解密-簡(jiǎn)答題pdf

1、【簡(jiǎn)答題】.蘇云金芽胞桿菌的基因組大小為 5Xl06bp,若p=99% ,平均克隆片段為 100kb ,計(jì)算構(gòu)建這樣一個(gè)完全的基因文庫(kù)所需的克隆數(shù)。.什么叫標(biāo)記獲救現(xiàn)象？.依賴于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌體RNA聚合酶和T4或T7噬菌 體RNA聚合酶，這類聚合酶可用于表達(dá)外源基因，闡述常用的構(gòu)建策略？.簡(jiǎn)述入噬菌體載體的克隆原理及一般步驟？.簡(jiǎn)述限制性內(nèi)切核酸酶(Restriction endonuclease )的概念及其生物學(xué)功 能？.以下為某一 DNA序列，據(jù)此回答下列問題5 - GATCTAAATTCTAGCCTTGAACTCATACGGGATTGTTAAATCTA-3 - C

2、TAGATTTAAGATCGGAAC-T-T-G-AGTATGCCCTAAGAATTTAGATC5-(1)在DNA測(cè)序中，引物設(shè)計(jì)的基本原理是什么？(2)如果你打算擴(kuò)增上圖所示的一段序列之間的DNA ,你會(huì)如何選擇引物？.什么是Gene library ?它與cDNA library 有何區(qū)別？.天然的質(zhì)粒載體(plasmid vectors )通常需經(jīng)改造后才能應(yīng)用，包括去除 不必要的片段，引入多克隆位點(diǎn)等。試問在此過程中如何增減酶切位點(diǎn)？.何謂測(cè)序酶？與Klenow片段相比，它有何優(yōu)點(diǎn)？.何謂RNA的斑點(diǎn)雜交和狹縫雜交？.單核甘酸置換插入或缺失中，引物設(shè)計(jì)的要求？.為什么野生型的人噬菌體D

3、NA不宜作為基因工程載體？.在對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增條帶，請(qǐng) 分析其原因？如果檢測(cè)結(jié)果是看不到 DNA帶或DNA帶很弱，那又是為什么？ 14.簡(jiǎn)述基因克隆的兩個(gè)基本特征？.YAC載體具有什么樣的功能性元件？為什么它在克隆大片段時(shí)具有很大的優(yōu)越性？.某DNA序列中存在DpnI酶切位點(diǎn)，以此DNA為模板，在體外合成 DNA序 列，當(dāng)用該酶進(jìn)行酶切時(shí)，發(fā)現(xiàn)切割不動(dòng)，試分析可能原因？.雙脫氧終止法測(cè)定DNA序列的片段一般不能太長(zhǎng)，如何運(yùn)用本章所學(xué)知 識(shí)測(cè)定較長(zhǎng)片段的DNA序列？.試簡(jiǎn)述 入 噬菌體的Lytic growth 和Lysogenic state兩種循環(huán)的分

4、化及其調(diào)節(jié)過程？.簡(jiǎn)述隨機(jī)引物標(biāo)記的原理和步驟？.噬菌粒(PhagemicD具有那些特征？許多 phagemid都有一個(gè)主要的缺點(diǎn), 即在輔助噬菌體感染后，有時(shí)候單鏈 DNA的產(chǎn)量較低且重復(fù)性一般較差，試分 析其原因？.談?wù)勀銓?duì)gene的認(rèn)識(shí)，并簡(jiǎn)要說說gene概念的發(fā)展情況？.抗性基因(Resistant gene )是目前使用的最廣泛的選擇標(biāo)記，常用的抗生 素抗性有哪幾種？并舉兩例說明其原理？.PCR引物設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)時(shí)，為什么需在酶切位點(diǎn)后加上一些堿基？.經(jīng)典RACE克隆的原理是什么？有何意義？.簡(jiǎn)述差別雜交的原理和基本思路？.假如從一個(gè)原核生物中cloning 某基因(1 kb -2

