第1章工具酶課件

1、第1章工具酶課件主要內(nèi)容一限制性核酸內(nèi)切酶二其它工具酶1 DNA2聚合酶3DNA修飾酶4. 細(xì)胞裂解酶一限制性核酸內(nèi)切酶1.限制性核酸內(nèi)切酶的定義與特點(diǎn)2.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 3. 限制和修飾作用的分子機(jī)制4.限制性內(nèi)切酶的分類5.限制性內(nèi)切酶的命名6. II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本識(shí)別特性7.限制性內(nèi)切酶的切割方式8. II 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作9.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素及解決方法10.限制性內(nèi)切酶的star活性11.其他特異性的限制酶12.DNA分子的片段化定義： 一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核苷酸酶。特點(diǎn)： 存在

2、于任何一種原核細(xì)菌中. 在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn) 生相應(yīng)限制性片段. 各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內(nèi)切酶酶切圖 譜. 在生物分類,基因定位,基因重組,疾病診斷,刑 事偵察領(lǐng)域極為重要.限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)： 宿主細(xì)胞的限制和修飾作用1. 兩種不同來(lái)源的 -噬菌體, K；B .2. 能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（KK株, B B 株）3. 當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。4. 一但K 噬菌體在B 株成功，由B 株繁殖出 K 后代，能感染B 株, K B 株.不能感染原來(lái) K株. K K株限制和修飾作用的分子機(jī)制1大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株B 株, 有各自的限制和修

3、飾系統(tǒng)。2. 噬菌體長(zhǎng)期生長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株 中.3細(xì)菌利用限制和修飾系統(tǒng)來(lái)區(qū)分自身DNA與外DNA。4. C 株 不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來(lái)源- 噬菌體可以感 染C 株，而在 C 株繁殖 - 噬菌體則在 K株和B 株,受到嚴(yán)格的限制作用。問(wèn)題 1. 關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有（）不太恰當(dāng)。A。由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成B. 這一系統(tǒng)中的核酸酶都是II類限制性內(nèi)切酶C. 這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾D. 不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制修飾系統(tǒng)2.判斷下面一句話是否正確限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護(hù)體系，它是通過(guò)外源DNA的修飾

4、和對(duì)自身DNA的限制實(shí)現(xiàn)的。1）它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，hsdR; hsdM; hsdS.2）hsdR 編碼限制性核酸內(nèi)切酶-識(shí)別DNA 分子特定位 點(diǎn)，將雙鏈DNA 切斷。（注意：DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞：受體細(xì)胞去掉 hsdR 基因位點(diǎn)）3）hsdM 編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶-催化DNA 分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。4） hsdS 表達(dá)產(chǎn)物的功能是-協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。限制和修飾作用的分子機(jī)制1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA 和噬菌體DNA特異性保護(hù),封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。（修飾）2) 當(dāng)外來(lái)DNA 入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異

5、降解。 （限制）限制和修飾作用的分子機(jī)制3) 由于降解不完全，外來(lái)少數(shù)DNA 分子在宿主細(xì)胞中繁殖過(guò)程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來(lái)卻不被降解。4) 外來(lái)少數(shù)DNA 分子,雖然是外來(lái)卻不被降解。但喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力，因?yàn)榻邮芰诵滤拗骶谆揎椀耐瑫r(shí)喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記, 一但 -K 噬菌體在 B 株成功，由B 株繁殖出 -K 后代 能感染B 株, 不能感染原來(lái)K株.限制性內(nèi)切酶的分類：（三大類）I I 類，II 類, III 類.2 I 類，III 類為限制-修飾酶。 限制性內(nèi)切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能單位包含在 同一酶分子中。3 II類限制性內(nèi)切酶與甲基化酶

6、是分離的， 切割位點(diǎn)專 一，適合于DNA重組。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的分類 主要類型 I型 II型 III型限制修飾 多功能 單功能 雙功能蛋白結(jié)構(gòu) 異源三聚體 同源二聚體 異源二聚體輔助因子 ATP Mg2SAM Mg2 ATP Mg2 SAM 識(shí)別序列 無(wú)規(guī)律，如EcoK： 旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 無(wú)規(guī)律，如EcoP15： AACN6GTGC CAGCAG切割位點(diǎn) 距識(shí)別序列1kb 識(shí)別序列內(nèi)或附近 距識(shí)別序列下游 處隨機(jī)性切割 特異性切割 2426bp處問(wèn)題：1.下面關(guān)于限制酶的敘述中哪些是正確的？（）A.限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶B.限制酶在特異序列（識(shí)別位點(diǎn)）對(duì)DNA進(jìn)行切割C.同一種限

7、制酶切割DNA時(shí)留下的末端序列總是相同D.一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的位置切割雙鏈，產(chǎn)生黏末端E.一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA,產(chǎn)生平末端2.II類限制性內(nèi)切酶（） A.有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列 B.僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供 C.限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列 D.有外切核酸酶和甲基化酶活性 E.僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供限制性核酸內(nèi)切酶的命名名稱 屬名（大寫、斜體） 種名（小寫、斜體） 株名 序數(shù)來(lái)源菌株 EcoR IEcoRIE.coli R株Hind IIIHindIIIHaemophilus inf

