植物病原物的抗藥性

1、何謂植物病原物的抗藥性?是指野生敏感的植物病原物個體或群體，在某種藥劑選擇壓力下出現(xiàn)敏感性顯 著下降的現(xiàn)象，也是使某種生命在自然界延續(xù)的一種生物進化的表現(xiàn)。聯(lián)合國糧農(nóng) 組織有害生物抗藥性專家組認(rèn)為，“抗藥性”術(shù)語包含兩個方面函義，一是病原物 遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，抗藥性狀可穩(wěn)定遺傳；二是抗藥突變體對環(huán)境有一定的適合度 （Fitness），即抗藥群體具有與敏感群體類似的生存競爭力。早期有人提出的“耐 藥性”和“不敏感性”術(shù)語，詞義含糊，不宜使用。植物病原物抗藥性發(fā)生現(xiàn)狀如何？當(dāng)在病原物群體中存在潛在的抗藥基因時，在藥劑選擇壓力下便會在自然界出 現(xiàn)抗藥性。目前已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗藥性的病原物種類有植物病原真菌

2、，細(xì)菌和線蟲。其 它病原物的化學(xué)防治水平還很低，有些甚至還缺乏有效的化學(xué)防治手段，故至今在 類菌原體，病毒，類立克次體及寄生性種子植物中還沒有發(fā)生抗藥性問題。最常見的是植物病原真菌的抗藥性。因為隨著植物病理學(xué)和農(nóng)藥科學(xué)的發(fā)展， 先后應(yīng)用于植物真菌病害化學(xué)防治的殺真菌劑已達(dá)數(shù)百種之多。已知植物病原真菌 產(chǎn)生抗藥性的有鞭毛菌亞門，子囊菌亞門，擔(dān)子菌亞門和半知菌亞門的數(shù)百種真菌。 產(chǎn)生抗藥性的殺真菌劑有苯并咪唑類，硫逐磷酸脂類，苯酰胺類，羧酰替苯胺類， 羥基嘧啶類，腫丁胺和麥角甾醇生物合成抑制劑類等內(nèi)吸性殺菌劑，和多果定，取 代苯類，二甲酰亞胺類等保護性殺菌劑，以及春日霉素，滅瘟素S，抗霉素A，多

3、氧霉素類，匹馬菌素，放線菌酮等抗菌素類化合物。實際上人們常說的殺菌劑抗性 主要就是指殺真菌劑抗藥性。植物病原細(xì)菌的抗藥性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如真菌抗藥性重要，因為可用于防治植物病原細(xì) 菌的殺細(xì)菌劑種類較少，用藥水平較低。但是細(xì)菌繁殖速度快，數(shù)量大，容易發(fā)生 變異，只要經(jīng)常使用殺細(xì)菌劑便會發(fā)生抗藥性，例如鏈霉素和土霉素使用不久，梨 火疫病菌就產(chǎn)生了抗藥性。在用噻枯唑水平較高的安徽和縣，也發(fā)現(xiàn)水稻白葉枯病 菌在田間已存在抗藥性。由于植物線蟲病的化學(xué)防治水平還很低，而且線蟲繁殖速率一般也較真菌和細(xì) 菌慢，以及傳播方式的局限性等，至今只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)線蟲產(chǎn)生抗藥性的事例。如使 用呋喃丹4 5年之后，玉米地的一種線蟲（D

4、aratylenchus seribnexi）種群降低了 對呋喃丹殺線蟲劑的敏感性。病菌產(chǎn)生抗藥性的生化機制有哪些？已知一些殺菌劑是干擾真菌生物合成過程（如核酸，蛋白質(zhì)，麥角甾醇，幾丁 質(zhì)等的合成），呼吸作用，生物膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核功能的?；饔梦稽c化合物。真菌 只要發(fā)生單基因或少數(shù)寡基因突變就可以導(dǎo)致靶點結(jié)構(gòu)的改變，而降低對?；运?劑的親和性。雖然真菌不可能同時發(fā)生多基因的變異，而降低與多作用位點化合物的親合性，但是菌體代謝可以發(fā)生某種變化，阻止藥劑到達(dá)作用位點，或者將藥劑 轉(zhuǎn)化成非毒性化合物，或者減少對藥劑的吸收，或者增加排泄，減少藥劑在菌體細(xì) 胞內(nèi)的積累等而表現(xiàn)抗藥性。降低親和性這是病菌產(chǎn)