5、kb ),請(qǐng)談?wù)勊幕静襟E？.簡(jiǎn)述T4多核甘酸激酶的活性和用途？.得到一段未知功能的基因序列，如何對(duì)它進(jìn)行分析？.何為 a -complement ?如何利用 a -complement來篩選插入了外源 DNA 的重組質(zhì)粒？.請(qǐng)簡(jiǎn)述F+,F-,Hfr,和F它們之間的關(guān)系和相互轉(zhuǎn)化的過程？.何謂Star activity ?簡(jiǎn)述Star activity的影響因素及克服方法？您的答案：.如何從原核生物中克隆復(fù)制子？.通過雙向蛋白質(zhì)電泳發(fā)現(xiàn)某蛋白質(zhì)與某植物的一種表型密切相關(guān)，若要利用 編碼該蛋白質(zhì)的基因來轉(zhuǎn)基因植物，試問如何分離得到該基因？. BAP和CIAP有何作用？為何一般采用 CIAP而不

6、采用BAP ?.當(dāng)向細(xì)菌培養(yǎng)基中加入氯霉素時(shí)，可以使細(xì)菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)得到擴(kuò)增，試分析其原理？.什么是 Western blot ?它和 Southern blot 有何區(qū)別？.如何理解gene及其產(chǎn)物的共線性和非共線性？.大腸桿菌DNA聚合酶I ,具有3-5 外切活性和5-3 的聚合酶活性 以及5-3 的外切活性，試根據(jù)此推測(cè)該聚合酶可能具有哪些用途？.Cosmid的工作原理是什么？.小量制備質(zhì)粒DNA ,用質(zhì)粒中特定的酶切發(fā)現(xiàn)切割不動(dòng)，試分析可能原因 及克服方法？.克隆cDNA常見的問題？.瓊脂糖凝膠電泳中，簡(jiǎn)述影響 DNA在凝膠中遷移速率的因素？.什么是Gene library ?它與cD

7、NA library 有何區(qū)別？.轉(zhuǎn)導(dǎo)(Transduction )可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(generatized transduction )和 局限，性轉(zhuǎn)導(dǎo) (specialized transduction ), 試比較其異同？.在酶切緩沖液中，一般需加入BSA,請(qǐng)問加入BSA的作用是什么？并簡(jiǎn)述其原理？.分析比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同點(diǎn)？.采用同聚物加尾的方法進(jìn)行dscDNA克隆，一般采用 dC/dG而不采用dA/dT ,簡(jiǎn)述其原因？.在PCR反應(yīng)的后期，或者循環(huán)次數(shù)過多時(shí)，反應(yīng)體系中就會(huì)出現(xiàn)一種所謂 的平臺(tái)效應(yīng)(Plateau effect ),請(qǐng) 問什 么 叫 Plat

8、eau effect ?產(chǎn)生Plateau effect的原因有哪些？.利用細(xì)胞的中斷雜交(intermit hybridization )可以進(jìn)行基因定位，請(qǐng)說 出其原理？.如何使用Methylase 對(duì)克隆DNA進(jìn)行保護(hù)？此步驟有什么意義？.為什么野生型的 人噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？【簡(jiǎn)答題參考答案】. n=ln(1-p)/ln(1-f) n:一個(gè)完全基因文庫(kù)所包含的重組體克隆數(shù) p:所期望的目的基因在基因文庫(kù)中出現(xiàn)的幾率 f:插入片斷的平均大小與基因組 DNA大 小的比值 根據(jù)以上公式可得到所需要的克隆數(shù)為 228. 70年代初 (|)X174 DNA ( ssDNA 5386

9、bp),當(dāng)用帶琥珀突變的 ssDNA與變 性的野生型DNA片段一起轉(zhuǎn)染細(xì)菌時(shí)，觀察到“標(biāo)記獲救”現(xiàn)象，即產(chǎn)生帶野 生型基因組的噬菌體，原因是野生型 DNA片段與突變體的相應(yīng)序列退火，形成 錯(cuò)配的異源雙鏈體，后者可被宿主編碼的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)的野生型基 因組。由此可利用突變的 DNA片段將突變引入到野生型 DNA中。.將T7 RNA聚合酶基因置于 E.coli lacUV5啟動(dòng)子之下，插入到 入 噬菌體 中，感染 E.coli ,建立穩(wěn)定的溶源菌。E.coli BL21 (DE3)菌株即為將lacUV5啟動(dòng)子和T7聚合酶基因置于 入 噬菌體DE3區(qū)，該 入噬菌體DNA整合于染色 體的BL2

