通過對LB培養(yǎng)基的配制課件

1、2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作1 分子生物學(xué)實驗 三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 湖北省生物學(xué)實驗教學(xué)示范中心 2014年3月2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作2實驗內(nèi)容 實驗一 實驗準(zhǔn)備及培養(yǎng)基的制備與滅菌實驗二 質(zhì)粒DNA的提取實驗三 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測質(zhì)粒DNA實驗四 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗五 DNA重組（連接反應(yīng)）實驗六 植物DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗七 PCR基因擴增22022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作31.實驗準(zhǔn)備：器皿清洗、試劑配制、滅菌分裝、取用保存2. 離心機的使用打開離心機電源開關(guān)，進(jìn)入待機狀態(tài)。 選擇合適的轉(zhuǎn)頭離心管平衡誤

2、差應(yīng)在0.1克以內(nèi)。選擇離心參數(shù)：主要掌握離心機、微量移液器及高壓滅菌鍋的使用機及實驗操作注意事項實驗一 實驗準(zhǔn)備及培養(yǎng)基制備與滅菌【實驗準(zhǔn)備內(nèi)容】【實驗?zāi)康摹?022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作4將平衡好的離心管對稱放入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。蓋好轉(zhuǎn)頭蓋子擰緊螺絲。 按下離心機蓋門，如蓋門未蓋牢，離心機將不能啟動。 按START鍵，開始離心。離心開始后（特別是高速離心時）應(yīng)等離心速度達(dá)到所設(shè)的速度時才能離開，一旦發(fā)現(xiàn)離心機有異常（如不平衡而導(dǎo)致機器明顯震動，或噪音很大），應(yīng)立即按STOP鍵，必要時直接按電源開關(guān)切斷電源，停止繼續(xù)離心，并找出原因。機器如發(fā)現(xiàn)故障，請及時與有關(guān)人員聯(lián)系。使用結(jié)束后請清潔轉(zhuǎn)

3、頭和離心機腔，不要關(guān)閉離心機蓋，利于濕氣蒸發(fā)。 使用結(jié)束后必須登記，注明使用情況。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作5離心機的擺放位置2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作63. 移液器的使用移液器是生化與分子生物學(xué)實驗室常用的小件精密設(shè)備，移液器能否正確是用，直接關(guān)系到實驗的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，同時關(guān)系到移液器的使用壽命。移液器由聯(lián)系可調(diào)的機械裝置和可替換的吸頭組成，不同型號的移液器吸頭有所不同，實驗室常用的移液器根據(jù)最大吸用量有20ul, 200ul, 1ml等規(guī)格。微量移液器的操作步驟：將微量移液器裝上吸頭（不同規(guī)格的移液器用不同的吸頭）將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點；2022

4、/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作7垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液樣面下幾毫米，千萬不要將吸嘴直接插到液體底部；緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣液。否則液體進(jìn)入吸嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部，或吸入體積減少；等一秒鐘后將吸嘴提離液面平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點，再把按鈕壓至第二停點以排出剩余液體；提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦過；然后按吸嘴彈射器除去吸嘴。 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作82022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作9量液操作注意事項a. 連續(xù)可調(diào)移液器的取用體積調(diào)節(jié)要輕緩，嚴(yán)禁超過最大或最小量程；b. 在移液器吸頭中含有液體時禁止將移液器水平放置，平時不用時置移

5、液器于架上；c. 吸取液體時，動作應(yīng)輕緩，防止液體隨氣流進(jìn)入移液器的上部；d. 在吸取不同的液體時，要更換吸頭；e. 移液器要進(jìn)行定期校準(zhǔn)，一般由專業(yè)人員來進(jìn)行。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作104.手提式高壓蒸氣滅菌鍋的使用及注意事項首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。切物忘記加水，同時加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。放入內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋

6、緊相對的兩個螺栓，使螺旋松緊一致，務(wù)使漏氣。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作11 用電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.11MPa,121.5,20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓。打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因

