定性分析用高效液相色譜法確定未知樣中的成分課件

1、10.用高效液相色譜法確定未知樣中的成分 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1學(xué)習(xí)高效液相色譜儀的基本操作方法； 2學(xué)習(xí)用高效液相色譜法確定未知樣中的組分，掌握采用高效液相色譜法對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。 二 實(shí)驗(yàn)原理： 液相色譜法就是同一時刻進(jìn)入色譜柱中的各組分，由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用的不同，隨流動相在色譜柱中運(yùn)行時，在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次（103106次）地分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小差別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進(jìn)而各組分在色譜柱中的移動速度就不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱后，彼此分離開來：在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度取決于它們在固定相和流動相中的分配系

2、數(shù)K： K=（組分在固定相中的濃度）/（組分在流動相中的濃度） 顯然，K值越大，組分在固定相上的停留時間越長，容易理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時，K值越大停留的時間也越長，K值越小，停留的時間也越短，當(dāng)組分在固定相的K不同，就會出現(xiàn)差速遷移，從而達(dá)到分離的目的。 一般情況下，當(dāng)外界條件及方法確定，溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時間不一致，在檢測器上得到響應(yīng)，表現(xiàn)為出峰時間不一致，同一組分（K值固定），保留時間To一致，根據(jù)這個特性，可以分離不同的有機(jī)化合物。當(dāng)外界條件及方法確定測量各峰的峰面積A，即可作為定量測定的參數(shù)，采用工作曲線法（即外標(biāo)法）測定相應(yīng)組分的含量。液相色譜儀工作原理

3、圖三 儀器和試劑： 1高效液相色譜儀，VWD（254nm）檢測儀。 2色譜柱：C18 3超聲波發(fā)生器或水泵(用于過濾或排氣) 4注射器：50微升 5流動相： 80%甲醇+20%的水，制備前，先調(diào)節(jié)水(用酸或緩沖鹽)的PH=3.5，進(jìn)入系統(tǒng)色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。6未知樣品（含有苯，甲苯），10毫升7 苯，甲苯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各50毫升 8. 0.45m的慮膜。四 實(shí)驗(yàn)步驟： 1流動相的準(zhǔn)備： 80%甲醇+20%的純水或去離子水,制備前，先調(diào)節(jié)水(用酸或緩沖鹽)PH=3.5，進(jìn)入系統(tǒng)色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。 2苯，甲苯的標(biāo)準(zhǔn)溶液：取2毫升的苯，1毫升甲苯的標(biāo)準(zhǔn)液，與已經(jīng)配置好的流

4、動相混溶，不得有分層或沉淀，脫氣后備用。 3打開儀器，啟動泵，打開檢測器，同時設(shè)定方法（設(shè)置泵的流速為4ml/min，柱溫為室溫（20度左右），停止時間為5 min，當(dāng)流動相通過色譜柱約5-10min，記錄儀上基線穩(wěn)定后，儀器自檢完畢）。4將進(jìn)樣閥放在裝載的位置上，用注射器取25微升的苯的標(biāo)準(zhǔn)溶液（比進(jìn)樣閥上的定量環(huán)多5-10微升以上?），注入進(jìn)樣閥中。 5將進(jìn)樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進(jìn)樣位，同時按進(jìn)樣按扭，工作站開始記錄并出圖11，清洗針管，待用。6待基線穩(wěn)定后，將進(jìn)樣閥放在裝載的位置上，用注射器取25微升的甲苯的標(biāo)準(zhǔn)溶液（比進(jìn)樣閥上的定量環(huán)多5-10微升以上），注入進(jìn)樣閥中。 7將進(jìn)樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進(jìn)

5、樣位，同時按進(jìn)樣按扭，工作站開始記錄并出圖12，清洗針管，待用。 8基線穩(wěn)定后，取未知樣25微升，進(jìn)樣，出色譜圖13。 五 數(shù)據(jù)分析 1在標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中標(biāo)注苯和甲苯保留時間To或保留距離Vo。 2根據(jù)的保留時間，找到并標(biāo)出未知樣色譜圖中的苯、甲苯的色譜峰。 六 問題討論 1、解釋用本實(shí)驗(yàn)中反相柱進(jìn)行定性、定量分析的理論基礎(chǔ)。2、在本實(shí)驗(yàn)中，用保留時間To來確定未知樣的組分，準(zhǔn)確嗎？為什么？3、哪些條件會影響濃度測定值的準(zhǔn)確性？4.、為什么流動相和樣品要進(jìn)行脫氣，否則會產(chǎn)生什么影響？注意:關(guān)機(jī)前，用過緩沖鹽溶液必須先用100%的水沖洗系統(tǒng)（打開排液閥，調(diào)流速為5ml/min，沖洗約5 min，然后調(diào)流速為1ml/min，待流速降下來后，關(guān)閉排液閥，再沖洗沖洗約20 min）；然后用甲醇同法清洗20min，然后關(guān)泵。注意：此方法適用于反相色譜柱，而正相色譜柱應(yīng)用適當(dāng)?shù)娜軇_洗。2、清洗進(jìn)樣器：將進(jìn)樣器扳至Load的位置，用專用的注射器裝約10ml適當(dāng)溶劑沖洗進(jìn)樣器。當(dāng)使用