木薯的組織培養(yǎng)

1、木薯的生物學特性及組織培養(yǎng)技術摘要：木薯是目前世界上重要的糧食作物，一般以莖稈進行無性繁殖，具有全年 可種植，易栽培，廣泛分布在全球的熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于木薯自身的特性(如 植株的高度雜合、花粉育性低、有性子代嚴重分離等)及種質資源的局限性(如 抗性基因資源貧乏、己知的品種均含有氤化物等)，傳統(tǒng)的育種方法在木薯育種 上的應用受到限制，目前，植物組織培養(yǎng)技術結合誘變育種篩選突變性狀已成為 選育種工作的重要手段之一。關鍵詞：木薯生物學特性組織培養(yǎng)前言：木薯(ManihotesculentaCrantz)屬于大戟科塊根作物，具有高生物量、高 淀粉、抗逆、耐瘠等多種特點，是全球熱帶地區(qū)僅次于水稻、甘

2、蔗、玉米的第4 大糧食作物，為超過六億人口提供生存的基本熱能。在我國木薯作為新興的能源 作物受到廣泛重視，其產量的90%用于生產淀粉和乙醇，木薯生產和加工產業(yè)有 很大的發(fā)展空間和潛力。由于木薯是無性繁殖的異花授粉作物，基因型高度雜合， 新品種培育中存在雜交育種選擇效率低，隱性不良基因沉余，以及自然繁殖系數(shù) 低等問題，傳統(tǒng)育種方法在基因重組方面受到局限。生物技術的應用卻能夠在很 大程度上解決上述問題。木薯組織培養(yǎng)是木薯生物技術的基礎。木薯小抱子胚胎 發(fā)生培育加倍單倍體和體細胞胚胎發(fā)生再生植株體系，不僅能夠開辟利用木薯雜 種優(yōu)勢的技術途徑，而且在轉基因育種、基因鑒定、優(yōu)良克隆系快速繁殖及種質 保存

3、等方面具有重要意義。1木薯的生物學特性木薯(cassava)亦稱 manioc、mandioc 或 yuca，學名 Manihot esculenta crantz(M. utilissima Pohl)，別名木番薯，樹薯。隸屬于雙子葉植物綱 (Dicotyledoneae)、薔薇亞綱(Rosidae)、大戟目(Euphorbiales)、大戟科 (Euphorbiaceae)、木薯屬(Manihot)植物，屬內有98個種，其中僅有木薯一 個栽培種(Roger et al, 1973)。1.1特征與特性大戟科植物原產于美洲熱帶，全世界熱帶地區(qū)廣為栽培。其塊根可食，可磨 木薯粉、做面包、提供木薯

4、淀粉和漿洗用淀粉乃至酒精飲料。木薯可能為墨西哥 猶加敦的馬雅人首先栽培。大多數(shù)品種含有能產生氤化物的糖類衍生物，原始民 族會用摩擦、壓榨及加熱等復雜的工序去毒。木薯極易發(fā)生變異，所以本身可能 就是一個雜交種。為多年生。葉片掌狀分裂，裂片5枚或9枚，似蓖麻葉，但裂 更深。塊根肉質，似大麗花。品種多，有小的低矮草本、稍大的高1公尺(3叭) 的多分枝灌木及至5公尺高的小喬木。有些品種適應干燥堿性土壤，有些則適于 河邊的酸性泥灘。木薯屬約160種，均為原產於熱帶美洲的喜陽光植物。巴西東 北部的橡膠木薯(M. glaziovii)可產塞阿拉(Ceara)橡膠。西非的糯糊糊 (gelatinous fuf

5、u)及牙買加的巴米糊(bami mush)均由木薯做成。木薯是灌木狀多年生作物。莖直立，木質，高2-5m，單葉互生掌狀深 裂，紙質，披針形。單性花，圓錐花序，頂生，雌雄同序。雌花著生于花序基部， 淺黃色或帶紫紅色，柱頭三裂，子房三室，綠色。雄花著生于花序上部，吊鐘狀， 植后3-5個月開始開花，同序的花，雌花先開，雄花后開，相距7-10天。蒴果， 矩圓形，種子褐色，根有細根、粗根和塊根。塊根肉質，富含淀粉。木薯適應性 強，耐旱耐瘠。在年平均溫度18r以上，無霜期8個月以上的地區(qū)，山地、平 原均可種植；降雨量6006000 mm，熱帶、亞熱帶海拔2000 m以下，土壤pH3.8 8.0的地方都能生