7、鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出瓶口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷使用者。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作12將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)24小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。5. 實驗室安全與衛(wèi)生6. 分組：5人一大組，23人一小組，一個實驗桌1套移液槍7.準(zhǔn)備： 每組藍(lán)槍頭和黃槍頭各1盒，全班另加2包，EP管1盒或1包，30ml離心管12個，培養(yǎng)皿10個，全班1000ml的LB固體和液體培養(yǎng)基8. 實驗報告與成績評定平時成績50：考勤，實驗操作，實驗結(jié)果，預(yù)習(xí)報告考核成績50 ：實驗報告2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作13【思

8、考題】1.高壓蒸氣滅菌之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降低到“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？2.移液操作應(yīng)注意哪些事項？2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作14【LB培養(yǎng)基的制備及滅菌】【實驗?zāi)康摹?通過對LB培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。【實驗原理】 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作15LB培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常

9、用濃度下96時溶化，一般實際應(yīng)用時在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作16LB培養(yǎng)基由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖 LB固體培養(yǎng)基的配方如下： 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 瓊脂 1520g 水 1000mL pH 7.02022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作17【試劑】酵母提取物，蛋白胨， NaCl，瓊脂；mol/L NaOH， 1mol/L

10、HCl；試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH 5.59.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作18【培養(yǎng)基配制】LB液體培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g搖動容器直至完全溶解，加入200l 5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容1L。LB固體培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基加入15克瓊脂，0.11MPa,121.5,20min滅菌。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作19【操作步驟】1稱量 按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母

11、提取物、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。2溶化 在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品全溶解后，補充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補足所失的水分。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作20【操作步驟】3調(diào)pH 在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培

12、養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。 對于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說明書）。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作21【操作步驟】4分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面

13、，分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作22【操作步驟】5加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。6包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作23【操作步驟

14、】7滅菌 將上述培養(yǎng)基以1.1kg/cm2，121 ，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。8擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。9無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作24【思考題 】1.培養(yǎng)基配制好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題？為什么？2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作25實驗二 質(zhì)粒DNA的提取【實驗?zāi)康呐c意義】 質(zhì)粒DNA的提

15、取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種最常用的方法。 堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列。 通過本實驗學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作26【實驗原理】 堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作27細(xì)菌裂解的方法堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于 質(zhì)粒大量提取。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制

16、作28DNA抽提原理DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作29DNA抽提原理 SDS是一種陰離子表面活性劑，既可使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又可使一些蛋白質(zhì)變性，因此用SDS處理細(xì)菌，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時釋放出來。 釋放出來的DNA在強堿性（NaOH）條件下發(fā)生變性。再用酸性乙酸鉀來中和，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA因分子較大，難以復(fù)性。 離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞

17、碎片一起沉淀至離心管底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作30【儀器、材料與試劑】（一）儀器1.恒溫培養(yǎng)箱2.臺式離心機3.恒溫?fù)u床4.高壓滅菌鍋（二）材料1.葡萄糖2.三羥甲基氨基甲烷（Tris)3.乙二胺四乙酸（EDTA)4.氫氧化鈉5.十二烷基硫酸鈉（SDS)6.乙酸鉀 7.冰乙酸 8.氯仿2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作31【儀器、材料與試劑】9.乙酸10.胰RNA酶11.氨卞青霉素12.蔗糖13.溴酚藍(lán)14.酚15.8羥基喹啉16.巰基乙醇17.鹽酸18.含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌19.EcoR酶20.吸頭、小指管20

18、22/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作32【儀器、材料與試劑】（三）試劑1.溶液50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mM Tris-HCl pH8.0。2.溶液 0.4mol/L NaOH, 2%SDS，用前等體積混合3.溶液60mL的5mol/L KAc11.5ml冰乙酸28.5mL H2O4.TE緩沖液或水（+ 20g/ml RNase ）:10mmol/L，Tris-HCl pH8.01mmol/L，EDTA pH8.02022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作33【儀器、材料與試劑】5.70乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）6.胰RNA酶將RNA酶溶于10mmol/

