免疫細(xì)胞化學(xué)多媒體(1)

1、 第六章 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（免疫組化） ( immunocytochemistry ) 是利用免疫反應(yīng)來定位組織和 細(xì)胞中特異大分子的一類技術(shù)1 第一節(jié) 免疫細(xì)胞化學(xué)原理 第二節(jié) 免疫細(xì)胞化學(xué)方法 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2 一、免疫反應(yīng)的特異性 二、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng) 三、抗原 四、抗體 五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下可見性第一節(jié) 免疫細(xì)胞化學(xué)原理3 免疫反應(yīng)的特異性表現(xiàn)在： 抗原作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子能刺激機(jī)體 產(chǎn)生對(duì)其特異的抗體并與抗體發(fā)生反應(yīng) 抗體針對(duì)某種抗原分子而產(chǎn)生的，特異地識(shí) 別該抗原并與其結(jié)合 一、免疫反應(yīng)的特異性 4 免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的原理： 把組織細(xì)胞中的特異分 子作為抗原,用在顯微

2、鏡下可 見的標(biāo)記物標(biāo)記特異抗體(或 者標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物)使特 異的免疫化學(xué)反應(yīng)具有可見 性,從而間接地顯示抗原,達(dá) 到在細(xì)胞或細(xì)胞器水平定位 特異分子的目的 二、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)5組織抗原抗體標(biāo)記物標(biāo)記抗體1 熒光2 酶3 親和技術(shù)4 金標(biāo)6抗原 免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)過程為：標(biāo)記物7間接法 直接法 兩種免疫反應(yīng)方法8 抗 原： 凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與 抗體特異結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原 抗原性： 物質(zhì)所具有的這種特性稱為抗原性 三、抗原9 細(xì)胞中具有抗原性的化學(xué)成分有： 蛋白質(zhì) 多肽 脂蛋白 多糖 脂多糖 糖蛋白 核蛋白 這些生物大分子都能用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測嗎? 從生物學(xué)功能來看都包括了哪些物質(zhì)

3、?10 酶、 受體、 抗體、 細(xì)胞外基質(zhì) 激素、 細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、病原體等具有抗原性的物質(zhì)包括： 11 四、抗體 CCFcFabNNNNCC12Fab片段 具有抗體活性，決定某種抗體 與抗原結(jié)合的能力和特異性Fc片段 決定該抗體本身作為抗原刺激 機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力和特異性 決定其本身抗原性抗體的結(jié)構(gòu)13 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中所用的抗體有兩種： 抗 血 清 多克隆抗體，是用提純的抗原 免疫動(dòng)物后從動(dòng)物血清制備得 到的 單克隆抗體 是指由單個(gè)產(chǎn)生特異抗體的 淋巴細(xì)胞分化增殖形成的 細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體14 1 免疫熒光技術(shù) 2 免疫酶技術(shù) 3 免疫親和技術(shù) 4 膠體金技術(shù)五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下的可

4、見性 標(biāo)記物 使抗體或抗原 抗體復(fù)合物在 各種顯微鏡下 可的物質(zhì)15 免疫熒光技術(shù)將 熒光素作為標(biāo)記物 使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合 物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示 抗原物質(zhì)的定位 （一） 免疫熒光技術(shù) 16 .異硫氰酸熒光素 .四乙基羅達(dá)明 .四甲基異硫氰酸羅達(dá)明 .藻紅蛋白 分子量不同 最大吸收光譜不同 最大發(fā)射光譜不同 與蛋白結(jié)合方式不同 呈現(xiàn)不同的熒光： 黃綠色熒光 橙色熒光 橙紅色熒光等 熒光素 能產(chǎn)生熒光并能作為染料的一類化合物17 熒 光： 在激發(fā)光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光并隨照射停止而消失 熒光顯微鏡： 熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如 紫

5、外光、藍(lán)紫光（有不同的波長范圍） 使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)光18 是將酶作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物得到標(biāo)記，再通過酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顯微鏡下可見的顯色物質(zhì)，間接顯示抗原物質(zhì)的定位 （二） 免疫酶技術(shù)19 1.反應(yīng)產(chǎn)物定位準(zhǔn)確，顏色對(duì)比清晰 2.反應(yīng)后標(biāo)本材料可長期保存 3.能用于電鏡觀察免疫酶技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：20酶抗原一抗二抗酶標(biāo)二抗酶抗酶抗體復(fù)合物抗酶抗體21酶標(biāo)抗體法抗酶抗體法 復(fù)合物法酶標(biāo)記的三種形式22 用交聯(lián)劑將酶與抗體聯(lián)接成酶標(biāo)抗體用于直接法和間接法 酶標(biāo)抗體法23 用酶免疫動(dòng)物獲得抗酶抗體，通過二抗的橋梁作用把抗酶抗體連接在一抗上,再加入酶及其底物，達(dá)到用酶標(biāo)記抗原抗體

