基因分離和克隆

1、關(guān)于基因分離與克隆第一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第九章 目的基因的分離和克隆第一節(jié) 目的基因的獲得第二節(jié) 獲得目的基因方法的選擇第三節(jié) 目的基因重組體的構(gòu)建第二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目的基因目的基因：特定功能的基因與相應(yīng)載體重組后能在宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA。用途：研究基因全貌和內(nèi)涵（結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控）發(fā)現(xiàn)新基因和尋找異常基因研究生物種系進(jìn)化的同源性重組表達(dá)，研制基因藥物基因改造來(lái)改變物種基因治療第三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 目的基因的獲得一、基因的化學(xué)合成法二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 方法

2、擴(kuò)增目的基因三、建立基因組DNA文庫(kù)四、構(gòu)建cDNA文庫(kù)篩選目的基因五、其他方法第五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原核生物 ： 基因組小，限制性核酸內(nèi)切酶切成若干片段后，可以用帶有標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交篩選，人或哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞：基因組龐大，采用DNA重組技術(shù)把某種生物細(xì)胞的所有基因分區(qū)組裝到載體（質(zhì)?；蚴删w）上，并隨載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行克隆培養(yǎng)和保存這種克隆群體，這種通過(guò)重組、克隆方法保存在宿主細(xì)胞（大腸桿菌）中的各種重組DNA分子的集合體叫做DNA文庫(kù),簡(jiǎn)稱(chēng)文庫(kù)（Library）。第六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、基因的化學(xué)合成法 隨著寡核苷酸化學(xué)合成的自動(dòng)化

3、，基因的化學(xué)合成變得更經(jīng)濟(jì)、容易和準(zhǔn)確。 前提條件：對(duì)基因的結(jié)構(gòu)序列清楚 。 分為：基因片段的全化學(xué)合成 基因的化學(xué)-酶促合成第七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.化學(xué)合成法的基本策略（1）全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種策略。小片段粘接法： 混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15個(gè)堿基的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 第八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月補(bǔ)丁延長(zhǎng)法： 混合退火根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈的全序列，分別合成12-15個(gè)堿基的單鏈DNA小片段以及20-30個(gè)堿基的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連

4、接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合第九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大片段酶促法： 混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50個(gè)堿基的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合第十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月上述三種方法各有利弊： 化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高； 在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低。例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為95%，則合成50個(gè)堿基的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%。第十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作

5、于2022年6月（2）探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知。此時(shí)需要從已知的氨基酸序列推測(cè)其DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥(niǎo)槍法或cDNA法得到的基因文庫(kù)，最終獲得含有目的基因的重組子。 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡(jiǎn)并密碼子，故在探針序列的設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮下列問(wèn)題：生物體對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的偏愛(ài)性，合成系列探針。探針應(yīng)具有足夠的長(zhǎng)度，通常在17-20個(gè)核苷酸之間。探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域。第十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月某段連續(xù)的氨基酸序列所有可能的DNA序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Il

6、eTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T G G G T T C設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并探針序列TGTATGGACGAIATGAATGTATGGATGAIATGAATGCATGGACGAIATGAATGCATGGATGAIATGAA A G三個(gè)位點(diǎn)，八條引物第十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月簡(jiǎn)并序列少，更適合做探針此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行傾向性簡(jiǎn)并序列設(shè)計(jì)。第十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.化學(xué)合成的單元操作 化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離

7、、去保護(hù)五大操作單元。 從反應(yīng)機(jī)理上來(lái)講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法。 具體操作過(guò)程又有液相合成和固相合成兩種形式。 前者操作繁瑣，基本上已淘汰； 后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，合成速度快；但合成的核苷酸鏈不宜太長(zhǎng)，通常小于60bp。 DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸三酯法原理設(shè)計(jì)的。第十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂DMT： 二甲氧基三苯甲基Me：甲基第十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.基因化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)可以合成細(xì)

8、菌偏愛(ài)的密碼子可以定向改變個(gè)別氨基酸可以在兩端加上需要的限制酶切點(diǎn)可以通過(guò)自動(dòng)化儀器合成第十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.DNA化學(xué)合成的用途 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因 制備探針、引物、接頭如胰島素基因、干擾素基因等。如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 第十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、PCR法克隆目的基因 使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。1.PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理定義：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction

9、，PCR）技術(shù)是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化，合成DNA互補(bǔ)鏈達(dá)到基因擴(kuò)增目的的過(guò)程。第十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)反應(yīng)周期包括三個(gè)步驟：高溫變性：通過(guò)加熱使得復(fù)制雙螺旋DNA變性分離為單鏈，作為模板。（91，1分鐘）。低溫退火：（約50，1分鐘）使專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸引物在此低溫條件下分別與單鏈模板DNA兩端的互補(bǔ)區(qū)段互補(bǔ)結(jié)合。適溫延伸：將反應(yīng)混合物的溫度上升到72，保溫1分鐘。第二十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月31第二十二張，

10、PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 PCR原理圖 32第二十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 特點(diǎn)： 反復(fù)循環(huán)便于獲得大量的基因拷貝 Taq酶作用下每一輪PCR循環(huán)會(huì)產(chǎn)生103104的錯(cuò)配率, 所以多用于基因檢測(cè)，如果用于基因重組表達(dá)，在此之前必須進(jìn)行DNA序列分析。2.應(yīng)用：1）診斷 帶有異常外源基因（如病毒） 變異基因（腫瘤、遺傳病等）2）合成特異基因或目的基因3）合成特異探針 第二十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 基因文庫(kù)的基本概念（1）基因庫(kù)與基因文庫(kù)基因庫(kù)（gene pool） 特定生物體基因組上所有基因的集合（天然存在）。 基因文庫(kù)（gene

11、library or gene bank） 從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為： 基因組文庫(kù)（含有全部基因） cDNA文庫(kù)（含有全部編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因） 三、建立基因組DNA文庫(kù)第二十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）基因文庫(kù)構(gòu)建的基本策略用鳥(niǎo)槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)：材料來(lái)自染色體DNA。所謂基因組文庫(kù)是將基因組DNA通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。用cDNA法構(gòu)建cDN

12、A文庫(kù)：材料來(lái)自mRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類(lèi)不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫(kù)有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫(kù)或胚胎組織cDNA文庫(kù)等。很顯然， cDNA文庫(kù)的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)。第二十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)基因文庫(kù)的功能不同把基因文庫(kù)分為： 克隆文庫(kù)：克隆載體 表達(dá)文庫(kù)：表達(dá)載體（融合蛋白和天然蛋白表達(dá)載體），蛋白質(zhì)表達(dá)文庫(kù)（3）基因文庫(kù)的類(lèi)別第二十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)載體的不同把基因文庫(kù)分為： 質(zhì)粒文庫(kù) 噬菌體文庫(kù) 柯斯質(zhì)粒文庫(kù) 人工染色體文庫(kù)不同的載體適于構(gòu)建不

13、同的文庫(kù)！第二十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（4）基因文庫(kù)的完備性基因文庫(kù)的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率。它與基因文庫(kù)所含最低克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln(1P)/ln(1f)其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率 f = 克隆片段的平均大小/生物基因組的大小 例如，人的單倍體DNA總長(zhǎng)為2.9 x 109 bp，基因文庫(kù)中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫(kù)至少需要45萬(wàn)個(gè)克??；而當(dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫(kù)至少需要180萬(wàn)個(gè)克隆。第三十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月若

14、用質(zhì)粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9106克隆才能匯集人基因組全部DNA序列;若用噬菌體載體可構(gòu)建含15kb目的基因的人基因組DNA文庫(kù)，按上式計(jì)算所需要的重組體克隆數(shù)可以減少到9105, 而要用柯斯質(zhì)粒將40kb目的基因片斷所需要重組體克隆數(shù)可降到3.5105左右,均可滿(mǎn)足建庫(kù)要求。載體種類(lèi)裝載量轉(zhuǎn) 染 率 噬菌體 粘性質(zhì)粒 (Cosmid) 酵母人工染色體(YAC)922kb3045kb1001000kb105106轉(zhuǎn)化子gDNA104106轉(zhuǎn)化子gDNA 500轉(zhuǎn)化子gDNA表4-1 三種常用基因組文庫(kù)克隆載體的比較第三十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（

15、5）基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大：以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度：避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域：以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第三十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過(guò)程中的完整性， 用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過(guò)度的斷裂。制備的DNA分子量越大（至少是插入片斷大小的3-5倍），經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完

16、備性也就越高。AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長(zhǎng)度一般在100 kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得長(zhǎng)達(dá)1000 kb的DNA片段。2.基因組文庫(kù)的構(gòu)建程序第三十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）基因組DNA的切割用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性?xún)?nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理：DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。部分酶切法：一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性?xún)?nèi)切酶，如Sau3AI或MboI等，這