6、長，最適于在年平均溫度27r左右，日平均溫差67C，年 降雨量10002000mm且分布均勻，pH6.07.5，陽光充足，土層深厚，排水良 好的土地生長。1.2分布狀況木薯起源于熱帶美洲，廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，主要分布在巴西、 墨西哥、尼日利亞、玻利維亞、泰國、哥倫比亞、印尼等國。中國于19世紀20 年代引種栽培，現(xiàn)已廣泛分布于華南地區(qū)，廣東和廣西的栽培面積最大，福建和 臺灣次之，云南、貴州、四川、湖南、江西等省亦有少量栽培。1.3木薯在我國的栽培歷史木薯于十九世紀二十年代引入我國，首先在廣東省高州一帶栽培，隨后引入 海南島，現(xiàn)已廣泛分布于華南地區(qū)，以廣西、廣東和海南栽培最多，福建、

7、云南、 江西、四川和貴州等省的南部地區(qū)亦有引種試種。在太平天國時代(1851-1863)， 木薯已在粵東一帶廣為栽培，并開始進入了農貿市場，當時出版的專輯種木薯 法(梁延東1900年)，對木薯形態(tài)特征，水土保持，種植方法，收獲和品種， 留頭縮根，加工計劃等方面都作了扼要的描述，說明當時對木薯已經有了比較深 刻的了解。我國木薯的試驗研究工作，當以解放前的廣東省農林試驗場為最早，該 場在1914 年-1919年，曾進行品種收集、評選、宿根、制粉和塊根營養(yǎng)成份分 析等試驗。1940-1944年，李西開、黃瑞綸等人在廣西柳州沙唐的廣西農事試驗 場對木薯氫氤酸的分布，含量及其清除以及品種觀察和栽培技術等

8、進行了集中和 專門的研究，并發(fā)表了 “木薯毒素之研究”的專論。解放后，梁光商等人于1957 年在廣東開始了木薯的選育種工作，1959年以后華南熱帶作物科學研究院開始 對木薯的種植方法，快速繁殖，輪種間作，種莖貯藏，雜交育種以及北移栽培等 進行了廣泛的試驗研究，在溫健教授的主持下，育成和推廣了食用良種木薯華南 6068,同時摸清了我國適宜栽培木薯的地理區(qū)域和氣候條件，指出我國秦嶺淮河 一線以南的長江流域地區(qū)，年平均氣溫16C以上，無霜期8個月以上的地區(qū)都 可栽培木薯，現(xiàn)以廣東、廣西、海南栽培最多，臺灣、福建、云南次之，湖南、 江西、四川、貴州等亦有少量試種。目前廣東、廣西和海南等有關農業(yè)科研單位

9、， 已開設木薯研究課題，進行木薯種質收集、保存、評選和育種栽培，深度加工等 研究工作，已育成一系列優(yōu)良品種，如華南124、華南205、華南6068、華南5 號、華南6號等，為我國木薯的品種更新，實現(xiàn)良種化提供新的品種資源。1.4木薯的類型及用途木薯為世界三大薯類（木薯、甘薯、馬鈴薯）之一。木薯屬有100多個種，木 薯為唯一用于經濟栽培的種，其他均為野生種。木薯可分為甜、苦兩個品種類型。木薯的主要用途是食用、飼用和工業(yè)上開發(fā)利用。塊根淀粉是工業(yè)上主要的 制淀粉原料之一。世界上木薯全部產量的65%用于人類食物，是熱帶濕地低收入 農戶的主要食用作物。作為生產飼料的原料，木薯粗粉、葉片是一種高能量的飼

10、 料成分。在發(fā)酵工業(yè)上，木薯淀粉或十片可制酒精、檸檬酸、谷氨酸、賴氨酸、 木薯蛋白質、葡萄糖、果糖等，這些產品在食品、飲料、醫(yī)藥、紡織（染布）、 造紙等方面均有重要用途。在中國主要用作飼料和提取淀粉。2木薯的組織培養(yǎng)2.1木薯組織培養(yǎng)研究進展2.1.1器官發(fā)生途徑（1）以頂端分生組織為外植體的器官發(fā)生途徑1。木薯組培的早期工作主 要是頂端分生組織培養(yǎng)，該方法常用于種質資源的保存和交換，品種的提純、復 壯、脫毒等。（2）以單芽莖段為外植體的器官發(fā)生途徑2。Konan等用10mg/L BA誘導 帶腋芽的節(jié)段外植體，形成結構致密的帶芽點圓球狀組織塊。將這些組織塊轉接 到含低濃度激素（0.1mg/L