6、反應(yīng)的效果 由于產(chǎn)生抗酶抗體的動(dòng)物與產(chǎn)生第一抗體的動(dòng)物是同一種屬，兩種抗體具有相同的免疫源性，所以在反應(yīng)中本來針對(duì)一抗的二抗也能與抗酶抗體結(jié)合抗酶抗體法或稱酶橋法24 先獲得抗酶抗體并將抗酶抗體與酶一起預(yù)先制成酶抗酶抗體復(fù)合物 在反應(yīng)中，由二抗的橋梁作用把復(fù)合物與一抗連接在一起 最后加入底物，從而達(dá)到用酶標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)的效果 優(yōu)點(diǎn): 1、抗體活性高 2、靈敏度高酶抗酶抗體復(fù)合物法25常用的標(biāo)記酶： 1. 辣根過氧化物酶 2.堿性磷酸酶 常用的兩種方法是： （1）過氧化物酶標(biāo)記抗體法 （2）過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAP） 一抗與

7、組織抗原特異結(jié)合 二抗又將PAP復(fù)合物與第一抗體連接在一起 然后加入HRP的天然底物H2 O2 和捕捉底物DAB 光鏡-棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物(組織抗原的定位).辣根過氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP）26 .堿性磷酸酶（Alkaline phosphotase, AKP） 堿性磷酸酶技術(shù)常用的兩種方法： (1)堿性磷酸酶標(biāo)記抗體 (2)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物法（APAAP） （Alkaline phosphotaseAntialkaline phosphotase） APAAP法的原理： 以堿性磷酸酶為標(biāo)記物,再通過與其底物的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)使抗原抗體反應(yīng)可見 常

8、用的底物是萘酚,偶聯(lián)劑是固藍(lán)、固紅等 常用于標(biāo)記的酶： 1. 辣根過氧化物酶 2.堿性磷酸酶27 利用兩種物質(zhì)高度親和力而互相結(jié)合定位特異分子 親和物質(zhì) 具有多價(jià)能力的物質(zhì)，與親和物質(zhì)有高 度親和力又能與抗體、蛋白質(zhì)及各種標(biāo) 記物(熒光素、酶、膠體金等)結(jié)合 最常用的親和物質(zhì)系統(tǒng)： 1、生物素（biotin）與親和素（avidin） 兩者結(jié)合能力為不可逆的 2、葡萄球菌A蛋白與免疫球蛋白IgG （三） 親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)28 (1) 標(biāo)記親和素生物素技術(shù) （Labeled avidin biotin, LAB） (2) 橋式親和素生物素技術(shù) （Bridged avidin biotin,BAB）

9、 (3) 親和素生物素-酶復(fù)合物技術(shù) （Avidin-biotin peroxidase complex method，ABC）1.生物素系統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)的基本方法29生物素化酶生物素化抗體親和素生物素 酶復(fù)合物生物素親和素30 生物素與抗體共價(jià)偶聯(lián)后加入與過氧化物酶（或熒光素）結(jié)合的親和素 利用生物素親和素之間的結(jié)合，間接顯示組織細(xì)胞中的抗原 標(biāo)記親和素生物素法 31 利用親和素為橋梁 連接生物素化的抗 體和生物素化的酶橋式親和素生物素法32 親和素生物素 - 酶復(fù)合物技術(shù) 親和素與生物素偶聯(lián)的過氧化物酶組合成親和素生物素酶復(fù)合物 特異性抗體（一抗）先與組織細(xì)胞中的抗原結(jié)合， 生物素化抗體（二抗

10、）再與一抗結(jié)合 復(fù)合物與生物素化抗體結(jié)合 33 葡萄球菌A蛋 (Staphylocal protein A, SPA) 是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁含有的一種蛋白 簡稱為A蛋白或蛋白A SPA能與人及多種哺乳動(dòng)物血清中IgG呈 非特異性結(jié)合又能與標(biāo)記物結(jié)合 經(jīng)標(biāo)記的SPA可代替相應(yīng)標(biāo)記的二抗2. 葡萄球菌A蛋白與IgG系統(tǒng)親和素34（四） 免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以光鏡和電鏡下都可見的膠體金作為抗體或蛋白的標(biāo)記物，間接顯示組織細(xì)胞中特異分子的技術(shù) 膠體金顆粒大小一般在5-60nm35 膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)表面帶正電荷，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)或偏堿時(shí)被吸附于金顆粒表面,形成一個(gè)蛋白層阻止了金