8、luenzae d株Hind IIHindIIHaemophilus influenzae d株Hpa IHpaIHaemophilus parainfluenzae問(wèn)題：下列關(guān)于限制性內(nèi)切酶的表示方法中，正確的一項(xiàng)是（）Sau 3A I B. E. co R I C. hind III D. Sau 3A I II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本識(shí)別特性1）大多數(shù)酶的識(shí)別順序是嚴(yán)格的，少數(shù)有變動(dòng)。如Hind II的識(shí)別位點(diǎn)是GTPyPuAC.其中Py代表C或T，而Pu代表A或G。2）識(shí)別順序的堿基數(shù)一般為46個(gè)堿基對(duì)，一般富含GC II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本識(shí)別特性3）大多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有180旋轉(zhuǎn)

9、對(duì)稱，少數(shù)酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外，具有旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性。如 EcoR I 的切割位點(diǎn) EcoR I 的識(shí)別位點(diǎn) 5GCTGAATTCGAG3 3CGACTTAAGCTC54）II型酶的識(shí)別順序中的堿基被甲基化修飾后會(huì)影響部分酶的切割作用5) 同一種DNA分子中，識(shí)別序列短的出現(xiàn)概率大，識(shí)別序列長(zhǎng)的出現(xiàn)概率小。1/4n問(wèn)題：1.在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一個(gè)6bp的II類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么？2.下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)（哪些）最有可能是II類酶的識(shí)別序列：GAATCG 、AAATTT、 GATATC、ACGGCA？ 為什么？3. 如果DNA由5

10、種不同的堿基組成，則一個(gè)識(shí)別4個(gè)堿基序列的限制性內(nèi)切酶大概隔（）堿基對(duì)可進(jìn)行一次切割 A. 125 B. 256 C. 425 D. 625 E. 10564. 如果DNA由5種不同的堿基組成，則一個(gè)識(shí)別4堿基序列的限制內(nèi)切酶大約可將1Mb的DNA切割成多少段？（） A.125 B.320 C.625 D.1050 E.1600 限制性內(nèi)切酶的切割方式切割位點(diǎn)，用 或 表示。A以切出片段末端性質(zhì)不同 平末端 5 突出的黏性末端 3突出的黏性末端 限制性內(nèi)切酶的切割方式B以酶切特點(diǎn)來(lái)分同位酶：識(shí)別相同序列切點(diǎn)不同。同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，酶的來(lái)源不同。同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，切出片段有相同末端序列。

11、限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式 EcoR I等產(chǎn)生的5粘性末端 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 OH P 5G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 P OHEco RI 37 退火4-7 限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式Pst I等產(chǎn)生的3粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33C-G-A-G-P OH-A

12、-C-G-T-C-C-T-C 55G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst I 37 退火4-7 OHP5G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 POH限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式Pvu II等產(chǎn)生的平頭末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5Pvu II 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5限制性核酸內(nèi)切

13、酶的切割方式內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)與切割方式之間的關(guān)系1）識(shí)別序列不同，切割方式不同 如：EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTCGAG-3 3-GAGCTC-52) 識(shí)別順序不同，切割產(chǎn)生的黏性末端相同同尾酶 如：BamH I 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 Bgl II 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)與切割方式之間的關(guān)系3)識(shí)別序列相同，但切割方式不同同位酶 如：Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 4)相同的識(shí)別序

14、列，切割方式也相同同裂酶 如：Hpa II 5-CCGG-3 3-GGCC-5 Msp I 5-CCGG-3 3-GGCC-5 但Msp I可以切甲基化的胞嘧啶問(wèn)題1. BamH I、Xba I、Bgl II的識(shí)別位點(diǎn)分別是：GGATCC、 TCTAGA、AGATCT，哪些酶切結(jié)果可產(chǎn)生互補(bǔ)的末端？（）A.以上幾種酶切結(jié)果產(chǎn)生的末端都可互補(bǔ) B. 產(chǎn)生的末端都不能互補(bǔ)C. 僅Bam H I和Bgl II的酶切末端互補(bǔ) D. 僅Bam H I和Xba I的酶切末端互補(bǔ)E. 僅Xba I和Bgl II的酶切末端互補(bǔ)2. . Bst B I(TT CGAA）消化可產(chǎn)生怎樣的末端（） A.含5CGAA

15、 3序列的黏性末端 B.含5CG 3序列的黏性末端 C. 含5AAGC 3序列的黏性末端 D. 平末端 E. 含5GC 3序列的黏性末端 II 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作1 U 核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1 小時(shí)，完全水解1 g 標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件： 待酶切的DNA樣品 內(nèi)切酶 反應(yīng)緩沖液 溫度37，12hr完成酶切，所需酶量由切割的DNA量決定影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 1）底物DNA 2）內(nèi)切酶的用量 3）反應(yīng)緩沖液(濃度（10）mmol/L) 4）反應(yīng)溫度底物DNA DNA純度 蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SD

