植物基因工程08級課件

1、第七章 植物基因工程一、植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀二、植物基因工程方法三、轉化子細胞的篩選四、轉化體的鑒定與證實五、植物基因工程研究的應用和展望一、植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀1、植物的遺傳改良方法傳統(tǒng)的育種方法 以基因突變體為種質基礎，以有性雜交為基因導入手段，以選擇優(yōu)良基因型重組體為目的的植物性狀的改良過程。植物基因工程以植物為受體的一種基因操作，即以分子生物學為理論基礎，采用基因克隆、遺傳轉化，以及細胞、組織培養(yǎng)技術將外源基因轉移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術體系。2、植物基因工程的應用前景改變植物的遺傳性狀。 獲得抗病、抗蟲、抗除

2、草劑等抗逆性狀； 改良農(nóng)作物農(nóng)藝性狀，提高產(chǎn)品質量； 改變植物的育性和不親合性。作為一種生物反應器。藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)；生產(chǎn)某些有機化合物。植物基因功能研究。3、植物基因工程研究成果 通過國家商品化生產(chǎn)或安全證書的有轉基因耐貯藏番茄、轉查爾酮合成酶基因矮牽牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗病毒辣椒、抗蟲棉花等6種我國自主研制的轉基因植物。轉基因番茄 1994年，美國政府批準了他們研制成功抗干旱、早熟、保鮮的轉基因番茄商品化之后，我國也相繼成功培育出優(yōu)良品種的轉基因番茄，以滿足人們的需求。 轉基因甜椒 甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國科學工作者，采用轉基因技術，培育出抗病毒的

3、甜椒。轉基因玉米 玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品和工業(yè)的原料以及作飼料，渾身是寶。人們稱它是含金的植物。如今培育出轉基因玉米，品質更好，產(chǎn)量更高。 我國科學工作者，用轉基因技術，可以轉變矮牽牛花的花色，使矮牽?；ǖ幕ㄉ迂S富多彩。 轉基因牽?；?轉基因油菜 油菜是人們食用油的主要來源之一。一般油菜籽的含油量約為40左右。通過轉基因技術，培育出來的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質量更好轉基因小麥 從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把這基因轉入小麥植株中，培育出轉基因小麥。用這種轉基因小麥制造出來的面粉，更適合用來烤面包，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包的營養(yǎng)

4、價值高。 二、植物基因轉化的方法原生質體介導法基因槍法根癌農(nóng)桿菌介導法種質系統(tǒng)的基因轉移（花粉管導入法）1、原生質體介導法 以原生質體為受體，借助于特定的化學或物理手段將外源DNA直接導入植物細胞的方法。 原生質體介導的基因轉化是植物遺傳轉化研究中最早建立的一個轉化系統(tǒng)。包括5種方法：聚乙二醇介導的基因轉化脂質體介導基因轉化電激法介導基因轉化顯微注射介導的基因轉化激光微束介導的基因轉化PEG介導的基因轉化 利用化學試劑，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、多聚-L-鳥氨酸(pLO)和磷酸鈣等，誘導原生質體攝取外源DNA分子，進入原生質體的外源DNA分子就有可能通過某種機制整合到基因組中，

5、完成遺傳轉化過程。 第一例成功的轉基因煙草就使用該轉化方法獲得的。 脂質體介導基因轉化 利用脂類化學物質包裹外源DNA成球體，通過植物原生質體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質體轉入受體細胞。 特點：轉化率高；操作繁瑣；技術性更高。電激法介導基因轉化 利用高壓電脈沖作用，在原生質體膜上“電激穿孔” ，形成可逆的瞬間通道,從而促進外源DNA進入原生質體。 特點：轉化率高；操作簡便 ；特別適于瞬時表達的研究；容易造成原生質體損傷。顯微注射介導的基因轉化 利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細胞質或細胞核，從而實現(xiàn)外源基因的轉移。 特點：方法簡單、轉化率高；適用于各種植物和材料，無局限性；對

6、受體細胞無毒害。激光微束介導的基因轉化 將激光引入光學顯微鏡聚焦成微米級的微束照射培養(yǎng)細胞，在細胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細胞，實現(xiàn)基因的轉移。 優(yōu)點：操作簡便；工作效率高；適應于各種動植物；受體的類型廣泛；用于細胞器的基因轉化。 2、基因槍法(particle gun) 將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細胞或組織，微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上并得到表達，從而實現(xiàn)外源基因的轉化。根據(jù)基因槍的動力系統(tǒng)，分為3種類型火藥爆炸力為加速動力，采用塑料子彈和阻擋板。塑料子彈前端載放著DNA包裹的鎢/金粉。

7、高壓氣體作為動力，如氦氣、氫氣、氮氣等。把載有DNA的鎢/金粉鋪灑在一張微粒載片上，在壓縮空氣的沖擊下，驅動載片，當載片受阻于金屬篩網(wǎng)時，載有DNA的鎢/金粉繼續(xù)向下沖擊射入細胞。高壓放電為驅動力，可以無級調速，通過變化工作電壓，使載有DNA的鎢/金粉粒子能達到目的細胞層。PDS-1000/He系統(tǒng)基因槍的操作步驟DNA微彈的制備：金粉或鎢粉50100mg、DNA、CaCl2、PEG4000和亞精胺靶外植體材料準備DNA微彈轟擊轟擊后外植體的培養(yǎng)轉化率及其影響因素金屬微粒的影響DNA沉淀輔助劑的影響DNA的純度及濃度對轉化率的影響微彈速度的影響植物材料的內在因素的影響3、根癌農(nóng)桿菌介導法植物冠