5、生抗藥性最重要的生化機制。如常用的苯并咪唑類， 苯酰胺類，羧崛酰替苯胺類殺菌劑及春雷霉素等抗菌素的抗性，就分別因它們相應(yīng) 的作用靶點？一微管蛋白，mRNA聚合酶，琥珀酸一輔酶Q還原酶復(fù)合體和核糖體組 成發(fā)生改變，降低了藥劑與這些靶點的親和性而表現(xiàn)抗藥性。減少吸收或增加排泄真菌細(xì)胞可以通過某些代謝變化，妨礙足夠量的殺菌劑 通過細(xì)胞膜而到達(dá)作用靶點，或者利用生物能量將已進入細(xì)胞內(nèi)的藥劑立即排出體 外，阻止藥劑積累而表現(xiàn)抗藥性。如梨黑斑交鏈孢霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可發(fā)生改變，阻止 多氧霉素D到達(dá)作用部位發(fā)揮對幾丁質(zhì)合成酶的毒力；稻梨孢可減少對稻瘟素S的 吸收，降低對菌體蛋白質(zhì)合成的影響；構(gòu)巢曲霉抗藥突變體能利

6、用生物能量將進入 菌體內(nèi)的氯苯嘧啶醇排出體外。增加解毒或降低致死合成解毒作用作為病菌產(chǎn)生抗藥性機制的事例很少，遠(yuǎn) 不如害蟲重要。病菌細(xì)胞的生化代謝過程可能通過某些變異，將有毒的殺菌劑轉(zhuǎn)化 成無毒化合物，或者在藥劑到達(dá)作用位點之前就與細(xì)胞內(nèi)其它生化成分結(jié)合鈍化。 例如稻梨孢對異稻瘟凈的中等水平抗藥性是由于菌體本身能將異稻瘟凈分子的“S 一C”鍵斷裂，形成非毒性化合物。定菌磷和6 一氮雜尿嘧啶本身對真菌幾乎沒有 毒性，抗藥真菌不能象敏感菌那樣將它們分別轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)“ 0 一羥崛基一5 一 甲基一6一乙氧羰基毗唑并（/，5 a）嘧啶和6N一雜尿核苷一5 一磷酸”。補償作用或改變代謝途徑 病菌細(xì)胞可

7、以改變某些生理代謝，使藥劑的抑制作 用得到補償，如增加藥劑靶點酶的產(chǎn)量。當(dāng)藥劑阻止了正常的代謝途徑時，生物體 也可能增加替代的代謝途徑，維持正常的生命活動，最終表現(xiàn)對藥劑的敏感性下降。不同類型化合物的作用機制往往不同，因此病原物對不同藥劑產(chǎn)生抗藥性的生 化機制也不一樣。甚至有時不同病菌對同種藥劑產(chǎn)生抗藥性的機制也不同。如灰霉 等大部分真菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗性是由于菌體內(nèi)？一微管蛋白與藥劑親和性 下降，而擲孢酵母菌（Sporobolomyces roseUs對這類藥劑的抗性機制則是由于菌體 膜透性改變減少了對藥劑的吸收。病菌的抗藥性狀與遺傳背景有何關(guān)系？病菌的抗藥性狀是由遺傳基因決定的?？顾?/p>

8、基因可能存在于細(xì)胞核中的染色體上， 或存在于細(xì)胞質(zhì)中，這可通過它們的無性，全無性和有性繁殖過程中的遺傳方式來 鑒別。核基因通常表現(xiàn)為典型的孟德爾有性雜交雙親遺傳規(guī)律，而細(xì)胞質(zhì)基因則表 現(xiàn)為單親的遺傳。已知絕大多數(shù)抗藥基因位于細(xì)胞核中的染色體上，多數(shù)情況下每個基因只有一 個副本，只轉(zhuǎn)錄和翻譯一種多肽?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的減數(shù)分裂技術(shù)或者用分子生物學(xué) 方法，包括克隆DNA片斷及整個染色體的雜交等方法，將抗藥基因定位在染色體 上其它有關(guān)基因的相應(yīng)位置上。病菌對某種殺菌劑的抗藥性是由一個主基因控制的稱為單基因抗藥性，該基因 的每一個等位基因的突變均能表達(dá)對藥劑抗性質(zhì)的變化。已知目前病菌對殺菌劑的 抗性大多數(shù)

9、都屬于單基因控制的質(zhì)量遺傳性狀。同一基因的不同突變體，可能對同 種藥劑表現(xiàn)不同的抗藥水平，這就是多等位基因抗藥性。病菌細(xì)胞中可能有幾個主 基因可以決定對一種藥劑的抗性，只要其中任何一個基因發(fā)生突變即可表達(dá)抗藥的 質(zhì)量性狀，這就是寡基因抗藥性。這種情況下菌體細(xì)胞中也可能同時發(fā)生一個以上 的主基因突變，而且它們可能相互作用，表現(xiàn)型不同于單基因突變體，但通常一個 崛突變基因?qū)α硪粋€突變基因具有上位顯性作用，表現(xiàn)與單突變體相同的抗藥水平。 與敏感菌株等位基因相比，每個突變基因可能表現(xiàn)為完全或不完全顯性，或完全或 不完全隱性。大多數(shù)子囊菌，擔(dān)子菌和半知菌的致病階段是單倍體階段，決定抗藥 性的基因無論是顯

