第四章抗體人工制備

1、第四章抗體人工制備章節(jié)安排第一節(jié) 多克隆抗體第二節(jié) 單克隆抗體第三節(jié) 基因工程抗體第四節(jié) 催化抗體目的與要求 1、掌握單克隆抗體和多克隆抗體的概念、制備原理及其制備的具體過(guò)程 。 2、了解基因工程抗體與催化抗體的概念及意義 。難點(diǎn)與重點(diǎn) 重點(diǎn)與難點(diǎn)：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體的概念、制備原理及其制備的具體過(guò)程 。 為了研究抗體的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)與功能，及應(yīng)用抗體于臨床疾病的診斷、治療及預(yù)防都需要人工制備抗體。目前，根據(jù)制備的原理和方法可分為四類(lèi)： 多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體 催化抗體大多數(shù)天然抗原物質(zhì)(如細(xì)菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇

2、都可刺激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體。多克隆抗體：多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體后，由多個(gè)免疫淋巴細(xì)胞分泌的多種抗體的混合物。 第1節(jié) 多克隆抗體一、概念二、多克隆抗體制備的基本過(guò)程試血測(cè)定抗體效價(jià)血清的分離與保存多抗的純化與標(biāo)記多抗的親和層析 抗體的保存緩沖體系防腐劑穩(wěn)定劑濃度存儲(chǔ)時(shí)間（多頭加樣槍?zhuān)┡艠孍LISA板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第二節(jié) 單克隆抗體一、單克隆抗體的概念1、概念：由一個(gè)B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞(漿細(xì)胞)產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體。2、特點(diǎn)：抗體的重鏈、輕鏈及其V區(qū)獨(dú)特型的特異性、親和力、生物學(xué)性狀及分子結(jié)構(gòu)均完全相同。 這種雜交瘤細(xì)胞：既具有骨髓瘤細(xì)胞能大量無(wú)限生長(zhǎng)繁殖的特性，又具有抗體

3、形成細(xì)胞合成和分泌抗體的能力。 10:1雜交瘤細(xì)胞一般采用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）、氨基喋呤（Aminoopterin，A）及胸腺嘧啶（Thymidine，T），利用A阻斷核酸的主要生物合成途徑。代謝缺陷型細(xì)胞株缺失旁路DNA合成所需的酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用外源性的核苷酸前體，如H和T，喪失DNA合成的旁路途徑；只能通過(guò)以葉酸為媒介，由氨基酸和其它小分子化合物合成核苷酸進(jìn)行DNA合成。一旦葉酸衍生物的合成被HAT培養(yǎng)液中的A阻斷，這些細(xì)胞因?yàn)槭NA合成的主通道，又無(wú)能力從旁路合成DNA而死亡。正常細(xì)胞在

4、H和T存在的情況下，可利用旁路途徑繼續(xù)合成核酸。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞株為代謝缺陷型細(xì)胞株，融合后在HAT培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，而融合細(xì)胞由于含有來(lái)自正常細(xì)胞的HGPRT酶，在HAT培養(yǎng)基中可以存活。 單克隆抗體的制備過(guò)程：在細(xì)胞內(nèi)DNA合成一般有兩條途徑，主途徑是在細(xì)胞內(nèi)由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，而氨基喋呤可以阻斷此途徑。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤細(xì)胞的DNA合成沒(méi)有此輔助途徑。 在用HAT選擇培養(yǎng)12d內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，34d后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持710d后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維

5、持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿(mǎn)孔底1/10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每23d換一半培養(yǎng)液。單克隆抗體的制備過(guò)程：（1）天然抗原的制備；（2）免疫動(dòng)物的確定、免疫劑量及免疫次數(shù)的確定；（3）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備；（4）小鼠采血測(cè)定抗體效價(jià)；（5）小鼠脾細(xì)胞的制備及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備；（6）小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合；（7）陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選；（8）抗體的篩選；（9）陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞腹腔注射小鼠，大量制備單克隆抗體。單克隆抗體的制備過(guò)程：在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的

6、雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱(chēng)為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells）。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長(zhǎng)刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)條件；也可能是為了滿(mǎn)足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴(lài)性。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來(lái)源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。飼養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞密度過(guò)低不利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化飼養(yǎng)細(xì)胞：腹腔巨噬細(xì)胞或脾