10、1處。若將T7噬菌體啟動(dòng)子控制的目的基因經(jīng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入該宿主菌 中，在IPTG誘導(dǎo)下，可啟動(dòng)外源基因的表達(dá)；先導(dǎo)入帶T7噬菌體啟動(dòng)子控制的目的基因的質(zhì)粒，再用入噬菌體(帶T7 RNA聚合酶基因)感染E.coli ,激活目的基因的表達(dá)。.入噬菌體載體屬于克隆載體，主要用于克隆 DNA片斷。工作原理：入噬菌體載體克隆外源DNA片斷的原理與質(zhì)粒載體的工作原理是類似的，只是在形式上 有許多差別。載體和外源 DNA片斷經(jīng)過酶切后，外源 DNA片斷插入到載體的適當(dāng) 位置，或置換載體的填充片段。這種連接后的重組DNA保留增殖性能，但由于分子量太大，不能象重組質(zhì)粒 DNA那樣可通過轉(zhuǎn)化方法進(jìn)入大腸桿菌。通過提

11、取入噬菌體的蛋白質(zhì)外殼，可在體外將重組噬菌體DNA進(jìn)行包裝，形成噬菌體顆粒。這樣DNA注射到宿的噬菌體顆粒保留對(duì)大腸桿菌的感染能力，可將被包裝的重組噬菌體主菌中。通過裂解生長(zhǎng)，可增殖重組噬菌體?？寺〔襟E：通過裂解過程增殖載體；載體與外源 DNA的酶切；外源DNA與載體的 連接；重組噬菌體的體外包裝；包裝噬菌體顆粒的感染；篩選。.定義：指識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。生物學(xué)功能：保護(hù)宿主不受外來 DNA分子的感染，可降解外來的 DNA分子，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中.引物選擇的原則：長(zhǎng)度：至少 16bp ,通常為18-30bp ,更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增

12、的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性；引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的Tm值差異最好在2-5 C。對(duì)于小于20個(gè)堿基的引物，其 Tm值可用簡(jiǎn)易公式計(jì)算，Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) 。對(duì)于14-70個(gè)核昔酸的引物可用以下公式計(jì)算。 Tm=81.5 + 16.6( 1gK+ ) + 0.41( G + C )% - ( 675 / N ) N表示引物的核昔酸數(shù)目，K+表示單價(jià)離子即鉀離子的濃度；避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列(3個(gè)堿基)，從而減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。G + C 含量：盡量控制在40%60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避

13、免喋吟或嗑哽的連續(xù)排列，以及 T在3末端的重復(fù)排列； 引物的3末端最好是G或C ,但不要GC連排。(2) 5-GATCTAAATTCTAGCCTTGAACT- 3 5-CTAGATTTAAGAATCCCGTATG-3.由大量的含有基因組 DNA (即某一生物的全部 DNA序列)的不同DNA片段 的克隆所構(gòu)成的群體，稱之為基因文庫(kù)。一個(gè)完全的基因文庫(kù)，應(yīng)該能夠保證從中篩選到目的基因。cDNA文庫(kù)：若這些大量的重組 DNA分子所含的外源DNA不是基因組DNA ,而是由某一生物的特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，他們所構(gòu)成的重組 DNA克隆群體，則稱之為cDNA基 因

14、文庫(kù).在酶切水平上，通過酶切和連接產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。將產(chǎn)生的5突出端補(bǔ)平后，再連接以產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)；同尾末端的連接，不同的同尾酶切割DNA產(chǎn)生的末端，再相互連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)原來的酶切位點(diǎn)卻消失；平末端的連接.測(cè)序酶是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶。與Klenow 聚合酶相比，該酶的3-5外切活性完全缺失。測(cè)序酶持續(xù)合成能力很強(qiáng)，聚合速率很高，對(duì)諸如dITP和7-脫氮dGTP等用于提高分辨率使測(cè)序凝膠某些區(qū)段上的壓縮條帶得以分開的核甘酸具有廣泛的耐受性。它是測(cè)定長(zhǎng)段DNA序列的首選酶。.將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在固體支持物上，然后與核酸探針進(jìn)行分子雜交，這種方法稱為

