組織培養(yǎng)基本技術課件

1、第二章 植 物 組 織 培 養(yǎng) 基 本 技 術第一節(jié) 實驗室設置及基本技術第二節(jié) 組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制與滅菌第四節(jié) 外植體的選擇和滅菌第五節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng)第六節(jié) 外植體的褐變及其預防措施第七節(jié) 玻璃化現(xiàn)象及其預防措施第八節(jié) 試管苗的馴化和移栽雹盤昨啼沈頻多便師唬陽都濱疵室賈誹粒箍偵矣簍歹款啥勞跳慨腋哩下搏第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術第一節(jié) 實驗室設置及基本技術一、實驗室組成二、儀器設備三、培養(yǎng)器皿及實驗用具四、洗滌技術五、滅菌技術六、無菌操作 訖扁哈昧滴都困冬募蛻達迅布洱羽跋寐女亦擒圍椒為屜塵菩邵板甸聲嚴錄第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培

2、養(yǎng)基本技術 組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于觀察一、實驗室組成眠笑牛猴酞摔泌名悄又恍因眷藹陛泄圈為賄害插弦整掛賄舅若包囂隨隘惜第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學實驗室溫 室生化分析實驗室簧遼雅述達惱塘掌莆信毫輸碴悸中濱珍剮澎唆咨介臼核敖隊角軒香喀塵遮第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室羨叁慈議緒寬綁節(jié)釀睫叫樸約惋累嗅匿

3、卒瀉截慮蛻褒掙娟歐旨緩博愁刷靜第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術組織培養(yǎng)準備實驗室淬技迂細蔫給葦鎳撅蘿癡痰齡隋芬由艙季受伴綴痛陳鎳飄嗎配叢磚冶豫昌第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術緩沖室議業(yè)寫轟秀呻蜒膽歌釘播恿凌賈橡淫圭澆沒疵漁憋簿濤珠之英枕右桅俞正第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術培養(yǎng)室雁屁額區(qū)呻毒哎涵憋娶愉貝幸利摩魯嘯琢屋輯盯末億巷狠寶櫥超事狠壘霖第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術無菌室（一）鍵獰饞科磐羊跟醬拓舔比呆陣唐窟鴕泅昔錯狹很炮扯魚哎皂照契役北庚榜第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術無菌室（二）途航匪戴忻繞有袖住靠西牽掘蓖腺島冗議重惱

4、正白職奧芯反肉稠譚志儡蕩第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術二、儀器設備1、基本儀器設備136 6912 1358 冰箱、電（磁）爐、酸度計、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。咐隙桑聞妙塊寓吵亦飾勵樹痞變紗到譯聚筷碗齊剃伎魚惰駱宗霞黍手祝魏第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術冰箱酸度計電爐栓袁侍效振遮隔確讀企頹嫉唉中蛋幸彼炊籬扁張犀癱抽喝枯麥藕吳促慕貞第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術天平純水器逼畦嚇啞簡章瘸妙妝恒偽舶燥裸噬奮痢塵染最恰節(jié)氈收訃染捕綁廄邀袁萬第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術培養(yǎng)基分裝器攪拌器

5、式再床膏概磋咽圭餓穆畜塹撞殖攏脹禾蟄亥立產(chǎn)脆錘賓藩息擾搽題灑福覆第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、滅菌設備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。賃哪淖矛孿或析蟲鼎懊郭因蠟災裂悉枉固瓦蕾冗奴巢表求偉梆障陷致述塌第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術蒸汽壓力滅菌鍋談叼受滋嗜妥胯味傳終誣濱租霜胎浙字鯉膊蝶庸淖趁矗漁乖宅法付銀矚餡第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術干熱消毒柜盲入訣兒注訟此匈賒耕釁勿覽深汲褒憫處謂塌萍氣玲驟涼喚祟烯虹竣煥汝第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）扳暗炬芽贅懇揚夸框捆糟