7、細(xì)胞免疫脾細(xì)胞-漿母細(xì)胞，處于增殖狀態(tài)的B細(xì)胞。漿母細(xì)胞又稱(chēng)原漿細(xì)胞，為未成熟的漿細(xì)胞前體。 漿細(xì)胞：能夠合成和分泌免疫球蛋白的終末分化階段的B細(xì)胞。正常機(jī)體漿細(xì)胞存在在脾、淋巴結(jié)的相應(yīng)組織結(jié)構(gòu)處。 B淋巴細(xì)胞的增殖分化：原B細(xì)胞 前B細(xì)胞 不成熟B細(xì)胞 成熟B細(xì)胞出現(xiàn)膜型IgM出現(xiàn)IgM，IgD在骨髓中：抗原刺激漿母細(xì)胞（免疫脾細(xì)胞）漿細(xì)胞，存在時(shí)間短，2-3d分泌抗體記憶型B細(xì)胞，表達(dá)膜型Ig，存活幾周或幾個(gè)月抗原刺激較高水平免疫應(yīng)答高親和力識(shí)別抗原抗原刺激更高親和力注意免疫學(xué)相關(guān)知識(shí)：1、免疫小鼠的日齡及性別： SPF Balb/c小鼠 ，612周齡，體重為 1822g，雌 性（便于操作

8、），分成3組，每組4只 。2、免疫程序：一免，二免（15d），三免(29d)。3、免疫方式： 體內(nèi)免疫：免疫原性強(qiáng)、來(lái)源充分的抗原 體外免疫：免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起 免疫抑 制）的抗原。 體外免疫：將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。 其基本方法：取48 周齡BALB/c 小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌23次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原5ug/ml，細(xì)胞抗原105106 個(gè)細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c 小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；37 5%CO2 濃度下培養(yǎng)3

9、-5 天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。4、免疫途徑：最常用腹腔多點(diǎn)注射。常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹 腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者。5、免疫佐劑：首免，弗氏完全佐劑（油包水的乳濁 液，含有結(jié)合分枝桿菌的細(xì)胞壁成分）；等體積 二免、三免，弗氏不完全佐劑（不含結(jié)合分枝桿菌）。等體積注意免疫學(xué)相關(guān)知識(shí)：腹腔注射3、優(yōu)點(diǎn)（1）制備時(shí)不需純化抗原就可得到純抗體； （2）有很高的效價(jià) （3）有高度的單一性、均一性； （4）產(chǎn)量高，且可連續(xù)生產(chǎn) 。5、單克隆抗體的應(yīng)用（1）診斷試劑：用于各種病原體以及腫瘤的診斷。 避免了多克隆抗體的交

10、叉反應(yīng)（2）治療試劑：獸醫(yī)臨床上傳染病的治療；醫(yī)學(xué)臨床上抑制器官移植排斥、治療自身免疫疾病、制備生物導(dǎo)彈。（3）檢測(cè)試劑：各種病原體毒力因子的檢測(cè)；各種免疫細(xì)胞及其它組織細(xì)胞表面分子的檢測(cè)。（4）抗原純化：利用單克隆抗體的特異性，可將單克隆抗體與瓊脂糖等偶聯(lián)制成親和層析柱，可從混合組分中提取某種抗原成分。 制備疫苗“生物導(dǎo)彈”是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱(chēng)呼，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動(dòng)導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。 自1975年單克隆抗體雜交瘤技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中被廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷及治療。但目前絕

11、大數(shù)單克隆抗體是鼠源的，臨床重復(fù)給藥時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體，使臨床療效減弱或消失。因此，醫(yī)學(xué)臨床上最理想的單克隆抗體應(yīng)是人源的,但人-人雜交瘤技術(shù)目前尚未突破。第三節(jié) 基因工程抗體 目前較好的解決辦法是能研制基因工程抗體，以代替鼠源單克隆抗體用于臨床。基因工程抗體興起于80年代早期，是利用DNA重組技術(shù)，在分子水平對(duì)抗體基因進(jìn)行切割、拼接或修飾，或人工合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，從而產(chǎn)生的新型抗體，也稱(chēng)為第三代抗體。 研究成功的基因工程抗體有：嵌合抗體、重構(gòu)抗體、小分子抗體等。一、概念利用基因工程技術(shù)制備的抗體分子 。 按人類(lèi)設(shè)計(jì)所重新組裝的新型抗體分子，可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，

12、去除或減少無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)(如Fc片段)，從而可克服單克隆抗體在臨床應(yīng)用方面的缺陷(如鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)使用會(huì)引起抗體產(chǎn)生而降低其效果，F(xiàn)c片段的無(wú)效性和副作用)，更具有廣闊的應(yīng)用前景。二、特點(diǎn)嵌合抗體(chimeric antibody)是指在同一抗體分子中含有不同種屬來(lái)源抗體片段的抗體，又稱(chēng)雜種抗體。 重構(gòu)抗體 ：將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。 單鏈抗體(single-chain antibody)又稱(chēng)Fv分子，由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物(1inker)連接而成。