10、性，半顯性，還是隱性基因，均能表達(dá)抗藥性。當(dāng)同一菌體中存 在等位的敏感基因和抗藥突變基因時（雙倍體），菌體表現(xiàn)型可能是抗藥或敏感。 如卵菌及其它雙倍體階段致病真菌，只有當(dāng)控制抗性的基因是顯性時，或隱性基因 的純合體才能表達(dá)抗藥性。主基因或寡基因控制的抗藥性，抗藥水平往往很高，抗， 感菌株雜交后代對藥劑的敏感性表現(xiàn)為抗藥和敏感不連續(xù)的孟德爾遺傳分離規(guī)律。 當(dāng)病原群體中存在抗藥基因時，連續(xù)保持藥劑的選擇壓力，抗藥群體可能在短時間 內(nèi)形成，表現(xiàn)化學(xué)防治突然失效。即使增加用藥量和用藥次數(shù)也不能改善防治效果。 使病原菌表現(xiàn)質(zhì)量遺傳抗藥性狀的殺菌劑有苯并咪唑類，苯酰胺類，羧酰替苯胺類， 二甲酰亞胺類，春日

11、霉素，鏈霉素及有關(guān)含銅化合物。已知一些病菌對少數(shù)殺菌劑的抗藥性是由許多微效基因的突變引起的，這些微 效基因可以相互累加，使抗藥水平顯著增加，這就是多（聚）基因抗藥性?？顾幣c 敏感菌株的雜交后代中不同基因型組別重疊，對藥劑的抗性水平差異是連續(xù)的，表 現(xiàn)為數(shù)量遺傳。即使在藥劑的長期選擇壓崛力下，病原群體的敏感性仍然保持連續(xù) 分布，只是整個分布向降低敏感性，增加抗藥水平的方向數(shù)量移動。不同年份測量 的病原群體EC50值可以對這種群體敏感性變化進行定量分析。藥劑防效隨著病原群 體抗藥水平增加0而下降，但很少表現(xiàn)完全失敗。雖然增加用藥量或縮短用藥周期可 以提高防效，但會增加抗性水平提高的選擇壓力。使病菌

12、表現(xiàn)數(shù)量遺傳抗藥性狀的 化合物有多果定，放線菌酮，三唑醇，三唑酮等麥角甾醇生物合成抑制劑。病菌的殺菌劑抗性基因還可能存在于細(xì)胞質(zhì)中的線粒體，質(zhì)?；虿《痉肿由?。 已知通過菌體線粒體DNA突變，可以獲得對氯霉素，放線菌酮，寡霉素，鏈霉素 等抗菌素的抗藥性。但是實際情況下，對抗菌素的抗藥基因似乎很少位于線粒體或 核染色體上，主要是存在于游離體，質(zhì)?；虿《旧?。絲狀真菌的多核菌絲可能是異核的，即同一細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核不具有遺傳同一性。 異核體的不同細(xì)胞核可能包含對某種殺菌劑抗藥和敏感的等位基因。它們能表達(dá)各 自控制的性狀，在有藥或無藥條件下均能生長正常，但隨著藥劑選擇壓力的變化， 菌體內(nèi)抗藥和敏感的細(xì)胞比例

13、可能會發(fā)生改變。病菌抗藥基因往往具有多效作用，即基因發(fā)生抗藥突變，也可能同時引起其它 表現(xiàn)型特征的變化。如控制二甲酰亞胺類殺菌劑抗性的高抗基因，通常會引起菌體 對培養(yǎng)基高滲透壓的超敏感，制霉菌素抗藥基因及三唑醇抗藥基因還會引起菌體生 長減慢，產(chǎn)孢減少。異稻瘟凈抗藥基因可引起致病力下降等。病菌對一些殺菌劑產(chǎn) 生抗藥突變，還常會對同類型的化合物產(chǎn)生交互抗藥性或負(fù)交互抗藥性。了解抗藥 基因的多效性，對于合理設(shè)計抗藥性治理策略具有重要意義。監(jiān)測殺菌劑抗性的目的是什么？殺菌劑抗性監(jiān)測就是指測定田間植物病原菌群體對藥劑敏感性的變化。包括在 各地定點連年系統(tǒng)測定和對有抗藥性懷疑的地方臨時采集測定兩種監(jiān)測方法