17、樣DNA酶解片段的大小可控。連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！第三十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）載體和受體的選擇基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體：出于壓縮重組克隆數(shù)量的原因，通常選裝載量較大的-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類(lèi)）需使用YAC或BAC載體。cDNA文庫(kù)構(gòu)建的載體：通常選質(zhì)粒，因?yàn)橛捎诮^大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb。l-DNA 上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)?？妓官|(zhì)粒10 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kb基因文庫(kù)構(gòu)建的受體：根據(jù)載體使用選擇大腸桿菌或酵

18、母菌。第三十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，大量體系連接前先使用小體系連接來(lái)尋找最佳比例！方法一：粘末端連接方法二：人工接頭法（4）載體與DNA片段的連接（5）轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進(jìn)口包裝蛋白！第三十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（6）從基因組文庫(kù)中篩選目的基因 大型基因組文庫(kù)一般由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩

19、選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫(kù)篩選均需多輪操作步驟。第三十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月密集鋪板（1-10萬(wàn)）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆第三十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(7).利用改進(jìn)的鳥(niǎo)槍法操作克隆目的基因使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高目的重組子的出現(xiàn)頻率。 （a）使用特征性限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)染色體DNA 第四十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，

20、將染色體DNA用SalI切開(kāi)，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接。（b）在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb第四十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法（c）凝膠DNA片段回收技術(shù) 第四十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(8).鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)較難獲得長(zhǎng)度較小的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子序列優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，命中率較高。缺點(diǎn)：盲目性大，陽(yáng)性片段不一定正好是基

21、因，樣本多，可能會(huì)錯(cuò)漏目的基因。第四十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（9）基因組文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)性問(wèn)題在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，最應(yīng)引起重視的問(wèn)題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán) 用TdT酶在DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 第四十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（10）構(gòu)建基因組文庫(kù)應(yīng)注意的問(wèn)題1、插入DNA的質(zhì)量：構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)，插入DNA和載體DNA的質(zhì)量是成功與否的關(guān)鍵?；蚪MDNA應(yīng)當(dāng)非常純，以適應(yīng)DNA的酶解，而且基因組DN

22、A也應(yīng)足夠大（最好超過(guò)200kb）以獲得兩個(gè)末端的消化產(chǎn)物。 2、載體DNA的質(zhì)量：不論是載體DNA還是靶DNA不含外源片段是一個(gè)基本條件。污染少量探針序列或載體的基因組DNA將引起很大麻煩，這是因?yàn)樵诤Y選過(guò)程中它們將被鑒定為所要的克隆。 3、DNA的消化：部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個(gè)基因組的隨機(jī)片段。識(shí)別4個(gè)堿基的限制酶要比識(shí)別6個(gè)堿基酶能產(chǎn)生更隨機(jī)的插入片段。部分消化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。限制酶和部分消化過(guò)程應(yīng)事先檢查。一些批次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA片段末端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)，檢查限制酶和DNA濃度及純度。第四十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于20

23、22年6月4、連接-在考慮把噬菌體臂和插入DNA片段連接過(guò)程中有兩個(gè)重要參數(shù)：噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組DNA的濃度和純度。大約10pg噬菌臂和4gDNA能產(chǎn)生有效地包裝。對(duì)一個(gè)典型的基因組，要產(chǎn)生一個(gè)可表達(dá)文庫(kù)，重組子數(shù)一般要大于11066l06。 5、包裝抽提物的包裝效率：貯存于液氮中可保持1年多。而在-70中只能保存幾星期，而且包裝效率還會(huì)降低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個(gè)關(guān)鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。這種包裝提取物質(zhì)量高，且在體外包裝噬菌體DNA和插入片段過(guò)程能產(chǎn)生大量的噬菌斑。第四十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022

24、年6月基因組文庫(kù)構(gòu)建程序隨機(jī)酶切成較大的DNA片段（10-30 Kb，平均20 Kb)，對(duì)這些片段進(jìn)行分離重組入適當(dāng)載體（噬菌體）轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌（E.coli)，擴(kuò)增，構(gòu)建成基因文庫(kù)從基因組文庫(kù)中篩選出含有目的基因組的重組子。（11）總結(jié)第四十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 是以mRNA為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA的方法。 cDNA的克隆對(duì)于特定基因的分離和特性研究是極有價(jià)值的工具。 cDNA文庫(kù)最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細(xì)胞類(lèi)型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列。四、構(gòu)建cDNA文庫(kù) 第四十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月特點(diǎn)：cDNA無(wú)內(nèi)含子, 長(zhǎng)度