11、NAA，1mg/L BA，0.1mg/L GA）的培養(yǎng)基上，即形成叢 芽。每個外植體經1個培養(yǎng)周期可產生14株苗。（3）以葉片為外植體的器官發(fā)生途徑3。Shanin報道，從木薯幼葉分離原 生質體，誘導愈傷而再生植株，其結果沒有得到重復。Anthony從Thai8無菌苗 的葉片分離原生質體，在無銨MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在液面上覆蓋瓊脂糖固化 的B5培養(yǎng)基，又在固體培養(yǎng)基中均勻地垂直插入多支短玻璃棒。（4）以胚（子葉、胚軸）為外植體的器官發(fā)生途徑。胚培養(yǎng)指從合子胚或 體細胞胚的各個部位取材，進行離體培養(yǎng)以獲得再生植株4。馬國華等以南植188 體胚為材料，研究了細胞分裂素和生長激素對其器官建成和體

12、胚建成的影響。將 體胚切碎后用含不同細胞分裂素和生長激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。結果顯示，細胞分裂 素促進器官建成，生長激素促進體胚建成；不同的細胞分裂素對器官建成的效果 不一樣，BA和TDZ效果比KT和N-isopntenyla denine效果好。2.1.2體細胞胚胎發(fā)生途徑CD 以胚（子葉、胚軸）為外植體的體細胞胚胎發(fā)生途徑5。初級體胚和次 級體胚的誘導和生長；循環(huán)體胚的誘導和生長，直接體胚發(fā)生適合微繁殖！間接 體胚發(fā)生適用于通過生物技術對木薯進行遺傳改良。（2）以葉片為外植體的體細胞胚胎發(fā)生途徑6。N.F.de Melo首先用不同 濃度的2,4-D從木薯幼葉誘導愈傷組織，再將愈傷組織轉入含不同濃

13、度組合的 GA3和BA培養(yǎng)基。結果顯示，2，4-D可誘導脆性愈傷和致密愈傷。（3）以花為外植體的體細胞胚胎發(fā)生途徑7。完整雄花和小花也可誘導體 胚，但效率低?；ǚ勰摇⒒ǚ哿：突ㄋ幈诮M織未得到體胚！這些體胚經由器官建 成途徑發(fā)育成完整植株，對組培苗的表型和染色體倍性鑒定結果表明，它們與母 株一致，未發(fā)生變異。如果通過花的組織培養(yǎng)得到單倍體植株，將對木薯的倍性 育種和加快其遺傳物質的純合發(fā)揮重要作用。2.2愈傷組織和胚狀體誘導培養(yǎng)的影響因素2.2.1激素種類和濃度對愈傷組織和胚狀體的影響。激素配比的處理只在胚狀體階段進行。NAA濃度對體細胞胚胎發(fā)生的影響8：木薯嫩葉外植體在含有1080 mg/L

14、NAA 的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，開始膨大，逐漸脫分化形成疏松的愈傷組織。培養(yǎng) 913 d后，在愈傷組織的表面，肉眼可見淡黃色或淡綠色的體細胞胚的形成。當 NAA濃度為10 mg/L時，只有1.3%的嫩葉外植體能夠誘導初生體細胞胚胎發(fā)生； 當NAA濃度為40 mg/L時,初生體細胞胚胎發(fā)生頻率可達33.2%；但當NAA濃度 為80 mg/L時，培養(yǎng)基出現(xiàn)一定毒性，愈傷組織褐化較早，體細胞胚胎發(fā)生頻率 跌至18.6%。但是，當誘導培養(yǎng)基只含1 mg/L NAA時，不能誘導初生體細胞胚 胎發(fā)生，其愈傷組織誘導較少，在葉外植體的表面形成一些叢生的根系。在含 2080 mg/L NAA的誘導培養(yǎng)基上，

15、木薯芽的器官發(fā)生與其初生體細胞胚胎發(fā)生 幾乎是同步進行的。在暗培養(yǎng)的第7天至第9天，根的誘導首先出現(xiàn)；當培養(yǎng)時 間延伸到第10天至第14天，在愈傷組織的表面產生肉眼可見的綠色芽尖或芽。 當培養(yǎng)時間延長到第20天至第25天后，可明顯見到芽或叢芽的出現(xiàn)。在大多數(shù) 情況下，體細胞胚和芽出現(xiàn)在同一愈傷組織塊上。有時一個或多個芽出現(xiàn)在同一 愈傷組織塊上。所有這些芽尖或芽在再生培養(yǎng)基上都能夠直接發(fā)育成正常的試管 苗。對于在含4 mg/L 2,4-D的誘導培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)的嫩葉外植體，在培養(yǎng)1520 d后，可見到球形或魚雷形胚的形成，其特征跟Szabados等報道的相同，其初 生體細胞胚的誘導頻率為23.8%