14、。雖然 抗藥性監(jiān)測是殺菌劑抗藥性研究的基礎(chǔ)，但抗藥性監(jiān)測的最主要的目的有下面5點：（1）證實藥效下降是否是由于抗藥性引起的。可能導(dǎo)致藥劑對目標(biāo)生物的防治效果 下降的原因比較復(fù)雜，除目標(biāo)生物可能發(fā)生了抗藥性以外，還可能是由于藥劑質(zhì)量 不符合標(biāo)準(zhǔn)、使用時期和方法不恰當(dāng)，使用的藥劑品種或劑量不正確以及不正常的 環(huán)境條件等。（2）監(jiān)測抗藥病原群體發(fā)展動態(tài)，預(yù)測抗藥性發(fā)生和危害。在病原群體中，抗藥菌 株的比例較低時，藥劑一般不表現(xiàn)效果下降，在抗藥菌株頻率為1%以下時，即使通 過常規(guī)的抗藥性監(jiān)測也很難發(fā)現(xiàn)抗藥性的存在，因此，在殺菌劑抗性發(fā)展的初期， 往往被人們所忽視。然而，病原物的繁殖、傳播速度一般都很快

15、，而它們在自然界 存在的數(shù)量又是極大的，當(dāng)群體中存在低頻率抗藥菌株時，再經(jīng)過少數(shù)幾次藥劑選 擇，抗藥性病原亞群體就可能很快成為致病病原群體中的主體，造成突發(fā)性的抗藥 性病害流行。通過監(jiān)測在抗藥性發(fā)生的早期就可預(yù)測抗藥病原群體的發(fā)展趨勢和速 度，及時儲備和選用適當(dāng)?shù)乃巹┢贩N資源，爭取避免某些藥劑的突然失效而造成生 產(chǎn)損失。對于那些在一個生長季節(jié)只繁殖12代的病原菌，或者表現(xiàn)數(shù)量遺傳性狀 的抗藥性，通過監(jiān)測可以在抗藥性發(fā)生初期及時改變防治策略和用藥方法，最大限 度地阻止抗藥性發(fā)展和蔓延，延長現(xiàn)有藥劑的使用壽命。（3）證實是否實施了抗藥性治理策略。為了避免一些重要植物病害發(fā)生抗藥性，或 保持骨干藥劑

16、的使用壽命，迫使有關(guān)部門強制性地實施抗藥性治理策略。監(jiān)測抗藥 性病原群體動態(tài)變化，可以核實某地是否實施了抗藥性治理策略。（4）評估抗藥性治理策略的有效性。在設(shè)計的抗藥性治理策略實施以后，通過進一 步的抗藥性監(jiān)測，可以驗證該策略實施以后的效果，便于及時修改和完善抗性治理 策略，使其更具科學(xué)性和實用性。（5）指導(dǎo)生產(chǎn)部門用藥。監(jiān)測某地病原群體發(fā)生抗藥性的狀況和測定交互抗藥性類 型，可以指導(dǎo)該地選用適當(dāng)?shù)乃巹┢贩N和防治措施。用于抗藥性監(jiān)測的病原菌材料采集和分離的原則是什么？為了監(jiān)測病菌的抗藥性，病菌材料的采集和分離可以用植物病理學(xué)的一般方法 進行。但是，應(yīng)該注意的是，分離時還要避免接觸標(biāo)本上原來在田

17、間處理過的殘留 殺菌劑。使用的病菌材料應(yīng)該盡可能是遺傳性一致的純系菌株，最好選用單核單倍 體單胞繁殖材料，用于測試的病菌還必須是從田間采集的病害標(biāo)本上剛剛分離下來 的材料。采集標(biāo)本時應(yīng)分別單獨放入塑料袋或袋中，防止交互污染。如標(biāo)本采集暫 時不能測定，則應(yīng)置于低溫下保存，直至測試前分離，因為有的病菌存放時間過長， 原有抗性就會喪失或抗性程度會下降。采集和測定某一病菌的標(biāo)本數(shù)量，則隨測試 目的的不同而異。如果證實某藥劑防治失效是否是由于病原菌產(chǎn)生抗性，就只需要從防治水平高，發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)或田間采集幾個標(biāo)本進行測定即可。要想了解某地 區(qū)病原群體中抗性發(fā)生的大致情況，只要測定1020個隨機樣本；如果還

