)最人容許標(biāo)準(zhǔn)偏差2.00.410.590.730.852.50.520.310921.063.00.620.891.101.27測(cè)試有關(guān)物質(zhì)時(shí)，定量限度與此表相等或小于表中數(shù)值測(cè)試員要根據(jù)一些致變因素來(lái)選擇合適的方案驗(yàn)證色譜系統(tǒng)，以保證在測(cè)試過(guò)程中色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性不受影響。色譜條件的調(diào)整為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性，在不對(duì)分析方法做根本改變的情況下，可對(duì)色譜參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。在梯度洗脫時(shí)，改變洗脫條件會(huì)導(dǎo)致基線漂移，不利于色譜峰的劃分識(shí)別，甚至?xí)霈F(xiàn)

12、假峰和延長(zhǎng)洗脫時(shí)間。因此要改變梯度洗脫的條件時(shí)，需重新驗(yàn)證方法的有效性。系統(tǒng)適應(yīng)性是定性分析或含量測(cè)定結(jié)果的有效保障。市售液相色譜柱的固定相材料類(lèi)型多樣，可滿足不同色譜行為需要，為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，可對(duì)色譜條件做適當(dāng)調(diào)整。但是在反相色譜系統(tǒng)中，調(diào)整色譜參數(shù)不能總是達(dá)到既定要求，這時(shí)可選擇替換色譜柱。網(wǎng)站EDQM上有各種柱子的性能信息，可根據(jù)分析需要選擇合適的色譜柱。一般文件會(huì)明確規(guī)定一些重要參數(shù)以滿足系統(tǒng)適應(yīng)性。薄層色譜和紙色譜展開(kāi)劑的組成：對(duì)其中較少的組分，調(diào)整范I制為相對(duì)差值30%或絕對(duì)差值2%,可選其中較大的一種，但任何組分的絕對(duì)差值不得超過(guò)10%。例如含量為10%的組分，按相對(duì)差值3

13、0%計(jì)算其可調(diào)范I韋I在按絕對(duì)差值2%計(jì)算可調(diào)范|制在8%-12%,固可按相對(duì)差值計(jì)算的范I制來(lái)調(diào)整。假如一組分含量為5%,按相對(duì)差值計(jì)算其可調(diào)范I制在35-6.5%,按絕對(duì)差值計(jì)算其可調(diào)范閑在3-7%,此時(shí)可按絕對(duì)差值范I制調(diào)整，但是改變范圍絕對(duì)不能超過(guò)10%。除非另有規(guī)定，流動(dòng)相水相pH值可調(diào)范I制在0.2個(gè)單位，非離子溶劑可調(diào)范圍在1個(gè)單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調(diào)范I制在10%。點(diǎn)樣體積：如果薄層板或?qū)游黾埖牧６攘己茫?-lOm）,點(diǎn)樣體積可為規(guī)定的10-20%液相色譜：等度洗脫流動(dòng)相組成：對(duì)其中較少的組分，調(diào)整范閑為相對(duì)差值30%或絕對(duì)差值2%,可選其中較人的一種，但任何組分的絕對(duì)差值

14、不得超過(guò)土10%。除非另有規(guī)定，流動(dòng)相水相pH值可調(diào)范|韋|在0.2個(gè)單位，非離子溶劑可調(diào)范圍在1個(gè)單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調(diào)范I制在10%。流速：一般可在50%范圍內(nèi)調(diào)整，如果改用人尺寸的柱子，調(diào)整范圍可適當(dāng)加大。色譜柱參數(shù)固定相：不能改變固定相填料類(lèi)型（例如不能用C8柱替換C18柱）粒徑：最多可將粒徑減小到原來(lái)的50%,但是不能增加填料粒徑色譜柱尺寸：長(zhǎng)度：可調(diào)范圍50%內(nèi)徑：可調(diào)范圍25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以下公式做適當(dāng)調(diào)整：F：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/min11：方法中規(guī)定的柱長(zhǎng)，單位mmb：改變后的柱長(zhǎng)，單位mmdi：方法中規(guī)定的

15、柱內(nèi)徑，單位mmd3：改變后的柱內(nèi)徑，單位mm柱溫：10C,除非另有說(shuō)明，操作時(shí)的柱溫需明確規(guī)定檢測(cè)波長(zhǎng)：不能改變進(jìn)樣體枳：在滿足檢測(cè)限和重現(xiàn)性的情況下可減少進(jìn)樣體積，但不能增加進(jìn)樣體枳液相色譜：梯度洗脫梯度洗脫不像等度洗脫，要改變洗脫條件的話需要慎重考慮流動(dòng)相：只有在滿足卞列條件時(shí)才可對(duì)流動(dòng)相組成做微小調(diào)整：滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求主峰的洗脫時(shí)間改變范闈不超過(guò)方法中規(guī)定的15%改變后的流動(dòng)相洗脫能力不能比方法中規(guī)定的差如果改變條件不能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，則需考慮滯留體積和換色譜柱滯留體枳：實(shí)驗(yàn)儀器的布局能顯著改變分離度、保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間等。如有此情況，可能是滯留體積過(guò)人。在開(kāi)始梯度洗脫程序之