16、。2,4-D濃度對體細胞胚胎發(fā)生的影響9：當2, 4-D濃度為2mg/L時,雖然也 能產生較多的愈傷組織，但這些愈傷組織大多呈疏松膨大型，很難誘導出體細胞 胚，致使體細胞胚胎發(fā)生率較低。隨著2, 4-D濃度的增加，色澤淡黃，質地致密的 胚性愈傷組織比例隨之增加，體細胞胚胎發(fā)生率也相應提高。在濃度為4 mg/L 時，體細胞胚胎發(fā)生率達到最高,為63%。繼續(xù)增加濃度至6mg/L，體細胞胚胎發(fā)生 率相對較高，但與4mg/L相比，已出現(xiàn)下降趨勢，為56%。當2, 4-D濃度達到10mg/L 時，產生的愈傷組織大多數(shù)呈膨大疏松型，有些甚至呈褐色，而且從中分化出了根 系，致使體細胞胚胎發(fā)生率嚴重下降，僅為

17、39%。由此可見，2, 4-D濃度對體細胞 胚胎發(fā)生率的影響并不呈直線型，只有適宜濃度的2,4-D才能獲得最佳的誘導效 果。表1 2, 4-D濃度對體細胞胚胎發(fā)生的影響2, 4-D 濃度(mg/L)胚狀體塊/外植體總塊數(shù)體細胞胚胎發(fā)生率（%）產胚量（個）217 /7623. 07. 0454 /8163. 021. 0640 /7156. 019. 0831 /6747. 015. 01025 /6339. 010. 02,4-D的濃度越高，越有利于提高初生體細胞胚的誘導頻率。2,4-D濃度太低，不能誘導初生體細胞胚的形成；對于活性較低的IBA和IAA，盡管其濃度較高，仍然不能成功誘導木薯初生

18、體細胞胚胎發(fā)生10。2.2.2培養(yǎng)基類型及胚狀體成熟培養(yǎng)時間對次生胚狀體誘導的影響“以初生胚狀體為外植體，經誘導產生次生胚狀體（循環(huán)1次）。本實驗以次生 胚狀體（循環(huán)2次）為外植體，分別轉入固體及液體的成熟培養(yǎng)基，研究固體培 養(yǎng)、液體培養(yǎng)及不同胚狀體成熟時間對次生胚狀體即對循環(huán)3次胚狀體的產量的 影響。結果表明（見表2）：固體培養(yǎng)基上胚狀體生長較液體中的快，而且次生 胚狀體發(fā)生頻率隨成熟培養(yǎng)時間的延長而提高，在15d左右達到最大值，而在液 體培養(yǎng)基上達到最大值的時間稍遲，且在相同的胚狀體成熟時間內次生胚狀體發(fā)生頻率較固體培養(yǎng)的要低。表2胚狀體成熟培養(yǎng)時間及培養(yǎng)基類型對次生胚狀體發(fā)生的影響培養(yǎng)基

19、類型成熟培養(yǎng)時間（d）成熟胚狀體數(shù)/外植體固體516.4 士 2.51023.4 士 2.81529.3 士 4.12025.3 士 3.0液體513.6 士 1.91015.8 士 1.81519.6 士 2.42022.5 士 3.12.2.3前培養(yǎng)細胞分裂素（BA）對胚狀體成苗的影響12。胚狀體在不同濃度的BA處理上成熟培養(yǎng)20d后，將成熟的胚狀體接種到成 苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計每個處理的成苗數(shù)并計算出，成苗率高的處理即為 胚狀體成熟培養(yǎng)最佳BA濃度。表3胚狀體的成熟對成苗的影響B(tài)A(mg/L)胚狀體數(shù)量（個）成苗數(shù)成苗率（%）0(CK)1204537.50.11206554.20

20、.51207663.31.01207262.52.01206856.74.01205041.6結果表明，添加激素BA各處理的成苗率均比對照高。當BA為0.5 mg/L時， 其成熟胚狀體的成苗率最高63.3%；其次是BA為1.0mg/L和BA為2.0 mg/L時， 分別為62.5%和57.5%；再次是BA為0.1mg/L時，為54.2%；第四是BA為4.0 mg/L 時，為41.6%，最低是對照為37.5%。從而初步篩選出較適合胚狀體成熟的培養(yǎng) 基配方：MS +0.5 mg/L CUSO4 + 1.0 mg/L BA。由此可見，合適BA濃度能夠促 進胚狀體的生長發(fā)育，提高成苗率。2.2.4不同的