15、斑點(diǎn)雜交。如果借用一種模具，將核酸樣品加到模具的狹縫中，通過真空抽濾，印跡到濾膜上，然后進(jìn)行雜交稱為狹縫雜交。11.5端完全配對(duì)，使得上游（引物）起始的DNA合成不容易將誘變寡核昔酸取代，約需810bp。3端所形成的雜交體足以引導(dǎo) DNA合成。如果錯(cuò)配核昔酸 太靠近3端，3端將不能形成穩(wěn)定的雜交體，易被外切活性降解。所以3端需有79bp完全配對(duì)。為便于篩選，應(yīng)選用可形成穩(wěn)定雜交體而長(zhǎng)度最短 的誘變寡核甘酸。一般1719bp ,錯(cuò)配在中央，使得完全配對(duì)的雜交體與錯(cuò) 配雜交體之間的熱穩(wěn)定性差異足夠大。.野生型噬菌體DNA沒有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對(duì) DNA包裝的量是 有限制的，不能大于基因組的

16、105%,所以要將 入噬菌體改造成載體，必須削 減分子量；野生型的 人噬菌體對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)， 不便于克??；沒有可供選擇的標(biāo)記；野生型的 人噬菌體具有感染性，因此 不夠安全。. PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增條帶。其原因往往由于酶量過多或酶 的質(zhì)量差，模板中雜質(zhì)過多，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多等引起。如果檢測(cè)結(jié)果看不到DNA帶或DNA帶很弱可能是：模板中含有雜質(zhì)；酶失活；引物質(zhì)量不好； Mg2+濃度過低；反應(yīng)體 積的改變等等；其他的一些物理原因，如復(fù)性溫度低，變性時(shí)間短等或者也可 能是由于靶序列的變異等。.基因克隆的兩個(gè)基本特征是

17、一是強(qiáng)調(diào)外源核酸分子（一般情況下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然種的界限將來自于不相關(guān)物種的基因放入一個(gè)宿 主中是基因操作的一個(gè)重要特征，基因操作的另一個(gè)重要特征是繁殖。.YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個(gè)著絲粒，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，兩 個(gè)端粒。YAC能夠容納長(zhǎng)達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和粘粒辦不到的。 大片斷的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距 離，同時(shí)減少完整基因組文庫(kù)所需的克隆數(shù)目。.生物體內(nèi)的DNA序列可能是經(jīng)過甲基化修飾的，而在體外合成時(shí)，缺乏這 種修飾作用。當(dāng)用依賴于甲基化的限制酶DpnI來切割非甲基化的序列時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)不能切割的情況。

18、.將所需要測(cè)序的DNA片斷采用2種不同的限制性內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生不同的酶切片段，將此酶切片段連接到載體上，測(cè)序后，拼接，即可得到全長(zhǎng)的DNA序列；用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行部分酶切，酶切產(chǎn)物與載體連接后，測(cè)序，拼 接，即可得到全長(zhǎng)DNA片斷。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在進(jìn)行 部分酶切時(shí)，應(yīng)該控制好條件，要確保所得到的酶切片斷能覆蓋所需測(cè)序的DNA片斷。. Lytic growth 是入噬菌體在宿主中大量復(fù)制并組裝成子代入噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。Lysogenic state 為 人噬菌體基因組DNA通過位點(diǎn) 專一性重組整合到宿主染色體 DNA中隨宿主的繁殖傳到子代細(xì)胞。調(diào)節(jié)過程： 由

19、感染復(fù)數(shù)和細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)決定的，感染復(fù)數(shù)越高，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)越差，則溶源化 的頻率就越高。溶源現(xiàn)象的生化媒介可能是3-5 cAMP ,它在細(xì)胞內(nèi)的濃度會(huì)隨營(yíng)養(yǎng)條件的變化而改變，當(dāng)細(xì)胞在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，cAMP的濃度較低，有利于裂解生長(zhǎng)；在缺乏 cAMP的突變細(xì)胞中，更有利于裂解生長(zhǎng)另外一個(gè) 重要的調(diào)節(jié)因素是噬菌體的CH蛋白，它是噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的激活子，抑制裂解功能基因的表達(dá)，催化噬菌體 DNA整合到細(xì)菌的染色體中去。高濃度的CH蛋白促進(jìn)溶源化，而低濃度的CH蛋白促進(jìn)裂解生長(zhǎng)。當(dāng) CH蛋白濃度足夠時(shí)，激活CI蛋白和基因int的表達(dá)，導(dǎo)致噬菌體DNA與染色體整合，朝著溶 源態(tài)生長(zhǎng)。.隨機(jī)引物是人工