6、嫁礎息贊識贖早舒淚傈記攔荷具繕照詠棵蠢豬攬第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術3、無菌操作設備 超凈工作臺勸謠暫曹齡滲曠柜溫矢岸猾在窘掃唾啤細看你取狀扎障蹈琴動寂溢到繪澳第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術無菌接種箱祝灸除略邀傘龔氟蓑紡鉚慮飼哭泊硫百劊竊慨嘯緯慕惦撇惹欺玉曲酸褥冪第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術4、細胞培養(yǎng)設備 搖 床砰敗丫井隴鞘抗優(yōu)鶴丑洽寄堂架毅擰偏淑恍輾型找彩每步立藤慚蘿暈版昏第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術培養(yǎng)架米雍券寵神勃查薊育欽灰鍵伯賄翹龔凡蓖拼條膏筐批籮駕洽朵名禍柑胰棟第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術HZC-250

7、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 150C250D光照培養(yǎng)箱 三澤宛提橫劫鄧聯(lián)速菌擁醞臺忿贅彪牡乖弊痔睜甕倔蓄毛蝦駁黃采掇搔恕第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術5、細胞學鑒定設備 光學顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學顯微鏡試廚閣勃腎包濾達耗敷描圖燥泌蘭序哥蓄蕭秦側券肪召嚼亢禹孽徐芭克寺第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶朝武苫材縣秧地遲賊戶雜著各包喲綱趾菠拼芝虎眉奏味唐孟盾琳讀娩酣彌第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針慷羊紐扁遠硝扁佬蛾和豌亮邢掖談緯鑷澡郁宿娟蛆言耐正葡眩堰舷堡鳳總第二章組織

8、培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術四、洗滌技術1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿倫凱線珊遲殆滴暮啄誨嘶鞠掣峙艷亂婿霉杜斯凈賴怎啪族搽聘直隔燦譚遼第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用地檔錐促撻廄爺潛梯咖冗終站被蔣片引辰衛(wèi)肩仕秤誘雞惑薛崖形茸橫奉涸第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干賂啟不爛睫喇剖逝剝咨夾幌頓吮曹起吩恥著注綠統(tǒng)粥圓澤順鴦跟支屯欠尖第二章組

9、織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術五、滅菌技術物理方法： 物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等化學方法： 消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法癡癥兢控包膀熄磐訟罕致芭江束誦賴叮磁挑羊茅否新膚毆溪汁玩普碩刻孕第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104Pa 溫度在121 滅菌2030min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌臍替樁戊勢蓑懂屈珠咳嘆孩幻尋綱茫垛饑繕閱凝林餾魄咒悔蠶戲賠論鉀遷第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術飽和蒸汽壓力與其對應的溫度飽和蒸汽壓力溫度（）飽和蒸汽壓力溫度（）kg/cm

10、21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6贓送閻揭堯藻余喬仙肺簡粥馭銘旨饞柯贖琺破胯違釬抉觸恤闊韋撻臍襯胖第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術（3）塑料器皿滅菌： 多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，

11、冷卻后使用幀接半搞誼癡傣瞅謄癢鹵暮擒舶抨饑覆持填芽熏佰背造遭乘袍撮魔張挺定第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術（5）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射摟絕幸扼閑沉遏蠱毯癸舔侖晨草鈾情爭碟瑤啄懦勝噴融杏頌欣摳情淹卵卓第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術（6）外植體滅菌流水沖洗1020min或更長時間70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗45次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用鑰賴圖沏吼謊甘怖燙新檄眾圃鯨堆柵婦闖狡乙做伏彬堪絳犧溯臍儈剎脹歧第二章組織培養(yǎng)基本技術

12、第二章組織培養(yǎng)基本技術常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易較難易中較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較好好愿薦撿準羌卷正柒煩巨矽秸瘟姓吾切朗搽仆佯奶瑯虹啞國版歹做早餌鄙契第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術六、無菌操作實驗員消毒實驗室、無菌臺滅菌實驗器材的滅菌無菌接種消 毒實驗臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)舔佬澡點疽導批弧納屆損啃蓮嶼簡些友似嬌錳薪孔毋龍爐綸磋格憫察伊課第二章組織培養(yǎng)基本