21、碳源對體細胞胚胎發(fā)生及植株再生的影響13。分別以20-40mg/L的麥芽糖、葡萄糖、乳糖及蔗糖為碳源，加入胚狀體誘導 培養(yǎng)基，研究它們對次生胚狀體發(fā)生及植株再生的影響。四種碳源中以麥芽糖的 效果最好，當麥芽糖濃度為40g/L時，胚狀體誘導效率較蔗糖20g/L時稍高，而 植株再生的頻率則由蔗糖的38.5%提高到74.3%，成熟胚狀體的再生植株數(shù)由蔗糖的11.6增加到24.1，分別為蔗糖對照的2倍。葡萄糖及乳糖對胚狀體的誘導 效果均較蔗糖的差（表4）。表4不同碳源對木薯次生胚狀體發(fā)生及植株再生的影響碳源濃度成熟胚狀體數(shù)/外植體再生頻率（）再生植株數(shù)/外植體蔗糖2030.338.511.64020.

22、424.35麥芽糖2025.556.814.54032.574.324.1葡萄糖2010.527.92.9408.319.71.6乳糖208.341.43.42.2.5基因型對胚狀體成苗的影響&在試驗的7種基因型中，華南8號的成苗率最高，達到64.4%；其次是南植 188和MCol22，分別為57.8%和55.6%；其余依次為文昌紅心、華南5號、華南 7號和華南6號，所獲得植株的比例分別為52.2%、51.1%、45.6%和43.3%。試 驗結果表明（表5），華南8號、南植188和MCol22的成苗率較高；且由上述表 2和表3可知，華南8號、南植188和MCol22的出胚率與產胚量均較高，因而

23、 可以作為木薯體細胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)與植株再生優(yōu)先選擇的基因型?？梢?，多個基 因型之間成熟胚狀體的成苗率存在差別，但均能達到一定的水平，由此說明該體 系對基因型的依賴性并不突出，具有一定的通用性，可以應用于不同品種體細胞 胚胎發(fā)生的培養(yǎng)。表5不同基因型對胚狀體成苗的影響基因型胚狀體數(shù)（個）成苗數(shù)（株）成苗率（%）華南5號904651.1華南6號903943.3華南7號904145.6華南8號905864.4文昌紅心904752.2南植188905257.8MCol22905055.63結論木薯經過人類約4000年的廣泛引種和栽培，現(xiàn)已遍布全球北緯30 -南緯 30間的熱帶和亞熱帶地區(qū)。木薯的塊根含

24、有豐富的淀粉，是世界三大薯類作物 （甘薯、馬鈴薯、木薯）之一，是亞非拉發(fā)展中國家近5億人口的主要糧食。在 我國，木薯主要用做飼料和提取淀粉，以初加工后的木薯淀粉為原料可生產200 多種產品，有很高的綜合利用價值。20世紀90年代以來，隨著飼料工業(yè)和淀粉 工業(yè)的迅速發(fā)展，木薯的經濟價值進一步提高，市場供不應求。木薯在世界范圍內雖然廣泛栽培，但其基礎研究及發(fā)掘其遺傳多樣性的研究 遠遠滯后于其他如水稻、小麥、玉米、馬鈴薯等作物，現(xiàn)有的木薯組織培養(yǎng)方法 基本可滿足種質的保存、交換、脫毒、復壯以及新品種微繁殖的需要，但受基因 型制約，不同基因型的培養(yǎng)效果差別較大。另外，組織培養(yǎng)所用的外植體均為器 官或組織塊，對這些材料進行轉基因只能得到嵌合體植株，因此必須研究其它培 養(yǎng)方式如原生質體培養(yǎng)、單細胞培養(yǎng)等，優(yōu)化遺傳轉化條件才能獲得純合的轉基 因植株，而且還可進行體細胞雜交育種。第三，花藥培養(yǎng)研究剛剛起步，由于其 對木薯純合品種和多倍體品種的培育起主導作用，因此必須加大研究力度，為木薯種質創(chuàng)新做貢獻。參考文獻：Kartha K K.Regeneration of cassava plants from apical meristems.Plant Sei Lett,1974,2:107-113Kon