20、合成的長(zhǎng)度為 6個(gè)核昔酸的寡聚核昔酸片段群體，含有各種 可能的排列順序（46=4096）;或是用DNA酶處理小牛胸腺 DNA后獲得的6 12個(gè)堿基的片段。將待標(biāo)記的 DNA片段同隨機(jī)引物一起進(jìn)行雜交，并以雜交 體上的寡聚核甘酸為引物，在 Klenow酶的作用下合成互補(bǔ)DNA鏈，當(dāng)反應(yīng)底 物中有放射性底物dNTP時(shí)，新合成的DNA就帶上了標(biāo)記。.參考答案： 雙鏈DNA既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征；免卻了 將外源DNA片斷從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體；由于載體足夠小，故可得到長(zhǎng) 達(dá)10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。原因：噬菌體攜帶的基因間隔區(qū)的確切序 列，攜帶完整基因間隔區(qū)的質(zhì)?？捎捎诟蓴_輔助病毒

21、DNA復(fù)制而抑制子代噬菌體顆粒的產(chǎn)生；基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒的具體位置，基因間隔區(qū)插入 pBR322Hindm位點(diǎn)所構(gòu)成的噬菌粒，會(huì)嚴(yán)重干擾野生型噬菌體的生長(zhǎng)，而將基因間隔 區(qū)插入Ahearn位點(diǎn)則不然；輔助噬菌體的性質(zhì)，野生型絲狀噬菌體及其抗干擾突變株都被用作輔助噬菌體。輔助噬菌體基因間隔區(qū)插入了lacZ序列，因而基因n產(chǎn)物對(duì)它的識(shí)別不那么有效；克隆于噬菌粒的外源DNA的大小與性質(zhì)，因外源DNA片斷的大小而異，單鏈 DNA的產(chǎn)量可以在510倍之間有所 差異（一般來說，外源DNA越大，產(chǎn)量越低）。另外，由于一些尚不清楚的原 因，大小相同的外源DNA ,其單鏈DNA的產(chǎn)量也參差不齊。.能夠表達(dá)和產(chǎn)生

22、基因產(chǎn)物（Proteinor RNA ）的DNA序列（可自由發(fā)揮，發(fā)展 情況請(qǐng)查找相關(guān)資料）基因概念的發(fā)展：基因作為遺傳學(xué)中的專用術(shù)語，其概念每 發(fā)展一步都意味著遺傳學(xué)乃至整個(gè)生物學(xué)的一次革命和突破，其內(nèi)容的每次豐富和 充實(shí)都凝聚著生物學(xué)家們的滴滴心血。“基因”概念的提出：遺傳學(xué)的奠基人孟德 爾在1866年發(fā)表的論文植物雜交試驗(yàn)指出生物每一個(gè)性狀都是通過遺傳因子 來傳遞的，遺傳因子是一些獨(dú)立的遺傳單位。這樣把可觀察的遺傳性狀和控制它的 內(nèi)在的遺傳因子區(qū)分開來了，遺傳因子作為基因的雛形名詞誕生了。1909年丹麥遺傳學(xué)家約翰遜在精密遺傳學(xué)原理一書中提出“基因”概念，以此來替代孟德爾假定的“遺傳因子

23、”。從此，能夠表達(dá)和產(chǎn)生基因產(chǎn)物（protein or RNA ）的DNA序列（可自由發(fā)揮）“基因” 一詞一直伴隨著遺傳學(xué)發(fā)展至今?；蚪Y(jié)構(gòu)和功能的探索：摩爾根和他的學(xué)生們利用果蠅作了大量的潛心 研究，1926年他的巨著基因論出版，從而建立了著名的基因?qū)W說，首次完成 了當(dāng)時(shí)最新的基因概念的描述，即基因以直線形式排列，它決定著一個(gè)特定的性 狀，而且能發(fā)生突變并隨著染色體同源節(jié)段的互換而交換，它不僅是決定性狀的功 能單位，而且是一個(gè)突變單位和交換單位。1941年比德爾和塔特姆提出一個(gè)基因一個(gè)酶說；1949年鮑林與合作者在研究鐮刀型細(xì)胞貧血癥時(shí)推論基因決定著多肽 鏈的氨基酸順序；1944年艾弗里、麥