18、不知道病 原群體中產(chǎn)生抗性的情況，企圖在群體內(nèi)能夠檢測到抗藥性，那么需要測定的病斑 或病株合理基數(shù)應(yīng)該達(dá)100個。據(jù)估計，如果自然群體中有1%的菌株具有抗性，那 么測定這一比例的1%和5%的顯著水平，需要采集458個和298個標(biāo)本；如果群體中 有10%的菌株具有抗性，則達(dá)測定這一比例的顯著水平只需要采集8個標(biāo)本就足夠。在抗藥性測定時如何配制和使用殺菌劑？市售殺菌劑只能用于田間植株的抗性研究，而要想在人工培養(yǎng)基上能準(zhǔn)確測定 真菌對藥劑的敏感性，則應(yīng)盡可能使用純的殺菌劑，一般要求有效成分含量在98% 以上，抗菌素有效成分在80%以上。因為采用市售的制劑其中可能含有其他組分影 響結(jié)果的準(zhǔn)確性。大部分

19、殺菌劑的低水溶性是抗性測定中產(chǎn)生誤差的最常見原因之一。一般來說， 不溶的有效成分是沒有活性的，因為培養(yǎng)基中殺菌劑濃度增加到超過溶解度時，即 使活性有所提高也不能反映隨濃度增加的效應(yīng)比關(guān)系。真菌對藥劑的吸收積累，會 使培養(yǎng)基未溶的部分藥劑逐漸溶解活化，以這種方式活化的量是很難估計的。一般 方法是先用適當(dāng)?shù)娜軇┡涑蓺⒕鷦┠敢?，然后將少量的殺菌劑母液加水稀釋后加?培養(yǎng)皿內(nèi)與培養(yǎng)基混合。苯并咪唑類、二甲酰亞胺類和抑制甾醇生物合成的殺菌劑 對熱穩(wěn)定，也可在滅菌前加到培養(yǎng)基中。由于大部分有機溶劑是有毒的，因此培養(yǎng) 基內(nèi)溶劑最終的含量通常不超過2%，而且對照培養(yǎng)基也應(yīng)加入同樣量的溶劑。而 在寄主活體上實驗

20、時，有機溶劑的含量不超過1% （V： V），否則會對寄主產(chǎn)生毒 性。怎樣鑒別和分析病菌對殺菌劑的抗性？在測定某種病菌各菌株對殺菌劑不同濃度的效應(yīng)后，如何進一步鑒別和評估它 們的抗藥性？常用的標(biāo)準(zhǔn)有3種:第一種是用同一濃度測定各菌株對殺菌劑的反應(yīng)； 第二種是測定最低抑制濃度；第三種是測定產(chǎn)生相同效應(yīng)的濃度，如抑制菌體生長 發(fā)育或致病50%的有效濃度（EC ）。第一種標(biāo)準(zhǔn)常常會過高地評估抗藥性水平或抗 藥程度，因為病菌對同一劑量的效應(yīng)有時差異很大，這需要設(shè)計對某種病菌的效應(yīng) 差異較小的測定方法。第二種標(biāo)準(zhǔn)也有缺陷，因為有的菌株抗藥性水平很高，如灰 霉菌（Botrytis cineei多菌靈的抗藥性

21、，難以用最低抑制濃度來評估抗藥性水平， 有些殺菌劑即使在很高濃度下也不能完全抑制菌體生長，就不能采用這種分析標(biāo)準(zhǔn)。 但灰霉野生菌株對多菌靈特別敏感，亦可用最低抑制濃度作為鑒別抗藥和敏感菌株 的標(biāo)準(zhǔn)。采用第三種分析標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)殺菌劑的劑量與抑制菌體生長發(fā)育的效應(yīng)關(guān)系， 得出劑量與生長抑制率之間的回歸方程，然后根據(jù)對測定菌株和標(biāo)準(zhǔn)野生菌株的相 同抑制生長發(fā)育百分率的藥劑濃度的比較，鑒別抗藥菌株并分析抗藥性水平。有些 病菌對某些藥劑的抗藥性是由多個微效基因決定的，表現(xiàn)出數(shù)量遺傳性狀，雖很難 評估某一菌株的抗藥性水平，但可以通過測定某地區(qū)用藥前病原群體（一般需測100 個菌株）對藥劑的敏感性分布，用藥后