11、顆粒的相互接觸，使免疫金處于穩(wěn)定狀態(tài)膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的標(biāo)記:膠體金A蛋白36 1. 免疫金法 (Immunogold staining IGS) 2. 免疫金銀法 （Immunogold silver staining, IGSS) 3. 彩色免疫金銀法 （Coloured IGSS, CIGSS）免疫膠體金技術(shù)常用方法37免疫金法 一抗與抗原結(jié)合 金標(biāo)抗體或金標(biāo)A蛋作為二 抗與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合 抗原抗體反應(yīng)部位在光鏡 下呈現(xiàn)紅色，在電鏡下呈 高電子密度38 1、采用不同大小的金顆粒(通常5-20nm) 標(biāo)記不同抗體或A蛋白，達(dá)到雙重甚至多 重標(biāo)記定位多種抗原的目的 2、金顆粒便于計(jì)數(shù)，可對(duì)反

12、應(yīng)作定量分析 3、可用于透射、掃描電鏡和冷凍蝕刻標(biāo)本 可將結(jié)果與光鏡免疫金技術(shù)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照 免疫交體金體金優(yōu)點(diǎn)：39 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在原位檢測細(xì)胞中抗原 基本過程: 抗原固定 抗原與抗體結(jié)合反應(yīng) 標(biāo)記系統(tǒng)反應(yīng) 第二節(jié) 免疫細(xì)胞化學(xué)方法40 一、樣品制備 二、抗體準(zhǔn)備 三、基本實(shí)驗(yàn)過程 四、一些關(guān)鍵問題41 固定 光鏡 醛類固定,常規(guī)石蠟包埋和切片 (冷凍切片化學(xué)固定免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)) 電鏡 4多聚甲醛為首選固定劑 ( 多聚甲醛混合0.05-0.5%戊二醛 ) 包埋前技術(shù) 免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)在未經(jīng) 包埋的組織片上進(jìn)行 包埋后技術(shù) 免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)在超薄 切片上進(jìn)行 一、樣品制備42 抗體制備：

13、特異抗體主要從購買獲得 (也可自行制備特異抗血清甚至單克隆抗體) 抗體標(biāo)記:直接法 對(duì)每種一抗進(jìn)行標(biāo)記，很少用 間接法 對(duì)二抗進(jìn)行標(biāo)記 (標(biāo)記二抗使用十分普遍) 標(biāo)記抗體的方法： 1. 熒光素標(biāo)記抗體方法 2. 酶標(biāo)記抗體 3. 生物素化抗體 4. 膠體金標(biāo)記抗體或A蛋白 二、抗體準(zhǔn)備43 免疫細(xì)胞化學(xué)方法有: 直接法、間接法 間接法中有: 二抗、三抗或復(fù)合物 標(biāo)記系統(tǒng)有: 熒光素、酶、親和素 膠體金 觀察方法有: 熒光顯微鏡、普通光鏡、電鏡三、基本實(shí)驗(yàn)過程44 切片,丙酮固定，石蠟切片脫蠟復(fù)水 1%H2O2 /甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶 正常羊血清(二抗的正常血清)1:20室溫封閉 適當(dāng)稀釋一

14、抗(兔抗體)孵育 適當(dāng)稀釋二抗(羊抗體)孵育 適當(dāng)稀釋兔PAP復(fù)合物孵育 0.04%DAB+0.03%H2O2 顯色，充分水洗終止反應(yīng) 蘇木素襯染,封片 光鏡觀察棕褐色陽性反應(yīng)沉淀物 過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法（PAP法）45 80nm左右厚度超薄切片置于鎳網(wǎng)上 1-10%H2O2蝕刻 1%BSA室溫封閉 適當(dāng)稀釋一抗孵育室溫 1%BSA室溫封閉 適當(dāng)稀釋的10-20nm金標(biāo)A 含2%戊二醛/3%多聚甲醛固定 鈾、鉛染色 電鏡觀察高電子密度的金顆粒 電鏡包埋后膠體金細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)46 (一)樣品固定：抗原和結(jié)構(gòu)的保存 (二)抗體、標(biāo)記物以及方法選擇：單抗、多抗 種屬關(guān)系 (三)通透處理：蛋白酶、表面活性劑 (四)對(duì)照設(shè)定：陰性、陽性、自身對(duì)照 (五)非特異反應(yīng)的鑒別和抑制：封閉、稀釋 阻斷 四、一些關(guān)鍵問題47 第六章 重點(diǎn) 一、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理 把組織細(xì)胞中的特異分子作為抗原, 用在顯微鏡下的可見標(biāo)記物(或標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物)標(biāo)記特異抗體,使特異的免疫化學(xué)反應(yīng)具有可見性 從而間接地顯示抗原,達(dá)到在細(xì)胞或細(xì)胞器水平定位特異分子的目的48 二、簡述免疫細(xì)胞化學(xué)的直接法和間接法 直接法：組織抗原直接與標(biāo)記的特異抗體反應(yīng) 間接法：抗原與未標(biāo)記的特異抗體（一抗）反應(yīng) 一抗再作為抗原與標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)49 三、何謂標(biāo)記物，包括哪幾種？ 標(biāo)記物：