19、L Tris-HCl(pH 7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于20。7.凝膠加樣緩沖液（6）40蔗糖、0.25溴酚藍(lán)2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作34Plasmidchromosome質(zhì)粒(plasmid )Plasmid 獨立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作35多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作36 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作372022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編

20、寫與制作38【操作步驟】一、菌種的活化1. 用接種環(huán)挑取 1 環(huán)冷凍保存的含質(zhì)粒 DNA 大腸桿菌工程菌（本實驗是 含人 Bcl-2 重組質(zhì)粒的 DH5 ），劃線接種于含有 Amp 的 LB 固體培養(yǎng)基平板上， 37 倒置培養(yǎng)約 12h( 過夜 ) 。 2. 用接種針或消毒牙簽從新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)中，37振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。3.取0.5ml菌液轉(zhuǎn)接于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴大培養(yǎng)23h（OD600nm 0.5，細(xì)胞數(shù) 108）。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作39二、提取步驟1.將2ml含相應(yīng)抗生

21、素（Amp:50g/ml)de LB培養(yǎng)基加入到試管中，接入上述的含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，37培養(yǎng)過夜。2.取2.0ml培養(yǎng)液在4、4000rpm離心2min，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥，3.加100l的溶液I，使菌體充分懸浮，室溫靜置10min。4.加200l新配置的溶液II，溫和上下顛倒2-3次，冰浴靜置5min。5.加150l的溶液III，上下顛倒混勻數(shù)次，冰浴靜置15min。6. 4，12000 rpm離心15min。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作407.取上清轉(zhuǎn)至另一離心管中，加等體積（400l）的酚：氯仿（1：1），充分混勻，室溫，12000rpm離心5min

22、。吸上清液至另一離心管中。8.向上清液中加入2倍體積（約1ml）預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，室溫放置510min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。9.加1 ml 預(yù)冷的70%乙醇，4，12000rpm離心5min，洗滌沉淀。10.棄上清，沉淀自然干燥后，加20l TE緩沖液溶解沉淀。11.加2l 10 mg/ml的RNaseA酶，-20保存。402022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作41產(chǎn)品序列號及組成K2200-50 (50 次)K2200-250 (250次)KarrotenTMDNA Mini Column502502ml Collection

23、 Tube50250Buffer K1 (Cell resuspension solution)15 ml 75 mlBuffer K2 (Cell Lysis solution) 15 ml75 ml Buffer K3 (Neutralization solution) 20 ml100 mlBuffer KB (Column balance solution)30 ml 150 mlBuffer KW (Wash solution)使用前加入70% 乙醇40ml使用前加入70% 乙醇200 ml Buffer KE (Elution solution) 5 ml 25 ml Karrot

24、en Plasmid DNA Extraction kit 質(zhì)粒DNA提取試劑盒組成 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作42Karroten Plasmid DNA Extraction kit 質(zhì)粒DNA提取試劑盒 1.將帶有目的質(zhì)粒的E.coli 接種于裝有5 ml LB/適當(dāng)抗生素的10-20 ml 的培養(yǎng)管中，37搖床培養(yǎng)20-24h，以擴增質(zhì)粒。用一個10-20 ml 培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶，其體積至少有培養(yǎng)液的3-4 倍。 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作432.取一KarrotenTM Mini Column 柱裝在一個2 ml 收集試管上(已備)。加入500 l Bu

25、ffer KB平衡液至柱子內(nèi)，室溫下10,000 rpm 離心1 min，使平衡液完全流過柱子。棄去收集管中的平衡液. （保留空的收集管，繼續(xù)往下使用）。特別注意：柱子不平衡，將導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率和純度的減少。 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作443. 取1.55.0 ml 的菌液，于室溫下12,000 rpm 離心3min 以沉淀菌體。 4. 倒出或吸出培養(yǎng)基。往沉淀中加入250 l Buffer K1，振蕩使細(xì)胞完全懸浮。細(xì)胞沉淀的完全重懸對于獲得高產(chǎn)量是十分重要的。 5. 往重懸混和液中加入250 l Buffer K2，輕輕顛倒混勻5-10 次。室溫靜置2-5 分鐘。避免劇烈混和裂