13、噬菌體抗體：將抗體可變區(qū)基因與編碼噬菌體外殼蛋白的基因融合而成的一種基因工程抗體 。催化抗體 (catalytic antibody) ： 也叫抗體酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。第四節(jié) 催化抗體一、催化抗體的概念 催化抗體(catalytic antibody)也叫抗體酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。 抗體制備技術(shù)的開(kāi)發(fā)預(yù)示著可以人為生產(chǎn)適應(yīng)各種用途的，特別是自然界不存在的高效的催化劑，對(duì)生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)藥等多種學(xué)科有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。二、催化抗體的制備 目前，催化抗體的制

14、備采用化學(xué)和免疫相結(jié)合的方法，首先模擬酶作用于底物時(shí)的過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)，化學(xué)合成相應(yīng)的類(lèi)似物，即半抗原，用以免疫動(dòng)物，再用單克隆技術(shù)，篩選獲得單克隆抗體。 對(duì)催化抗體的研究，開(kāi)創(chuàng)了一條人工設(shè)計(jì)酶的新途徑，為尋找新型、高效、高選擇性催化劑創(chuàng)造了條件。1、細(xì)胞融合法 首先通過(guò)化學(xué)反應(yīng)合成反應(yīng)物的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物（通常是半抗原），經(jīng)與載體蛋白偶聯(lián)，制成抗原免疫BALBc小鼠，應(yīng)用B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制針對(duì)該過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物的特異性單抗，亦即抗體酶。這種單抗與反應(yīng)物的過(guò)渡態(tài)結(jié)合降低了反應(yīng)的活化能，從而加速該反應(yīng)的進(jìn)行。2、抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法 抗體酶和酶一樣可用化學(xué)修飾法加以改造。對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一

15、種溫和的方法在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團(tuán)。游離巰基就是適合的基團(tuán)之一，它具有高親和性、易于氧化、及能通過(guò)二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。 3、引入輔助因子法 很多天然酶活性中心都含有金屬離子。將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵的選擇性水解，且通過(guò)羧酸根及仲胺基與金屬離子相連。將此半抗原通過(guò)共價(jià)鍵連接在載體蛋白上免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵。 4、基因工程抗體技術(shù) 該技術(shù)在抗體酶制備中具有誘人的前景。應(yīng)用噬菌體抗體展示技術(shù)或全套抗體基因庫(kù)，并輔以計(jì)算機(jī)模擬，為篩選特定目的高效催化抗體提

16、供了豐富的資源和技術(shù)支撐。三、催化抗體的應(yīng)用1、抗體酶為切割蛋白質(zhì)和核酸提供一系列特異性高的工具，為疾病的治療和預(yù)防開(kāi)辟新途徑。 2、抗體酶在戒毒方面亦有重要應(yīng)用價(jià)值。 用病毒特異蛋白質(zhì)片段的過(guò)渡態(tài)模擬物免疫動(dòng)物，產(chǎn)生能特異水解病毒蛋白質(zhì)的抗體酶，使病毒無(wú)法繁殖。 抗體介導(dǎo)前藥治療(ADEPT)技術(shù)，即將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專(zhuān)一性抗體相偶聯(lián)，這樣酶就會(huì)通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細(xì)胞的表面 。特異性結(jié)合到與腫瘤相關(guān)的抗體可以使相關(guān)的酶聚集在腫瘤細(xì)胞附近。當(dāng)人體服用含有毒性的前體藥物時(shí)，前藥只有在腫瘤細(xì)胞附近才被相關(guān)的酶催化激活，從而可以最低量的限制藥物的毒性。阻斷可卡因、鴉片和受體的結(jié)合。 應(yīng)用其可以克服抗癌藥物的一些非特異性毒性。特異性結(jié)合到與腫瘤相關(guān)的抗體可以使相關(guān)的酶聚集在腫瘤細(xì)胞附近。當(dāng)人體服用含有毒性的前體藥物時(shí)，前藥只有在腫瘤細(xì)胞附近才被相關(guān)的酶催化激活，從而可以最低量的限制藥物的毒性。應(yīng)用其可以克服抗癌藥物的一些非特異性毒性。特異性結(jié)合到與腫瘤相關(guān)的抗體可以使相關(guān)的酶聚集在腫瘤細(xì)胞附近。當(dāng)人體服用含有毒性的前體藥物時(shí)，前藥只有在腫瘤細(xì)胞附近才被相關(guān)的酶催化激活，從而可以最低量的限制藥物的毒性。應(yīng)用其可以克服抗癌藥物的一些非特異性毒性。特異性結(jié)合到與腫瘤相關(guān)的抗體可以使相關(guān)的酶聚集在腫瘤細(xì)胞附近。當(dāng)