16、S、NaCl等 DNA分子構(gòu)型 切割效率：線性超螺旋質(zhì)粒環(huán)狀病毒DNA 識(shí)別序列的側(cè)面序列 大多數(shù)限制酶對(duì)只含有識(shí)別序列的寡核苷酸沒(méi)有催化活性，其序列兩端各延長(zhǎng)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸后才能被有效切割。 位點(diǎn)偏愛(ài) 側(cè)面序列的核苷酸組成與切割效率有關(guān)系。如pBR322 DNA上的4個(gè)Nae I的識(shí)別位點(diǎn)切割效率不同。底物DNA DNA甲基化 dcm和dam甲基化酶 大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有Bcl I、MboI等，但Bam H I、Bgl II、Sau 3A I不受影響 大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5

17、位上引入甲基，受其影響的酶有Eco R II等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基 解決方法： 對(duì)DNA進(jìn)行有針對(duì)性的純化； 加大酶的用量，1 g DNA 用10U 酶； 加大反應(yīng)總體積； 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；2）內(nèi)切酶的用量 反應(yīng)體系中內(nèi)切酶的用量主要取決于酶本身的催化活性和底物DNA樣品 當(dāng)?shù)孜锎_定后，酶的用量視酶活性而定。酶活性高的用量少，反之則高。 容積活性（volume activity）：1ul酶液中具有的酶活性單位，即U/ul。 等量的兩種DNA樣品，由于含同種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的密度不同，則酶量也不同。密度大的用酶多。3）反應(yīng)緩沖液(濃度（10）mmol/L)

18、 緩沖液成分 A B C D E Tris-Ac 330 Tris-HCl 100 500 100 100 Mg-Ac 100 MgCl2 50 100 100 100 K-Ac 650 NaCl 1000 1000 500 DTT 5 10 10 10 -巰基乙醇 10 pH值（37） 7.9 8.0 7.5 7.5 7.54）反應(yīng)溫度 大多數(shù)內(nèi)切酶的最適溫度為37，少數(shù)高于或低于37.各種酶的最適溫度見(jiàn)各產(chǎn)品說(shuō)明書。 限制性內(nèi)切酶的star活性定義：某些限制性內(nèi)切酶在特定條件下（高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等），可以在不是原來(lái)的識(shí)別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱為star

19、活性。如：Eco R I在正常條件下識(shí)別并切割5GAATTC3序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3另，不同的酶產(chǎn)生star活性的條件不同，見(jiàn)書p73.問(wèn)題1.從細(xì)菌中分離基因組DNA，經(jīng)過(guò)識(shí)別GAATTC序列的6堿基酶長(zhǎng)時(shí)間消化后，發(fā)現(xiàn)DNA分子未被切動(dòng)，基因組大小為4Mb，造成該結(jié)果的原因是（）A.基因組中沒(méi)有GB.基因組中沒(méi)有AC.該細(xì)菌的DNA已經(jīng)過(guò)甲基化修飾D.所有酶切位點(diǎn)都位于基因內(nèi)，而該限制性內(nèi)切酶不作用于基因內(nèi)E.所有酶切位點(diǎn)都位于啟動(dòng)子及調(diào)控區(qū)內(nèi)，而該限制性內(nèi)切核酸酶只作用于基因內(nèi)2. 限制性內(nèi)切酶的星號(hào)活性是指（）在非常規(guī)條

20、件下，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性活性大大提高 切割速度大大加快識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同3. 下面哪種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因（）甘油含量過(guò)高 反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑含有非Mg2的二價(jià)陽(yáng)離子 酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低其它特異性的限制酶 Omega核酸酶（I-SceI） 由釀酒酵母線粒體rRNA基因中的內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 其它特異性的限制酶I-PpoI：來(lái)自于多頭絨胞菌Physarum polycephalum 基因內(nèi)含子 5- CTCTCTTAAGGTAGC -3 AATT DNA的片段化定義：無(wú)論是生物材料制備的天然DNA，還

21、是化學(xué)合成的DNA，往往需要用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，使其可用于連接重組的DNA片段，即DNA分子的片段化切割方法： 單酶切 雙酶切 部分酶切單酶切用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA樣品完全酶切后產(chǎn)生的片段由DNA的形狀和酶切位點(diǎn)數(shù)決定; 如：線性DNA分子，酶切后的片段N1 環(huán)狀分子，酶切后的片段N雙酶切用兩種不同的酶切割同一種DNA分子1）需兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度相同，可同時(shí)反應(yīng)。2）兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度要求差別大，低高鹽，不可 同時(shí)反應(yīng)。 a) 低鹽組先切，加熱滅活后，補(bǔ)加鹽濃度再切。 b) 沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液 c）兩種酶不能同時(shí)反應(yīng)，有先有后。 部分酶切用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)行不完全的切割導(dǎo)致不完全切割的原因： 底物DNA的純度、識(shí)別序列的甲基化、酶的用量不足、反應(yīng)緩沖液或溫度不適以及酶切時(shí)間不足等用 途確定DNA分子的限制性圖譜限制酶作圖(Restriction Mapping)基本原理1Kb Eco RI待檢的DNABam HI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5Kb