26、解液，否則會使染色體DNA 斷裂而使得到的質(zhì)粒純度降低。裂解反應(yīng)不要超過5 min。（當(dāng)使用完Buffer K2以后，須蓋緊其瓶蓋保存好，避免與空氣中的CO2 反應(yīng)。） 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作456. 往上述混和液中加入350 l Buffer K3 (可以預(yù)冷至4，也可以在常溫)，并溫和地上下顛倒離心管10-20 混勻，直至形成白色絮狀沉淀。7. 在4， 12000 rpm 離心10 min, 或者在常溫12000 rpm 離心3-4 min. (提高離心速度和時間有利于沉淀貼壁更加緊密，但是常溫長時間的離心會造成質(zhì)粒DNA 降解) 8. 小心將細(xì)胞離心的上清液轉(zhuǎn)至已平衡

27、的柱子內(nèi)，室溫下10,000 rpm 離心1 min，使裂解液完全流過柱子。棄去收集管中的過濾液. 9. 把柱子重新裝入2ml 收集管中，加入700 l Buffer KW (用70% 乙醇溶解)至柱子，室溫10,000 rpm 離心1min，棄去洗滌液。 注意：凍干的Buffer KW在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用70%乙醇溶解。如果 Buffer KW 在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下。 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作4610.（可選）重復(fù)用700 l 70%乙醇 （室溫）洗滌柱子。室溫下10,000 rpm離心1min。 注意：這一步對需要提取細(xì)胞轉(zhuǎn)染用途的質(zhì)粒來

28、說是必要的。其它的分子生物學(xué)實驗不需要。 11. 棄收集管中的濾液，將空柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。室溫下,13,000 rpm離心2 min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體。 （注意：省去這一步將導(dǎo)致殘留乙醇于質(zhì)粒中）。 12. 把柱子裝在一個干凈的1.5 ml離心管上，加入30-50 l（具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度，如果需要高濃度，可以用15 l）的Buffer KE (可用滅過菌的超純水或TE緩沖液代替)到柱基質(zhì)膜的中央，室溫放置0.5-1min, 13,000 rpm離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出80%左右的結(jié)合DNA。 如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來(不推薦)

29、2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作47常見問題可能原因?qū)Σ逥NA 產(chǎn)量低細(xì)胞在加入Buffer K2 前未完全打散保證完全重懸細(xì)胞細(xì)胞裂解不好適當(dāng)增加Buffer k2 的作用時間。Buffer K2 沒有蓋緊考慮更換新配制K2，成份：0.2M NaOH，1%SDS。純化柱未平衡使用前平衡Buffer K2 出現(xiàn)沉淀一般出現(xiàn)在低溫時 可以水浴提高溫度溶解產(chǎn)物出現(xiàn)高分子質(zhì)量DNA 污染物加入Buffer K2 后過度混勻細(xì)胞裂解液加入溶液后不要渦旋或劇烈地混勻裂解時間太長適當(dāng)縮短裂解時間產(chǎn)物不能酶切乙醇沒有完全從柱子上去除掉在洗脫前甩干柱子2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作48【

30、思考題 】1.在質(zhì)粒DNA提取過程中，Buffer K1Buffer K2 Buffer K3各起什么作用？2.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理是什么？3.分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA有哪些不同之處？ 4.在Buffer KE中為什么要加入EDTA？ 【實驗安排】 一個上午2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作49溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0);葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)

31、步驟中被除去。其實作用不大，葡萄糖可用水來代替。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作50實驗三瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測質(zhì)粒DNA 【實驗?zāi)康摹?通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù) 【實驗原理】 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片斷泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。20

32、22/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作51【實驗原理】 DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實驗提取的pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA,簡稱CCCDNA),開環(huán)質(zhì)粒DNA,即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂（open circular DNA,簡稱OCDNA),線狀質(zhì)粒DNA,即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂（linear DNA,簡稱LDNA)。 這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳

33、中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作52影響瓊脂糖電泳遷移的主要因素DNA的大小DNA的構(gòu)象瓊脂糖濃度 緩沖液2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作53【儀器、材料與試劑】（一）儀器1.恒溫培養(yǎng)箱2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)3.臺式離心機4.高壓滅菌鍋 5.凝膠成像系統(tǒng)（二）材料1.三羥甲基氨基甲烷（Tris)2.乙二胺四乙酸（EDTA) 3.溴化乙錠 4.硼酸5.溴酚蘭 6.蔗糖7.瓊脂糖 8.DNA marker 9.pUC19質(zhì)粒2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作54【儀器

34、、材料與試劑】（三）試劑1.5TBE(5倍體積的TBE貯存液)配1000ml 5TBE:Tris 54g硼酸 27.5g0.5 mol/L EDTA 20mlpH8.02.凝膠加樣緩沖液（6）溴酚藍(lán) 0.25蔗糖 403. 瓊脂糖4. EB 0.5g/ml 5. EcoR酶2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作55【實驗步驟】1.取5l質(zhì)粒DNA溶液，加1l酶切緩沖液，EcoR酶1l（2U),無菌水補至總體積10l，37保溫3小時，加凝膠上樣緩沖液（6）2l，準(zhǔn)備電泳。酶切溶液：EcoR酶切位點 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-3DNABufferEcoRddH2OTotal5l1

35、l1l3l10l2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作562022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作572022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作582.制備瓊脂糖凝膠 稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml 0.5TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1瓊脂糖凝膠。3. 膠板的制備取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙）。將有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。將冷卻到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）【實驗步驟】2022/7/29三峽大學(xué)

36、李曉玲編寫與制作59【實驗步驟】 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)。 加入電泳緩沖也至電泳槽中。4.加樣 用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔（記錄電樣順序及點樣量）。5.電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片斷從負(fù)極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。 當(dāng)溴酚藍(lán)燃料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。6.染色 將電泳后的凝膠浸入EB溶液中，染色15min,以觀察在瓊脂糖凝膠中的質(zhì)粒DNA帶（戴手套操作）。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作60【凝膠電泳操作注意事項】1.緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時，電導(dǎo)率最小，

37、DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。2.瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。3.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。4.樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致

38、拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作61【凝膠電泳操作注意事項】5. 電泳系統(tǒng)的變化會影響DNA的遷移，加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的。6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作62【實驗結(jié)果】在凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈觀察拍照（戴

39、手套操作）。DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶。1 2 3 4結(jié)果照片圖1.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（marker)2.pUC19質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoR完全酶解3.pUC19質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoR部分酶解4.自提的pUC19質(zhì)粒DNA（此結(jié)果提得較好，為1條帶，以超螺旋質(zhì)粒DNA為主。有時結(jié)果是3條帶，分別為超螺旋質(zhì)粒，線狀質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒。還有時結(jié)果為2條帶）2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作63【思考題】1.如何提高瓊脂糖凝膠電泳的分辨率 ？2. EB染色的特點和注意事項是什么？3.酶切緩沖液的功能是什么？4.凝膠加樣緩沖液的兩種成分的作用是什么？5.如果電泳圖譜出現(xiàn)連續(xù)模糊的帶紋，原因是什

40、么？【實驗安排】時間實驗內(nèi)容14:00-17:00 8:00-11:00質(zhì)粒DNA的酶切17:00-18:30 11:00-12:30瓊脂糖凝膠電泳18:30-19:00 12:30-13:00染色、拍照2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作64實驗四 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)及轉(zhuǎn)化體篩選的技術(shù)方法?！緦嶒炘怼扛惺軕B(tài)細(xì)胞(Competent cells): 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（ 如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受

41、態(tài)細(xì)胞(competent cell)。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作65【實驗原理】轉(zhuǎn)化（transformation）： 是將異源DNA分子引入受體細(xì)胞，使其獲得新的遺傳性狀的一種技術(shù)方法。 進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作66【實驗原理】轉(zhuǎn)化的方法：1.化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；2.電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液

