第七章細胞融合與體細胞雜交課件

1、第七章 細胞融合與體細胞雜交 遠緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠緣的種內(nèi)亞種之間個體的交配。種屬間存在著隔離機制，致使遠緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠緣雜種表現(xiàn)不育。不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個體的細胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精或接合不能正常進行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。一般表現(xiàn)為生殖細胞不能融合，或受精卵不能發(fā)育，或子代無繁殖能力等。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機理之一。 第一節(jié) 細胞融合雜交斑馬：由斑馬和馬科動物雜交的產(chǎn)物。獅虎：獅子和老虎的雜交產(chǎn)物。 豹獅：美洲豹與獅子的雜交產(chǎn)物。 細胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技

2、術(shù)。對于植物也叫原生質(zhì)體融合，親本細胞是體細胞，也叫體細胞雜交（somatic cell hybridization）。Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。細胞融合研究歷史1958年日本學者岡田（Okada）發(fā)

3、現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應。1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。細胞融合的分類1.材料：原生質(zhì)體（去除了細胞壁的裸露的細胞）、動物細胞2.從基因型來看：（1）同核體：基因型相同的細胞融合成的融合細胞。（2）異核體：來自不同基因型的融合細胞。 3.從融合效果：（1）對稱融合（Symmetric fusion）：兩個完整的細胞間的融合。（2）不對稱融合（Asymmetric fusion）：利用物理或化學方

4、法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再與另外一個完整細胞進行融合。根據(jù)融合時細胞的完整程度1)對稱融合即兩個完整的細胞原生質(zhì)體融合。 2)非對稱融合利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再進行融合，它可以分為三種情況：融合細胞=A細胞核+B細胞質(zhì)融合細胞=A細胞(核+質(zhì))+B細胞質(zhì)融合細胞=A細胞(核+質(zhì))+B細胞(部分核+質(zhì)) 非對稱融合2.根據(jù)原生質(zhì)體的融合方式1）自發(fā)融合2）誘導融合1）自發(fā)融合用酶法分解細胞壁后自發(fā)的進行融合。這類融合是種內(nèi)融合，與胞間連絲有關(guān)，融合的個體一般不能進一步發(fā)育。2）誘導融合是指制備出原生質(zhì)體后，加入誘導劑或用其他方法促使兩個親本原生質(zhì)體融合，誘導融合可以是種

5、內(nèi)的，也可以是種間的，甚至是屬間、科間的融合。顯微鏡下細胞融合過程植物融合細胞成長狀態(tài)對比,左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞，右瓶為地面融合的細胞。融合的過程，原理與關(guān)鍵細胞融合的主要步驟 原生質(zhì)體靠近 形成細胞橋 胞質(zhì)滲透 細胞核融合 顯微鏡下的細胞融合過程 細胞融合的原理 細胞融合的基礎(chǔ)是細胞膜的流動性， 細胞膜磷脂分子擾動出現(xiàn)通道 細胞橋。生物膜的流動鑲嵌模型(fluid mosaic model) 融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解。關(guān)鍵：細胞核的融合 若是沒發(fā)生細胞核的融合，僅發(fā)生了細胞質(zhì)的融合，則可能成為嵌合細胞。細胞核的合并發(fā)生在有絲分裂過程中。但是這

6、種有絲分裂只有當兩個核的DNA合成基本同步時才能發(fā)生：兩個核同時進行有絲分裂，形成一個紡錘體，全部染色體都排列在一個赤道板上，結(jié)果伴隨著細胞分裂就形成了單核的子細胞，其細胞核中含有雙親細胞的染色體。 細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的生殖隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。pomato 綿

7、山羊 細胞融合的常用方法物理法：顯微操作，電場刺激等化學法：硝酸鈉誘導、PEG法，高鈣離子結(jié)合高pH法生物法：仙臺病毒法病毒法的主要步驟1.兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；2.通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；3.兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；4.進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞?；驹恚菏抢貌《揪哂心毎哪芰ι锓ǎ合膳_病毒法用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖 化學誘導融合方法NaNO3法高pH-高Ca2+法PEG誘導融合法（一）NaNO3法NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負電荷，使原生質(zhì)體不再

8、相互排斥，而緊密結(jié)合在一起。不足：誘導頻率不高。（二）高pH-高Ca2+法用pH10.5的50 mMCaCl2溶液在37時，誘發(fā)原生質(zhì)體融合。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對細胞有毒害作用。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細胞融合劑。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。 優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。（三）聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇法細胞融合過程PEG誘導融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，無需特殊設備；融合產(chǎn)生的異核率較高；融

9、合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。PEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。 （1）將兩種不同親本細胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng)液至 5ml，37的C

10、O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟PEG誘導的細胞融合過程示意圖 PEG 誘導雞血細胞體外融合 物理誘導融合方法電融合法1.電融合法原理2.電融合優(yōu)點電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。細胞膜的接觸：當原生質(zhì)體置于電導率很低的溶液中時，