8、癭瘤植物的一種癌癥冠癭瘤的起因：由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)屬根瘤菌科(Rhizobiaceat)對植物的侵染而引起冠癭瘤的侵染過程：細菌通過傷口進入植物，在基因水平上轉化植物。細菌DNA中的編碼基因在植物細胞中表達，刺激植物細胞不受控制的分裂，形成瘤。冠癭瘤Ti質粒(Tumor inducing plasmid)Ti質粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合環(huán)狀DNA分子，其分子量為95156 106D，約有200kb。Ti質粒的類型： 根據(jù)冠癭瘤合成的冠癭堿種類不同分為：章魚堿型 (octopine) 胭脂堿型 (nopaline)農(nóng)桿堿型 (

9、agropine) Ti質粒的基因結構：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)和Ori區(qū)共4個區(qū)段。 Ti質粒的遺傳特性T-DNA區(qū) (transfer DNA region) Ti質粒中的一部分DNA片段，進入寄主細胞并插入基因組中，能夠利用植物的酶系統(tǒng)進行轉錄和翻譯，其表達產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。T-DNA區(qū)結構特征：左右兩端邊界各有一個25bp長的正向重復序列(Lb和Rb) ，具有高度保守性。右邊界突變和缺失導致轉移能力降低或喪失。T-DNA以單拷貝或多拷貝的形式隨機整合到植物染色體DNA上。胭脂堿T-DNA (23kb) pTiC58章魚堿T-DNA (13.6kb) pTiAch5NOS：

10、胭脂堿合成酶基因 ocs：章魚堿合成酶基因；tmr：根性腫瘤基因tms：芽性腫瘤基因；tml：大腫瘤基因Vir區(qū)(毒性區(qū))在Ti質粒T-DNA區(qū)的上游的一組基因。表達產(chǎn)物激活T-DNA向植物細胞轉移，使植物引發(fā)腫瘤。 Con區(qū)含有農(nóng)桿菌之間接合轉移有關的基因(tra)Ori區(qū)(復制起始區(qū))調控Ti質粒自我復制。取代型Ti質?？寺≥d體 用E.coli質?？寺≥d體取代野生型Ti質粒的全部或部分T-DNA核苷酸序列，構建的載體。 onc-Ti質粒克隆載體 T-DNA上Onc基因被取代；保留T-DNA的兩端邊界序列和nos基因。 onc+Ti質?？寺≥d體 T-DNA上的部分序列被pBR322所取代，仍

11、保留Onc基因。進入植物細胞后，可誘發(fā)冠癭瘤，如pGV3850和pMPG1。 pGV3850從胭脂堿Ti質粒pTiC58衍生而來含有T-DNA邊緣區(qū)，以及除T-DNA以外全部的DNA序列臨近右側邊緣區(qū)(RB)編碼胭脂堿合成酶的nos基因，供作鑒定轉化細胞的記號缺失的T-DNA核心區(qū)由pBR322序列取代 IQM1pBI121-P35S:IQM1-Hm35S啟動子是植物基因工程中常用的組成型啟動子中間質粒克隆載體 T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質?？寺≥d體，承載外源基因后，須先在輔助質粒推動下進入農(nóng)桿菌，再在農(nóng)桿菌介導下送入植物細胞。共整合克隆載體系統(tǒng)利用體內重組技術構建大型無毒的Ti質粒重組

12、體雙元克隆載體系統(tǒng) 將帶有外源目的基因的T-DNA和Vir區(qū)，安置在不同的質粒載體上進行操作。 特點：由兩個彼此相容的Ti質粒組成 含有Vir區(qū)的質粒；含有T-DNA區(qū)段的DNA轉移質粒 共整合克隆載體系統(tǒng)雙元Ti載體系統(tǒng)根癌農(nóng)桿菌Ti質粒介導的基因轉化的分子機理農(nóng)桿菌對受體的識別農(nóng)桿菌附著到植物受體細胞誘導啟動毒性區(qū)基因表達類似接合孔復合體的合成和裝配T-DNA的加工和轉運T-DNA的整合三、轉化子細胞的篩選1、選擇基因：一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。新霉素磷酸轉移酶 (neomycine PT,NPT)基因 含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，攜帶NPT基因的轉化細胞存活；非轉化細胞致

13、死。強選擇標記，應用廣泛，但假陽性率高。潮霉素磷酸轉移酶(hygromycin PT ,HPT)基因 在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上，攜帶HPT基因的轉化細胞具有抗潮霉素的能力，能夠存活；非轉化細胞致死。慶大霉素抗性基因(gentr)膦絲菌素乙酰轉移酶基因(bar)2、報告基因：是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是否成功的導入受體細胞，是否啟動表達的一類特殊用途的基因。_葡萄糖苷酸酶基因(gus) GUS是一種水解酶，能催化某些特殊反應進行，通過對反應產(chǎn)物的檢測即可確定Gus基因的表達。熒光素酶(luciferase, LUC)基因 LUC是一種源于螢火蟲的動物蛋白基因產(chǎn)物，能夠催化生物發(fā)光反應。四、轉化體的鑒定與證實PCR檢測外源基因的整合Southern雜交檢測外源基因的整合RT-PCR檢測外源基因的表達Northern雜交檢測外源基因的表達Western雜交檢測外源基因表達的產(chǎn)物五、植物基因工程研究的應用和展望1、抗逆基因工程-第一代植物基因工程抗蟲基因工程：毒素蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物外源凝聚素類基因抗除草劑基因工程：修飾改造的除草劑作用靶蛋白基因；除草劑解毒基因。抗病基因工程：抗病基因、解毒酶類基因、抗菌肽及抗菌蛋白類基因