22、再測定病原群體的敏感性，由此可根據(jù)平均 EC之比來評估某一地區(qū)病原群體的抗藥性水平。殺菌劑抗性監(jiān)測主要有哪些方法？最常用的方法是菌落直徑法，即在含有系列濃度殺菌劑培養(yǎng)基上測量藥劑對菌 落線性增長速率的效應(yīng)。但并不能完全反映藥劑對菌體生長的效應(yīng)，如氣生菌絲的 生長和菌落密度往往有差異。采用干重法，測量在含藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體 干重增長速率，能夠準(zhǔn)確反映殺菌劑對菌體生長的抑制作用，不過這種方法比較繁 瑣，工作量大。當(dāng)病菌以孢子繁殖生長時，亦可采用簡便的濁度法，即采用濁度儀 測量含藥培養(yǎng)液的渾濁度增加，若采用分光光度計測定，培養(yǎng)基中化學(xué)成分對光譜 的吸收，會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用臨界劑量或鑒別

23、劑量是檢測和測量抗藥性廣度的常用方法，即在含有完全 能抑制野生敏感菌株生長的殺菌劑濃度的培養(yǎng)基上，涂抹病菌混合孢子或其他繁殖 體，進行適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)后，檢查病菌的生長情況，計算抗藥性菌株的出現(xiàn)頻率。采用孢子萌發(fā)法也可測定藥劑對不同菌株孢子萌發(fā)的抑制率來鑒別抗藥性，但 是應(yīng)該注意到許多內(nèi)吸性殺菌劑并不阻止孢子萌發(fā)，這時應(yīng)考慮其對芽管形態(tài)和進 一步發(fā)育的作用。已知有些殺菌劑對菌體的呼吸作用或生物合成過程等生命過程有顯著抑制作 用，可以從不同殺菌劑濃度對這些過程影響程度的差異來比較不同菌株的敏感性。目前對已知抗藥性分子遺傳機制的真菌抗藥性監(jiān)測，還可采用分子生物學(xué)技術(shù)。把病菌接種到經(jīng)殺菌劑處理過的植株或部

24、分組織上，這種活體測定方法不僅是 測定專性寄生菌抗藥性的唯一方法，能夠驗證病菌在培養(yǎng)基上對藥劑敏感性表現(xiàn)的 差異，也是檢測殺菌劑能否在寄主上體現(xiàn)其藥效的必要方法。例如，麥角甾醇生物 合成抑制劑和二甲酰亞胺類殺菌劑在離體條件下，很容易引起真菌抗性突變，但這 些突變體對寄主的致病性也常常隨之降低。此外，在培養(yǎng)基上能對噻枯唑表現(xiàn)抗藥 性的水稻白葉枯病菌，則失去了致病能力，而在經(jīng)噻枯唑、敵枯唑等處理的水稻上 表現(xiàn)抗性的菌株，在培養(yǎng)基上反而不表現(xiàn)抗藥性。一種病原菌對某一殺菌劑的敏感性還常常隨著個體的遺傳差異、培養(yǎng)基組分、 瓊脂的質(zhì)量、溫度、pH值、測試環(huán)境和方法的不一致而有變化。如在含乙磷鋁的PDA 培

25、養(yǎng)基上疫霉的生長幾乎不受影響，但在不含磷酸鹽的合成培養(yǎng)基上，這種真菌對 藥劑則變得敏感；測定真菌對甲氧丙烯酸酯類殺菌劑敏感性時，培養(yǎng)基中的可酵解 糖會有拮抗作用。因此，某種“藥劑一病菌”組合的抗藥性測定，不但要選用適當(dāng) 的方法和條件進行，而且被懷疑有抗藥性的菌株也必須用測得敏感性基線同樣的方 法和條件進行各種測試，且最好在所有抗藥性測定中均包含有一個已知敏感的參考 菌株。病菌抗藥性有哪些發(fā)展階段?病菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的廣度不同，分為實驗室抗藥性、田間抗藥性和實 際抗藥性3個發(fā)展階段。也有文獻(xiàn)將田間抗藥性和實際抗藥性統(tǒng)稱為大田抗藥 性。實驗室抗藥性是指病菌僅僅在室內(nèi)通過藥劑篩選、物理和化學(xué)等方

26、法誘變和 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等分子生物學(xué)技術(shù)獲得抗藥性。病菌細(xì)胞群體通常情況下存在著10-4 10-10的抗藥性突變，通過藥劑處理可以提高突變頻率。在藥劑存在的條件下，大 部分敏感菌生長受到抑制，少數(shù)抗藥性突變體通過選擇存活下來。有些殺菌劑本 身也具有誘變劑的作用，處理病菌后增加抗藥性突變頻率。實驗室抗藥性研究， 新殺菌劑大量推廣之前，對于了解目標(biāo)病原物在實驗室內(nèi)發(fā)生抗藥性變異的難異 程度，并可利用抗藥突變體研究抗藥水平和適合度等，這對評估該藥發(fā)生抗性的 潛在危險和及早采取對策具有指導(dǎo)意義。但實驗室的研究結(jié)果，并不完全反映生 產(chǎn)實際。田間抗藥性是指在田間用藥后能監(jiān)測或檢測到的抗藥病原菌。此時抗藥病原 菌