24、卡蒂首次用實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)：DNA是遺傳信息的載體；1952年赫爾希和蔡斯進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是 DNA而 不是蛋白質(zhì)；1953年美國(guó)分子生物學(xué)家沃森和英國(guó)分子生物學(xué)家克里克通力協(xié) 作，根據(jù)X射線衍射分析，提出了著名的 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，進(jìn)一步說明基因 成分就是DNA ,它控制著蛋白質(zhì)的合成；1957年法國(guó)遺傳學(xué)家本滋爾以 T4噬菌體作為研究材料分析了基因內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，提出了順反子學(xué)說。這個(gè)學(xué)說打 破了過去關(guān)于基因是突變、重組、決定遺傳性狀的“三位一體”概念及基因是最小的不可分割的遺傳單位的觀點(diǎn)，從而認(rèn)為基因?yàn)镈NA分子上一段核昔酸序列，負(fù)責(zé)著遺傳信息的傳遞，一個(gè)基因內(nèi)部仍可劃分為若干個(gè)起作用

25、的小單位，即 可區(qū)分成順反子、突變子和重組子。一個(gè)作用子通常決定一種多肽鏈合成，一個(gè)基 因包含一個(gè)或幾個(gè)作用子。突變子指基因內(nèi)突變的最小單位，而重組子為最小的重 組合單位，只包含一對(duì)核昔酸。所有這些均是基因概念的偉大突破。關(guān)于基因的本質(zhì)確定后，人們又把研究視線轉(zhuǎn)移到基因傳遞遺傳信息的過程上。1961年開始，尼倫伯格和科拉納等人逐步搞清了基因以核昔酸三聯(lián)為一組編碼氨基酸，并在1967年破譯了全部64個(gè)遺傳密碼，這樣把核酸密碼和蛋白質(zhì)合成聯(lián)系起來。然后，沃森和克里克等人提出的“中心法則”更加明確地揭示了生命活動(dòng)的基本過程。1970年特明以在勞斯肉瘤病毒內(nèi)發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶這一成就進(jìn)步發(fā)展和完善 了 “中

26、心法則”，至此，遺傳信息傳遞的過程已較清晰地展示在人們的眼前。過去 人們對(duì)基因的功能理解是單一的即作為蛋白質(zhì)合成的模板。1961年法國(guó)雅各布和莫諾的研究成果，又大大擴(kuò)大了人們關(guān)于基因功能的視野。他們?cè)?研究大腸桿菌乳糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)現(xiàn)了有些基因不起合成蛋白質(zhì)模板作用， 只起調(diào)節(jié)或操縱作用，提出了操縱子學(xué)說。從此根據(jù)基因功能把基因分為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和操縱基因?；蚋拍畹倪M(jìn)一步發(fā)展：70年代后，基因的概念隨著多學(xué)科滲透和實(shí)驗(yàn)手段日新月異又有突飛猛進(jìn)的發(fā)展，主要有以下幾個(gè)方面?；蚓咧丿B性、內(nèi)含子和外顯子、管家基因與奢侈基因和基因的游動(dòng)性。所有這 些成果無疑給基因概念中注入鮮活科學(xué)的內(nèi)容，幫

27、助人們揭開層層面紗去更加全 面了解基因的真面目。時(shí)代在發(fā)展，科學(xué)在進(jìn)步，基因概念的深入發(fā)展，必將對(duì) 人類的文明進(jìn)步產(chǎn)生強(qiáng)大的推動(dòng)作用。.氨芳青霉素抗性基因( ampr)、四環(huán)素抗性基因( tetr )、氯霉素抗性基因 (Cmr)、卡那霉素和新霉素抗性基因( kanr , neor )以及琥珀突變抑制基因 supF 5% ;酶過量(100U/ml);低離子強(qiáng)度(8.0);有機(jī)溶劑如PMSD (二甲基亞碉)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺( dimethylacetamide )、二甲基甲 酰胺(dimethylformamide )和 sulphalane 等；用其它二價(jià)陽(yáng)離子 Mn2+、Cu2+、