42、或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作67【實驗原理】克隆的篩選： 主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作68【影響轉(zhuǎn)化率的因素】細(xì)胞生長狀態(tài)和密度。 轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量和濃度。試劑的質(zhì)量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作692022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作702022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作712022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作72【儀器、

43、材料和試劑】（一）儀器1.無菌超凈臺 2.離心機3.電熱恒溫水浴鍋 4.分光光度計5.恒溫?fù)u床 6.恒溫箱 7.超低溫冰箱（二）材料和試劑1.菌株： E.coli DH52.質(zhì)粒：PUC19質(zhì)粒3.LB培養(yǎng)基4.含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度 50-100gml5.預(yù)冷CaCl2溶液（0.1molL）2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作73【實驗步驟】（一）菌種活化 1.用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37培養(yǎng)16小時。2.挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到35mlLB培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)35小時3.將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)23小時，到OD

44、6000.30.42022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作74【實驗步驟】（二）感受態(tài)大腸桿菌的制備1.從新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)中，37振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。2.取1.5ml菌液轉(zhuǎn)接于30ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴大培養(yǎng)23h（OD600nm 0.4-0.5，細(xì)胞數(shù) 108,此為實驗成功關(guān)鍵）。3. 將菌液轉(zhuǎn)到30ml離心管中，冰上冷卻 10min；2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作75【實驗步驟】4.于4，4000rmin離心10min；5. 倒凈上清培養(yǎng)液，將管倒置10min以便培養(yǎng)液流盡；6.用6ml冰

45、冷的0.1mo1LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴30min；7. 04，4000rmin離心10min，回收細(xì)胞；8. 棄上清，加1.2ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶 液，小心懸浮細(xì)胞，分裝，200l一份，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。9. 制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，也可加入占總體積15左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作76（三）細(xì)胞轉(zhuǎn)化編號組別質(zhì)粒DNA/lTE buffer/l0.1mo1L GaCl2/l感受態(tài)菌液1受體菌ck102002質(zhì)粒ck10（0.

46、5g）2003陽性ck10（0.5g）2004轉(zhuǎn)化實驗組10（0.5g）2002022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作77【實驗步驟】（三）細(xì)胞轉(zhuǎn)化1. 取200l感受態(tài)細(xì)胞懸液加入pUC19質(zhì)粒DNA 10 l(10-100ng), 輕輕搖勻，冰上放置20-30min。同時設(shè)置兩管對照：受體菌對照：200l感受態(tài)細(xì)胞10lTE buffer質(zhì)粒對照： 200l0.1mo1L GaCl2溶液10l質(zhì)粒DNA溶液陽性對照： 200l感受態(tài)細(xì)胞10l純質(zhì)粒2. 42水浴中保溫12min，然后迅速冰上冷卻2min。3. 立即向上述管中加入0.8ml LB液體培養(yǎng)基，（即得轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液），搖勻后于3

47、7振蕩培養(yǎng)約60min ，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作78【實驗步驟】（四） 平板培養(yǎng)1.取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，涂在含100 g/ml Amp的LB平板培養(yǎng)基上。2.菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于 37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-16小時，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作79【實驗結(jié)果】在含氨卞青霉素的瓊脂平板上生長的菌落即為含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作80【實驗結(jié)果】不含抗菌素 平板含抗

48、菌素平板 結(jié)果說明受體菌對照組有大量菌落長出無菌落長出本實驗未產(chǎn)生抗藥性突變株DNA對照組無菌落長出無菌落長出質(zhì)粒DNA溶液不含雜菌轉(zhuǎn)化實驗組（陽性對照）有大量菌落長出有菌落長出質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞便產(chǎn)生抗藥性表3.1 培養(yǎng)皿內(nèi)各實驗組菌落的生長狀況及結(jié)果分析2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作81【計算轉(zhuǎn)化率】 統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)每mg質(zhì)粒DNA）轉(zhuǎn)化子總數(shù)質(zhì)粒DNA加入量(mg) 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)對照組