27、在群體中的比例還很低，化學(xué)防治仍然有效，直觀上還不能發(fā)現(xiàn)已產(chǎn)生抗藥性， 對于那些抗藥性由單基因控制，表現(xiàn)質(zhì)量遺傳性狀和適合度較高以及繁殖力強的 病原菌來說，這時候設(shè)計和實施抗藥性治理策略已經(jīng)為時太晚，因為再使用幾次 藥劑以后抗藥病菌就會很快形成優(yōu)勢群體，導(dǎo)致防治突然失敗。如果抗藥性是由 多基因控制的，表現(xiàn)數(shù)量遺傳特點，對這類病原菌來說，此時立即采用合理的抗 藥性治理策略，不使藥劑突然失敗，還可延長藥劑的使用壽命。實際抗藥性是指生產(chǎn)上已可見的抗藥性，即自然界病菌抗藥亞群體已成為致病 主體，這時群體抗藥水平已相當(dāng)高，正常的化學(xué)防治明顯失效。生產(chǎn)上一般所講 的抗藥性，實際上就是指實際抗藥性。由此可見

28、，在病菌抗藥性發(fā)生過程中的3 個階段，我們所面臨的任務(wù)是不同的。苯并咪唑類殺菌劑的抗菌機理與抗藥性發(fā)生有何關(guān)系？植物病原真菌容易對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，這與藥劑具有共同的?；饔脵C理有關(guān)。苯菌靈和托布津類藥劑最初對真菌的毒力作用，并不是它們分 子結(jié)構(gòu)本身，而是共同的衍生物多菌靈(MBC )或它的乙基同系物乙基多菌靈 (EBC)，這種分子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變可以在水溶液中自發(fā)進行。苯菌靈在水中轉(zhuǎn)化的 速度很快，1小時內(nèi)約可轉(zhuǎn)化50%；而托布津類分子結(jié)構(gòu)在水中幾乎不能轉(zhuǎn)化， 但進入動植物和真菌體內(nèi)以后，在生理代謝作用下則很快轉(zhuǎn)化成多菌靈。因此， 托布津殺菌劑在離體條件下的抗菌活性一般低于多菌靈。由于這

29、幾類藥劑是以類 似的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗菌活性的，因此它們具有相同的作用機理和抗菌譜?？?藥性真菌也往往對這類化合物的不同藥劑具有正交互抗藥性。值得注意的是苯菌 靈在轉(zhuǎn)化成多菌靈的同時，還釋放一種異丁氰酸脂，這是一種強烈的呼吸作用抑 制劑，對些病原菌的角質(zhì)酶也有抑制作用。因此，在較高濃度下，苯菌靈對孢子 萌發(fā)也有抑制作用。某些真菌由于對異丁氤酸脂特別敏感，所以對多菌靈不表現(xiàn) 交互抗藥性。由于苯并咪唑類殺菌劑具有高效、廣譜、內(nèi)吸、選擇性強等顯著優(yōu)點，尤其 是一些用于防治腫瘤的試驗，吸引了許多科學(xué)家對這類化合物的藥理進行了深入 細(xì)致的研究。試驗表明，苯并咪唑類殺菌劑對孢子萌發(fā)沒有抑制作用，但對孢子

30、萌發(fā)后的芽管發(fā)育和菌絲形成有強烈的抑制作用，表現(xiàn)為芽管腫脹、畸形，菌絲 生長受抑制。用多菌靈處理Fusarium acuminatum后，菌絲頂端細(xì)胞的微管消失， 線粒體紊亂，有絲分裂在中期停止細(xì)胞分裂進程受阻，以全有時出現(xiàn)四倍體。多 菌靈的這種細(xì)胞毒理現(xiàn)象與秋水仙素極為相似，它束縛微管蛋白而使紡錘體不能 形成，最終抑制有絲分裂。Davids等研究表明，多菌靈對Aspergillus nidulans不同突變體的毒力大小與 藥劑對真菌體內(nèi)微管蛋白的親和性密切相關(guān)，對動植物低毒及對Alternaria真菌 沒有活性，就是由于多菌靈幾乎不能束縛這些生物細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白。用1C-多菌靈處理細(xì)胞提取物