28、 Cc2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+。星星活性的抑制措施：減少酶的用量，避免過量酶切，減少甘油濃度；保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇；提高離子強(qiáng)度到100150mM （在不抑制酶活性的前提下）；降低反應(yīng)pH至7.0 ;使用Mg2+作為二價(jià)陽(yáng)離子。.載體的抽提（該載體無復(fù)制子或復(fù)制子被切除）及酶切；將所需要研究的外源DNA進(jìn)行不完全消化；將經(jīng)過不完全消化的外源 DNA片斷連接到載體的多克隆位點(diǎn)；在抗性平板上能生長(zhǎng)的質(zhì)粒即為含有復(fù)制子的目標(biāo)片段，可 用此方法進(jìn)一步將復(fù)制子定位。.首先，將特異性蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后進(jìn)行氨基末端測(cè)序，依據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì) 探針從該植物的cDNA文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆（如果沒有

29、 cDNA文庫(kù)可以先做 cDNA文庫(kù)）；最后進(jìn)行亞克隆，將目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入表達(dá)載體上進(jìn)行表達(dá)分析。. 作用：催化除去DNA或RNA 5磷酸。BAP抗性強(qiáng)，抗高溫和去污劑。CIAP可用蛋白酶K消化滅活，或在5mM EDTA下，65C處理或75 C處理10分鐘， 然后用酚氯仿抽提，純化去磷酸化的 DNA ,從而去除CIAP的活性。相比之下， CIAP比BAP更易去除，因此，一般采用 CIAP。. pMB1質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰 期較長(zhǎng)的酶（DNA聚合酶I , DNA聚合酶田），依賴于 DNA的RNA聚合酶，以及 宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的

30、產(chǎn)物。因此，即使存在抑制蛋白質(zhì)合成 并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有pMB1 （或ColE1）復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可積聚23千個(gè)質(zhì)粒。. Western blot是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后利用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。它與 Southern blot的不同在于探針的性質(zhì)不同，在 Western blot中所使用的探針是抗體（蛋白質(zhì)），而 Southern blot的探針則是核酸。.基因決定蛋白質(zhì)的序列組成，是由密碼子對(duì)應(yīng)特定氨基酸所決定的。當(dāng)一個(gè) 基因的核甘酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列是一一對(duì)應(yīng)時(shí)，則表明它們是共線性 的。在原核生物中

31、，基因及其產(chǎn)物是共線性的。20世紀(jì)70年代以來，在真核生物中，發(fā)現(xiàn)了間斷基因，后來發(fā)現(xiàn)這種間斷基因在真核生物中普遍存在， 也就是后來所說的基因間存在著內(nèi)含子。內(nèi)含子指真核生物基因中不能被翻譯 成蛋白質(zhì)的DNA片斷，但可被轉(zhuǎn)錄，當(dāng)兩側(cè)序列的轉(zhuǎn)錄RNA被剪接在一起時(shí)，就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA從整個(gè)轉(zhuǎn)錄物中除去。外顯子是指能夠翻譯成蛋白 質(zhì)的任一間斷的基因片段，一個(gè)基因可有多個(gè)外顯子。內(nèi)含子并不是一成不變 的，具有相對(duì)性，對(duì)一個(gè) DNA片斷來說，在某個(gè)基因中是內(nèi)含子，但在另一個(gè) 基因中卻可以作為外顯子。.利用E.coli DNA 聚合酶 的5-3外切核酸酶活性，可用切口平移法標(biāo)記DNA ,所有DNA聚

32、合酶中只有此酶有此反應(yīng)；用于 cDNA克隆中的第 二鏈，即單純的DNA聚合活性；對(duì)3突出端的DNA作末端標(biāo)記（交換或 置換反應(yīng)）。.粘粒載體的主要原理類似入噬菌體載體。在外源片斷與載體連接時(shí)，粘粒載體相當(dāng)于 入噬菌體載體的左右臂，cos位點(diǎn)通過粘端退火后，再與外源片斷相間連接成多聯(lián)體。當(dāng)多聯(lián)體與入噬菌體包裝蛋白混合時(shí)，入噬菌體A基因蛋白的terminase 功能將切割兩個(gè)cos位點(diǎn)，并將兩個(gè)同方向 cos位點(diǎn)之 間的片斷包裝到 入噬菌體顆粒中去。這些噬菌體顆粒感染大腸桿菌時(shí)，線狀的 重組DNA就象 入噬菌體DNA 一樣，被注入細(xì)胞并通過 cos位點(diǎn)環(huán)化。這樣 形成的環(huán)化分子含有完整的粘粒載體，