49、菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積涂板菌液體積 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化子總數(shù)感受態(tài)細(xì)胞總數(shù) 2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作82【思考題】1.感受態(tài)細(xì)胞有何特點？如何保證它的質(zhì)量2.為什么要設(shè)置陰性對照？3.如陰性對照中長出菌，原因？4.在Amp培養(yǎng)板中，菌的密度過高或培養(yǎng)時間過長時會在陽性菌的周圍長出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是 Amps的，原因？5.還有哪些方法可以將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞？各有什么優(yōu)缺點？ 【實驗安排】從制備感受態(tài)細(xì)胞到轉(zhuǎn)化一天可完成2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作83實驗五 重組DNA（連接反應(yīng)）【試驗?zāi)康摹客ㄟ^本實驗學(xué)會重組DNA連接及鑒定重組子的方法【實驗原理】

50、外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)過酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。連接酶有兩種：E. coli 和T4 DNA連接酶。兩種連接酶都有將具黏性末端的DNA片段之間的連接在一起的功能。 T4 DNA連接酶還能使兩個具平末端的雙鏈DNA連接在一起。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作84【實驗原理】為防止載體本身的自連，可通過牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理克服： 牛腸道分離，切除DNA、RNA和dNTP上的5磷酸基團(tuán), 從DNA片段上除去5磷酸以防

51、自身連接。DNA重組的方法主要有：具互補黏性末端片段之間的連接和具平末端DNA片段之間的連接重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。842022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作85【實驗原理】利用互補現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法: 載體：含有-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列和-半乳糖苷酶N端146個aa的編碼序列（肽鏈） 宿主：缺失了lacZ基因，可編碼-半乳糖苷酶C端序列 -互補：宿主lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體可以與質(zhì)粒載體帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現(xiàn)互補。 在這樣的系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌獲得了amp抗性，自連質(zhì)?？梢院铣烧５?/p>

52、酶，而重組質(zhì)粒的細(xì)菌不能合成正常的酶。在培養(yǎng)基中添加酶的誘導(dǎo)物IPTG，乳糖的類似物X-gal乳糖酶作用下顯示藍(lán)色，藍(lán)斑是載體自連產(chǎn)物，而白色克隆是重組質(zhì)粒。852022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作862022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作872022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作882022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作892022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作902022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作912022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作922022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作93pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmal XmalBa

53、mHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllac Zori0447Amlll 806Ppai 1765Ctr10i1 1779Gsul 1784Scal 2177Xmnl 2294Sspl 2501Aatll 26117EcoO 1092674Ndel 183Narl 235Plac質(zhì)粒 pUC19932022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作94 質(zhì)粒 pUC19示意簡圖942022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作95多克隆位點啟動子裂開的N端裂開的N端外源DNA 半乳糖苷酶N端編碼序列pUC192686bppUC192686bp染色體重組體pUC19細(xì)菌在含

54、X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑IPTG的瓊脂上培養(yǎng)細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC19含重組體pUC19的白色菌落藍(lán)色菌落含載體pUC19的藍(lán)色菌落 半乳糖苷酶C端編碼序列轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化利用 互補原理篩選重組子pUC19amprampr2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作96【儀器、材料和試劑】（一）儀器1.臺式離心機 2.電熱恒溫水浴鍋 3.恒溫?fù)u床4.恒溫培養(yǎng)箱 5.超低溫冰箱 （二）材料和試劑1.菌株： E.coli DH52.質(zhì)粒：PUC19質(zhì)粒3.LB培養(yǎng)基4.含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度 50-100gml）5.培養(yǎng)皿、接種針、玻璃涂棒、試管、酒精

55、燈、鑷子、牙簽等6.預(yù)冷CaCl2溶液（0.1molL）962022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作97【儀器、材料和試劑】7.二甲基甲酰胺 8.T4DNA連接酶 9.DNA 10.EcoR酶11. 3mol/L KAc (pH5.2)12.Xgal:將Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于20。13.IPTG:取2g IPTG溶于8ml雙蒸水中，再用雙蒸水補至10ml,用0.22m慮膜過濾除菌，每份1ml,貯存于20。 14.TE緩沖液 10 mmol/L Tris.HCl(Ph8.0) 1mmol/L EDTA972022/7/29三峽大學(xué)李曉