31、的研究證明，多菌靈主要是束縛真菌細(xì)胞內(nèi)p - 微管蛋白，使其不能與a-微管蛋白一起組成微管。微管在細(xì)胞分裂過程中形成 紡錘絲，并由Y -微管蛋白與紡錘體頂端相連，在染色體分離過程中起重要作用。 此外，微管與肌蛋白纖維及中間體都是真核細(xì)胞骨架的主要成分。因此，苯并咪 唑類殺菌劑除抑制真菌細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂外，對生物分子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，細(xì) 胞器及細(xì)胞形態(tài)等也有破壞作用。苯并咪唑類殺菌劑固定真菌體內(nèi)P -微管蛋白 的單一作用機理，使得真菌只要編碼微管蛋白的單基因位點發(fā)生變易，改變P- 微管蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)，即可喪失或降低與藥劑的親和性；或者變異的P -微管蛋 白與a -微管蛋白裝配成的微管極度穩(wěn)定，那

32、么在藥劑存在的情況下也不會解 體，它們?nèi)匀荒鼙３终５纳砉δ?。苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性現(xiàn)狀及特點如何？苯并咪唑類殺菌劑是指含有苯并咪唑的分子結(jié)構(gòu)或通過生物體轉(zhuǎn)化成具有苯 并咪唑雜環(huán)分子結(jié)構(gòu)的化合物。常見的有苯菌靈、多菌靈、噻菌靈、麥穗靈和托 布津等多種殺菌劑品種。它們具有類似的抗菌活性和抗菌譜，對真菌的作用主要 是固定菌株細(xì)胞內(nèi)的P -微管蛋白，阻止正常的細(xì)胞分裂。我國雖然植物病害化學(xué)防治水平較低，殺菌劑抗藥性問題研究較少，但也先后 報道了多菌靈、甲基托布津等在某些地區(qū)因抗藥性問題已失去了對果、菜灰霉病、 水稻惡苗病、柑橘青霉和綠霉病、梨黑星病和甜菜褐斑病的防治效果。小麥赤霉 病、棉花炭疽病

33、等也出現(xiàn)較嚴(yán)重的田間抗藥性問題。還有些植物病害，如蘆筍莖 枯病、葡萄灰霉病、蔬菜根腐病等也反映多菌靈、甲基托布津的防治效果下降。植物病原真菌對苯并咪唑類殺菌劑發(fā)生抗藥性的變異頻率及抗藥性群體發(fā)展 速度，與真菌的遺傳背景、病害類型及選擇壓力有關(guān)。許多研究表明，用苯菌靈 澆灌防治大麗輪枝孢引起的草莓黃萎病1年，溫室噴霧防治灰霉病和甜菜褐斑病 6-7次，就能檢測到抗藥性菌株。一般認(rèn)為用多菌靈或甲基托布津防治梨、蘋果 黑星病，處理稻種防治惡苗病，噴霧防治葡萄、蔬菜和草莓灰霉病3-5年，就會 因抗藥性而失效或防治效果下降。雖然，大多數(shù)苯并咪唑類殺菌劑靶標(biāo)病原菌產(chǎn)生了抗藥性，而且有些病菌抗藥 性群體形成速

34、度也很快，威脅著這類藥劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的有效使用。但是，應(yīng)該 指出的是，并不是所有病原真菌都會產(chǎn)生抗藥性。真菌是否產(chǎn)生抗藥性及抗藥性 群體發(fā)展快慢如何，取決于真菌的生物學(xué)特性及其導(dǎo)致病害的類型和藥劑的選擇 壓力。在果園施用多菌靈防治真菌病害，可以很快引起蘋果和梨黑星病菌的抗藥 性，導(dǎo)致防治失敗，而在相同的果園里則并未發(fā)現(xiàn)引起蘋果銹病的 Gymnosporangium yamadai產(chǎn)生抗藥性，這是因為該病菌在蘋果樹上沒有夏孢子 的重復(fù)侵染，即使發(fā)生少數(shù)抗藥性變異，也不能在藥劑選擇壓力下繁殖和侵染。 英國使用多菌靈或苯菌靈防治大麥云紋斑病，我國使用多菌靈防治小麥赤霉病， 也幾乎是在用藥20年后，才開始發(fā)現(xiàn)田間抗藥性的。這可能是病菌在作物生長 期重復(fù)侵染和每年用藥次數(shù)少的緣故，此外還與病菌可能發(fā)生抗藥性變異的潛在 遺傳背景有關(guān)。如灰霉病菌在紫外照射和藥劑選擇壓力下，可發(fā)生10-的抗多菌 靈變異，而小麥赤霉病菌在相同條件下，產(chǎn)生抗藥性變異的頻率則低的多。一般 認(rèn)為引起單循環(huán)病害和土傳病害以及轉(zhuǎn)主寄生的病原菌都不易產(chǎn)生抗藥性。大量 研究表明，真菌對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生