33、可象質(zhì)粒一樣復(fù)制并使其宿主獲得抗藥 性。因而，帶有重組粘粒的細(xì)菌可用含適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基挑選。通過這種方 式，就將外源DNA片斷通過粘粒載體克隆到大腸桿菌中去了。.加solution I前，沒有用STE洗滌，導(dǎo)致細(xì)菌菌株的細(xì)胞壁成分抑制 限制酶的活性；沒有用酚：氯仿抽提蛋白，導(dǎo)致DNA能耐受限制酶酶切；限制酶對(duì)甲基化敏感，而所采用的宿主為非甲基化缺陷型，可采用對(duì)甲基化不 敏感的同裂酶，或換用甲基化缺陷型的宿主菌株。.cDNA第一鏈太短或產(chǎn)量太低，盡管這些問題可能出自用于cDNA第一鏈合成的任一組分，但在更多情況下，它們反映出用作模板的mRNA的低劣質(zhì)量；文庫(kù)中cDNA插入片段的長(zhǎng)度小于期望值，

34、該問題一般歸于以下兩個(gè)原因a.cDNA第二鏈的合成效率不足，以致產(chǎn)生帶缺口或帶痕量mRNA的雙鏈cDNA分子；b.小片段DNA污染最終的cDNA制齊以 cDNA插入片段中Not I Sal I或EcoRI的位點(diǎn)數(shù)多于期望值；cDNA插入片段內(nèi) EcoRI位點(diǎn)的出現(xiàn) 頻率低于每4kb出現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)，該問題歸咎于雙鏈 cDNA內(nèi)EcoRI位點(diǎn)的 甲基化不完全；用適當(dāng)限制酶消化入噬菌體載體時(shí)切割不出cDNA片斷，該問題幾乎總是由于合成接頭未能有效地連接到雙鏈cDNA末端而造成。.DNA的分子大小，分子越大，則摩擦阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢；瓊脂糖濃度，一個(gè)給定大小的線狀DNA片

35、斷，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同； DNA分子的構(gòu)象；電源電壓，在低電壓下，線狀DNA片斷的遷移速率與所加電壓成正比。但是，隨著分子量的增加，高分子量DNA片斷的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小；電場(chǎng)方向；堿基組成和溫度；嵌 入染料的存在；電泳緩沖液的組成。.由大量的含有基因組DNA (即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的 克隆所構(gòu)成的群體，稱之為基因文庫(kù)。一個(gè)完全的基因文庫(kù)，應(yīng)該能夠保證從中篩選到目的基因。cDNA文庫(kù)：若這些大量的重組 DNA分子所含的外源DNA不是基因組DNA ,而是由某一生物的特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的

36、 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，他們所構(gòu)成的重組 DNA克隆群體，則稱之為cDNA基 因文庫(kù)。.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(Generalized transduction ):供體的單個(gè)或緊密連鎖的少數(shù)幾個(gè)基因被噬菌體因錯(cuò)誤裝配而轉(zhuǎn)移給相應(yīng)受體的現(xiàn)象稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。Phage在供體中裂解中，部分供體 DNA被包裝，當(dāng)感染受體菌時(shí)，若感染復(fù)數(shù)小于 1 時(shí)，缺陷phage可將供體DNA注入受體(此時(shí)原phage DNA不感染)，形成新的表型不一定穩(wěn)定，因?yàn)楣wDNA不一定與受體發(fā)生重組，故此類轉(zhuǎn)導(dǎo)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive transduction ),否貝1J稱完全轉(zhuǎn)導(dǎo)( complete transduction )；局限 性轉(zhuǎn)導(dǎo)Specialized (restricted ) transduction :只能使供體的一個(gè)或少數(shù)幾 個(gè)基因以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)移到受體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。低頻