56、玲編寫與制作98【實驗步驟】（一）質(zhì)粒DNA的提取按實驗一的方法提取質(zhì)粒（二）制備重組DNA1、在滅菌的Eppendorf管中，加入pUC19質(zhì)粒1l（2ug/ul），2l酶切緩沖液，1lEcoRI酶，無菌雙蒸水15l，至反應(yīng)混合物總體積為20l，離心均勻，37反應(yīng)3h(酶及緩沖液應(yīng)放在冰上）。982022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作992、在另一無菌Eppendorf管中，加入DNA 1.5ug,加入1l酶切反應(yīng)液， 1l（2U）EcoRI酶，無菌雙蒸水補到10l，37反應(yīng)3h。3、反應(yīng)完畢后各取2l酶解液做電泳分析。4、分別將余下的酶解液加入1/10體積的3mol/L KAc（pH5

57、.2)溶液，再加入2倍體積的無水乙醇，20冰箱，2h（沉淀DNA）。12000r/min 4 離心15min，棄上清，加70乙醇洗滌沉淀物，再離心，去上清，真空干燥后，加5lTE溶液。5、將酶切后的2個DNA片斷混合于一管中，加T4DNA連接酶緩沖液2.5l， T4DNA連接酶1l ,加16.5l無菌雙蒸水,14 保溫14h ，并做轉(zhuǎn)化實驗?！緦嶒灢襟E】992022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作100【實驗步驟】（三）制備涂菌的瓊脂板LB培養(yǎng)基含10g/ml氨芐青霉素，瓊脂15g/l倒入培養(yǎng)皿，凝固4保存。（四）制備感受態(tài)細(xì)胞1、按實驗3的方法制備感受態(tài)細(xì)胞。2、在200l新制備的感受態(tài)細(xì)

58、胞中，記入5l連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置30min，同時做兩個對照管。受體菌對照：200l感受態(tài)細(xì)胞2l無菌水質(zhì)粒對照： 200l0.1mo1L CaCl2溶液2l質(zhì)粒DNA溶液3、將管放到 42水浴中保溫12min，4、冰上冷卻12min。5、每管中加入0.8ml LB液體培養(yǎng)基，（輕輕混勻）。37溫浴45min，慢搖 ，1002022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作101【實驗步驟】6、在預(yù)制的LB瓊脂板上，加40l20mg/ml Xgal 和4l 200mg/m l IPTG溶液，并用滅菌玻璃推子（酒精燈上燒后冷卻），均勻涂布于瓊脂凝膠表面。7、將適當(dāng)體積（200 l）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞

59、均勻涂在上面的培養(yǎng)皿上，將平皿放置37溫箱30min，至液體被吸收。8、倒置平皿37培養(yǎng)1216h,出現(xiàn)菌落。其中白色菌落為重組DNA質(zhì)粒。1012022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作102【實驗結(jié)果】 經(jīng)121h培養(yǎng)后，培養(yǎng)皿上生長著很多白色菌落藍(lán)色菌落，白色菌落為DNA重組子。白色菌落為重組子藍(lán)色菌落為不含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌的菌落1022022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作103【思考題】1.什么是DNA重組？它包括哪些因素？2.如何提高DNA的重組效率？3.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素有哪些？4.為什么轉(zhuǎn)化后的瓊脂板上有的沒有白色菌落？5.藍(lán)白斑篩選的原理是什

60、么？【實驗安排】本實驗約需2天1032022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作104實驗六 植物基因組DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測【實驗?zāi)康摹客ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)從植物組織中提取DNA的方法【實驗原理】細(xì)胞提取液中含有的SDS可溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用氯仿異戊醇抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。2022/7/29三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作105【儀器、材料與試劑】 (一)儀器1.低溫離心機2.恒溫水裕器3.臺式離心機4.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) （二）材料1.水稻幼葉 2.三羥甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸（EDTA） 4