16、前，會(huì)有一段等度洗脫過(guò)程?？紤]到規(guī)定的方法與實(shí)際使用方法中的滯留體積有差異，可在等度洗脫時(shí)調(diào)整開(kāi)始梯度洗脫的時(shí)間。測(cè)試員有責(zé)任使等度洗脫時(shí)間適應(yīng)所用的分析儀器。如果方法中規(guī)定了滯留體積，梯度洗脫的開(kāi)始時(shí)間可根據(jù)卜面公式換成實(shí)際開(kāi)始時(shí)間：D：滯留體積，單位mlDo：實(shí)際滯留體積，單位mlF：流速，單位ml/min如果沒(méi)有等度洗脫這個(gè)步驟也不影響數(shù)據(jù)的有效性，那么此步驟可以省略流動(dòng)相pH,不能改變緩沖液鹽濃度：不能改變流速：色譜柱尺寸改變時(shí)可改變流速（公式見(jiàn)前面）色譜柱參數(shù)固定相：不能改變填料類(lèi)型不能改變粒徑大小色譜柱尺寸：長(zhǎng)度：可調(diào)范圍70%內(nèi)徑：可調(diào)范圍25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以下

17、公式做適當(dāng)調(diào)整：Fi：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/min11：方法中規(guī)定的柱長(zhǎng)，單位mm4：改變后的柱長(zhǎng)，單位mm山：方法中規(guī)定的柱內(nèi)徑，單位mmd2：改變后的柱內(nèi)徑，單位mm柱溫：5C,除非另有說(shuō)明，操作時(shí)的柱溫需明確規(guī)定檢測(cè)波長(zhǎng)：不能改變進(jìn)樣體積：在滿足檢測(cè)限和重現(xiàn)性的情況卞可減少進(jìn)樣體積，但不能增加進(jìn)樣體積氣相色譜色譜柱參數(shù)固定相：粒徑：（填充柱）最多可減少50%,不能增大粒徑尺寸薄膜厚度：（毛細(xì)管柱）可調(diào)范I制從-50%到+100%色譜柱尺寸：長(zhǎng)度：可調(diào)范圍70%內(nèi)徑：可調(diào)范圍50%流速：50%柱溫：10%進(jìn)樣體積和分流體積：在滿足檢測(cè)限和重現(xiàn)性的情

18、況下可做適當(dāng)調(diào)整超臨界流體色譜流動(dòng)相組成：填充色譜中，對(duì)其中較少的組分，調(diào)整范闈為相對(duì)差值30%或絕對(duì)差值2%,可選其中較大的一種，但是毛細(xì)管色譜系統(tǒng)不能調(diào)整流動(dòng)相。色譜柱參數(shù)固定相：粒徑：（填充柱）最多可減少50%,不能增大粒徑尺寸色譜柱尺寸：長(zhǎng)度：可調(diào)范圍70%內(nèi)徑：可調(diào)范圍525%（填充柱）可調(diào)范圍50%（毛細(xì)管柱）流速：一般可在50%范圍內(nèi)調(diào)整柱溫：5C,除非另有說(shuō)明，操作時(shí)的柱溫需明確規(guī)定進(jìn)樣體枳：在滿足檢測(cè)限和重現(xiàn)性的情況F可減少進(jìn)樣體積，但不能增加進(jìn)樣體枳定量分析定量分析中，流動(dòng)相中各溶劑或者試劑產(chǎn)生的色譜峰可以忽略。檢測(cè)器靈敏度。檢測(cè)器靈敏度是指單位濃度或質(zhì)量的物質(zhì)在檢測(cè)器上的信號(hào)輸出。相對(duì)檢測(cè)響應(yīng)因子，一般叫響應(yīng)因子，表示某組分與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)響應(yīng)因子之比，也稱作校正因子外標(biāo)法。通過(guò)比較待測(cè)物質(zhì)和參考物質(zhì)的色譜峰面積來(lái)計(jì)算待測(cè)物濃度內(nèi)標(biāo)法。將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加到分析樣品混合物和參照物中的分析方法。內(nèi)標(biāo)物的選擇要符合一些要求：不與待測(cè)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，性質(zhì)穩(wěn)定，能與其它雜質(zhì)有效分離，該物質(zhì)色譜峰不會(huì)與雜質(zhì)或待測(cè)物質(zhì)色譜峰重合。通過(guò)比較測(cè)試液中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積/峰高比和參比液中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積/峰高比來(lái)計(jì)算待測(cè)物濃度標(biāo)準(zhǔn)化程序。某物質(zhì)的百分含量為該峰的峰面積占所有峰的峰面積的比例，計(jì)算時(shí)應(yīng)排除溶劑峰