25、較基因組基因小, 使操作更為方便。 mRNA比基因組中基因少, 因此篩選某一特定功能基因工作量較小。 mRNA中拷貝數(shù)大于基因組中的拷貝數(shù), 利于獲得較多的模板。（轉(zhuǎn)錄特征）可在原核細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的蛋白 不同種類(lèi)不同狀態(tài)的細(xì)胞的cDNA文庫(kù)不同不能研究基因組的結(jié)構(gòu)功能第四十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月mRNA（1）cDNA第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第

26、一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs1.cDNA法克隆目的基因的基本策略第五十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月反轉(zhuǎn)錄酶：AMV （來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒） MMLV （來(lái)自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和隨機(jī)引物Oligo（dT）引導(dǎo)的 cDNA 合成 是指 Oligo（dT）引物與 mRNA 3 末端的 poly（A）配對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以 mRNA 為模板合成第一鏈 cDNA 。這種 cDNA 合成的方法在 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)是由于 cDNA 末端存在較長(zhǎng)的 poly（A）而影響 cDNA 測(cè)序。隨機(jī)引物引導(dǎo)的 cDNA 合成 采用 610

27、 個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來(lái)錨定 mRNA 并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。由于隨機(jī)引物可能在一條 mRNA 鏈上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)而從多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長(zhǎng)的 mRNA 分子的 5 端序列。 隨機(jī)引物 cDNA 合成的方法不適合構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。第五十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）cDNA第二鏈的合成 煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTT

28、TTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1 nuclease獲得的雙鏈cDNA的5端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失第五十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligaseRNa

29、seH：催化DNA-RNA雜合體的RNA部分的核內(nèi)降解，產(chǎn)生不同鏈長(zhǎng)、帶3羥基和5磷酸末端的寡核糖核酸。 獲得的雙鏈cDNA 5端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失第五十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月dCTPTdT引導(dǎo)合成法：5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPs獲得的雙鏈cDNA 能

30、保留完整的5端序列第五十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）雙鏈cDNA的克隆 雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無(wú)法回收。 插入片段加裝人工接頭引入酶切位點(diǎn)，以便插入片段的回收。平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過(guò)加熱局部變性和S1核酸酶處理回收。 第五十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）完備分離程序 提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子。 篩選時(shí)，若使用的是多拷貝載體，則采用

31、菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選。 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等。 2. cDNA法分離目的基因的基本程序第五十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月從總RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)能夠從極其有限的起始材料中構(gòu)建cDNA文庫(kù)。以總RNA為模板合成cDNA，無(wú)需mRNA的純化，不僅簡(jiǎn)化操作，而且避免了低豐度信息分子的丟失。能夠提高cDNA文庫(kù)的完整性，獲得那些低水平表達(dá)的基因的cDNA克隆。此法對(duì)植物基因功能的研究，如對(duì)某種外界因素作用后或不同發(fā)育階段基因表達(dá)變化的研究尤為適用。第五十八張

32、，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1) 取材：mRNA約占總RNA的15，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達(dá)最豐富的組織細(xì)胞為材料來(lái)源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島細(xì)胞為原始生物材料，細(xì)胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為材料2) 從總的RNA中分離mRNA將提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸 oligo(dT) 纖維素中進(jìn)行親和層析 從提純的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)第五十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）特異分離程序 提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆。 特異分

33、離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等。 第六十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)。 細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短。mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難。僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因。 第六十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 核酸雜交法: 以特殊標(biāo)記的寡核苷酸鏈為探針 將擴(kuò)增好的cDNA文庫(kù)（即許多帶有cDNA重組體大腸桿菌培養(yǎng)皿內(nèi)所形成的菌落或噬菌斑）轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，堿解后加帶標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，能顯示特異結(jié)合探針的點(diǎn)（克隆）便是目的基因所在處。確

34、定菌落或噬菌斑的位置，擴(kuò)增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片斷，即為目的基因。（如圖）4. 篩選目的基因 第六十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 免疫結(jié)合法 噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，各種cDNA表達(dá)并呈現(xiàn)在噬菌體表面的蛋白質(zhì)便牢固地結(jié)合在膜上。然后將膜放入含有特異抗體的溶液中進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體后，再與125 I 標(biāo)記的第二抗體結(jié)合, 從而找出帶有放射性示蹤信號(hào)的斑點(diǎn), 進(jìn)而找出對(duì)應(yīng)噬菌斑, 克隆擴(kuò)增, 提取DNA后經(jīng)酶切可獲目的基因。 第六十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 基因組文庫(kù) cDNA文庫(kù)