11、電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。 電融合法的基本過程電融合誘導法原理示意圖穿孔 融合 排隊 融合 燕麥原生質(zhì)體的融合 第二節(jié) 植物體細胞雜交體細胞雜交 兩種異源（種、屬間）原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互接觸發(fā)生細胞融合并使之分化再生形成新品種的過程。體細胞雜交的意義實現(xiàn)遠緣雜交，形成新的物種創(chuàng)造細胞質(zhì)雜種核外遺傳系統(tǒng)培育作物新種質(zhì)和新品種植物體細胞雜交的過程1.親本選擇2.原生質(zhì)體的制備3.原

12、生質(zhì)體融合4.融合（雜種）細胞篩選（關(guān)鍵）5.細胞壁再生6.分裂形成細胞團-愈傷組織7.雜種植株的再生與鑒定雜種細胞篩選方式 1.抗藥性篩選法 2.營養(yǎng)互補篩選法 3.物理特性篩選法 4.熒光標記法1.抗藥性篩選法利用細胞對藥物敏感性的差異篩選融合細胞，教材P71。2.營養(yǎng)互補篩選法根據(jù)雙親原生質(zhì)體對營養(yǎng)的要求不同而建立的方法。例如，Glimelius等用突變位點不同的煙草硝酸還原酶缺失培養(yǎng)基進行選擇。 突變體由于缺乏正常的硝酸還原酶而不能在該培養(yǎng)基上生長；而雜種細胞由于兩個突變體的互補作用，產(chǎn)生的體細胞雜種恢復了正常硝酸還原酶活性，因此只在有硝酸鹽的培養(yǎng)基上正常生長。3.根據(jù)物理特性篩選利用

13、細胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在倒置顯微鏡下用微管將融合細胞吸取挑選出來。形態(tài)/大小/顏色等性質(zhì) 擬南芥 薄荷 親本 雜交 親本 4.熒光標記法親本1：異硫氰酸熒光素標記-綠色親本2：異硫氰酸羅丹明標記-紅色在熒光顯微鏡下，親本1為綠色，親本2為紅色，雜種細胞存在兩種熒光標記。其它雜種細胞篩選方式突變互補篩選1）隱性突變互補篩選2）顯性抗性互補篩選3）隱性突變和野生型互補篩選4）顯-隱性雙突變體篩選1）隱性突變互補篩選親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細胞長成植株呈綠色，能正常生長。2）顯性抗性互補篩選親本1：抗5MT（5甲基色氨酸）親本2：抗S

14、氨乙基半胱氨酸雜種細胞能在含有5MT和S氨乙基半胱氨酸培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細胞死亡。六、體細胞雜種植物的鑒定1.形態(tài)鑒定 2.細胞學鑒定3.生化鑒定4.分子鑒定1.形態(tài)鑒定比較再生植株與融合親本在形態(tài)上的異同，在同一形狀上同時帶有雙親的特點，但可能雜種植物的形態(tài)傾向某一親本。2.細胞學鑒定典型情況下，雜種細胞的染色體數(shù)目為雙親數(shù)目之和。極端情況下，一個親本的染色體全部被淘汰。最常見的情況是形成非整倍體。非對稱融合的雜種細胞中,從數(shù)目上不能表現(xiàn)出來,可以采用染色體分帶技術(shù)處理。3.生化鑒定同工酶圖譜鑒定：雜種細胞圖譜有三種情況：a.雙親酶帶的總和；b. 雙親的部分酶帶；c.出現(xiàn)新的雜種帶。

15、4.DNA分子標記鑒定RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）鑒定、RAPD（隨機擴增多態(tài)性DNA）標記鑒定。即可用于對稱雜種鑒定，又可鑒定非對稱雜種。其中RAPD特別適合雜種細胞的鑒定。RAPD帶型七、體細胞雜種的遺傳特性1.細胞分裂與染色體丟失2.基因轉(zhuǎn)移與性狀表達3.體細胞雜種遺傳上的不穩(wěn)定性八、體細胞雜交面臨的困難1.融合特性的高效性。2.雜種細胞的培養(yǎng)和選擇。3.雜種的遺傳穩(wěn)定性控制九、體細胞雜交研究的發(fā)展趨勢1.誘導融合及雜種細胞的各種生理、生化、遺傳機理的研究。2.電融合的程序化控制研究3. 各種類型原生質(zhì)體（胞質(zhì)體、核質(zhì)體、細胞器）的制備技術(shù)研究。4.雜種細胞培養(yǎng)技術(shù)的程序化研究比較植物細胞雜交和動物細胞融合過程 比較項目 植物體細胞雜交 動物細胞融合（單克隆抗體制備） 原理 細胞膜的流動性、細胞的全能性 細胞膜的流動性、細胞增殖 酶解法除細胞壁 注射特定抗原免疫處理正常小鼠 融合前處理 (纖維素酶和果膠酶) 物理法：離心、振動、電刺激等 物理法、化學法與植物原生質(zhì)體融合促融方 促融方法 化學法：聚乙二醇（PEG） 法相同 生物法