35、信息供體 DNA mRNA載體 噬菌體，黏粒，人工染色體 質(zhì)粒，噬菌體連接前 部分酶切，分級(jí)分離 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈 連接 粘端連接，人工接頭 同聚物加尾，人工接頭篩選 核酸探針 核酸探針，免疫探針基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的比較第六十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA長(zhǎng)度分級(jí)雙鏈cDNADNA與載體連接 引入宿主細(xì)胞鑒定文庫(kù)的完備性擴(kuò)增后供長(zhǎng)期儲(chǔ)存篩選出所需要的克隆第六十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用差別雜交法構(gòu)建cDNA文庫(kù)適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的cDNA克??；技術(shù)基礎(chǔ)：在一個(gè)細(xì)胞群體中

36、目的基因正常表達(dá)，在另一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)；可以通過(guò)這兩種總mRNA（cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對(duì)有目的基因表達(dá)的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫(kù)進(jìn)行篩選。四、獲得目的基因的其他方法第六十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月差示篩選（Differential Screening） 第六十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 構(gòu)建差示文庫(kù)篩選特殊基因。 差示文庫(kù)（differential library）又稱(chēng)扣除文庫(kù)（ subtracted library）, 是反映不同組織細(xì)胞或同一種細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下,基因表達(dá)差異的cDNA文庫(kù)。2. 應(yīng)用扣除雜交法構(gòu)建cDNA文庫(kù)

37、第七十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月不是細(xì)胞內(nèi)所有表達(dá)基因全體的集合，而是主要含差異表達(dá)基因的部分cDNA的集合；用過(guò)量的參照細(xì)胞mRNA或cDNA與目的細(xì)胞cDNA或mRNA(又稱(chēng)目的序列)雜交，形成的RNA-cDNA雜交體是兩種細(xì)胞共有的，將其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以標(biāo)記成探針(稱(chēng)減法或扣除探針)，從上述目的細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中篩選目的克??；實(shí)質(zhì)上是除去了一大批高豐度非特異性的cDNA，含有的是特異表達(dá)的cDNA克隆及其它一些低豐度mRNA的cDNA克隆。第七十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月扣除雜交（Subtractive Hybridization）

38、第七十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月扣除雜交法基本程序 利用兩組細(xì)胞mRNA種類(lèi)的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因。 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能。 第七十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價(jià)交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因cDNA克隆扣除雜交 第七十四張，

39、PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3. mRNA差異顯示法獲得目的基因 mRNA差異顯示（mRNA differential display DD）PCR法全稱(chēng)為DD-PCR法,其用途和應(yīng)用目的與構(gòu)建差示文庫(kù)大體一致。 第七十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 獲得目的基因方法的選擇一、根據(jù)獲得目的基因的研究目的選擇方法二、根據(jù)目的基因本身特點(diǎn)選擇方法三、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件選擇方法 第七十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)目的基因重組體的構(gòu)建一、質(zhì)粒DNA的分離純化二、分子克隆載體的選擇三、目的基因與載體的

40、連接第七十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象 （2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（3）載體容量（4）合適克隆位點(diǎn)（5）載體的穩(wěn)定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等第七十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)對(duì)象（1）供體：遺傳背景與DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。（2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式(包括人為的方法)，DNA限制修飾系統(tǒng)，DNA重組基因特點(diǎn)，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。第

41、八十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)對(duì)象如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如： E.coli DH5、 E.coli DH5、 E .coliDH5F 1）三者均有限制-修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源DNA可存活，且不發(fā)生重組2）DH5和 DH5F都具有一個(gè)可供遺傳標(biāo)記lacZ檢測(cè)的遺傳背景3）DH5F可供M13mp系列載體配套使用，M13病毒的感染需要 F的存在第八十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、目的基因與載體的連接 粘性末端的連接 1. 單酶切點(diǎn)的粘性末端 全同源性粘性末端 高背景 雙向插入,不能定向 2. 雙酶切片段的定向克隆粘粘 非同源互補(bǔ)的粘性末端 重組方案中最有效簡(jiǎn)捷的途徑。 粘平第八十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 平端連接法 (除酶促外的平端鏈接方法) 1. 同聚物加尾法 2. 用銜接物連接法 3.適配子連接法（帶有相應(yīng)酶切點(diǎn)的粘性末端）EcoRI粘性末端 ： 5AGCGGCCGCG 3 TCGCCGGCGCTTAA5BamHI PasI粘性末端：5GATCCGG.CACTGCA3 3 GCC.GTG 5 BamHI PasI 4. TA克隆法 TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增