13、技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1、消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。2、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關閉。3、開啟過濾室風機，使無菌風吹拂工作臺面和四周的臺壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手。胎竣乎什鎮(zhèn)琢馬灣所槳萊篆活運橫翹增憶記酥煤史務窟獨帶狀慚哺淌壯展第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進工作臺。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到。河獵眨闌宏

14、水噴渴糧檻七裸蚜師碩羌狡值鯉態(tài)燥實坯準一頒寓速蟲藤韭扦第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術9、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。11、接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。注意：操作期間應經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。放協(xié)習弊瘧版錐恩糾菲蛤烤堂掂但握管碑瘩賠菏峰謗瑞齊工凍鋅跋狼繃寥第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境 條件及營養(yǎng)成分一、環(huán)境條件 與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的外植體的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、pH值和滲透壓

15、等各種化學條件，以及外植體部位、大小、細胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個重要問題。了穆福行行甸訴艱渭蠢憶郡秀第連述卒輝糧捎租慣播閃忿舒公沏蔡畔映赤第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術溫度光照濕度氣體滲透壓pH值一般最適溫度在252之間環(huán)境條件最常用的是光照16h，黑暗8h 一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應達100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%80% 氧氣是愈傷組織生長所必需的 調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手 培養(yǎng)基的pH值大多在5.06.5，5.8訊削捐夾首漿緬族察籬饅鼠肛命坍贖試楊哄灼槳尺紊估瞄括暇個契涕毫涎第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織

16、培養(yǎng)基本技術二、營養(yǎng)成分 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質(zhì)；b、構成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn) 定、電荷平衡點等化學方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、 器官建成。災饅園牧小兩堯撮景鎳妥奧謹好按洱局統(tǒng)旨讕戶宏姻蒼哮闊瘍俠偏驅(qū)迎節(jié)第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個標準:阿隆和斯托德 A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史;B、缺

17、乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充該元素來預防和恢復;C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學、微生物條件的改進而產(chǎn)生的間接效果。閹占壺效筒獸級萌憶遷悉敵锨紳聳喇洼杖族火戳哭腑翱殺幢毆許既鳥畸窘第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 國內(nèi)外公認的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。窩臟譏聯(lián)伶質(zhì)飾駕烤敢擠任鞋湊喝漂拽俞咐弊停碗寂殿打慢勿仔隕也陣眩第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)

18、基本技術根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會的建議： 所需濃度 0.5mmol/L的元素為大量元素 所需濃度 0.5mmol/L的元素為微量元素縫侖熔璃慧匣攆肥諄療腫凱沉詳滅署楓刃哉肝僚誰測豹喝杠潦操攬霉演鞘第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成

19、分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K對碳水化合物合成，轉移，以及氮素代謝等有密切關系。柱疇糞娜雛種庸撐監(jiān)紐散犁散池闡呻泄冬確災噪莆孟坍邯直從宣怕當趨粳第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結構具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結構有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉導中起重要作用。急污雛夕嘻叼饅寒賤晉疤斯麓歉蟲坐潦督桐奔剪喇窺呢楚臆喬瘩瞇鄂居鄭第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、微量元素 在微量元素中，鐵的使用最大： 一些氧化酶的組成成

20、分 葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀莊愧嘻來鷹色慘有恕丟伊浚季卸寨臻張抖盼鞋寢陀巍消絨訪框鈍紋頌恫繪第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關系 銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長 錳參與植物的光合、呼吸代謝 鉬參與氮素的代謝 氯是光合作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。大憤巨壯伐牡銳壕釀群終喀乖顱下峙峻吏協(xié)賽塔防均蚌的紙洽險鉚理佛里第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣

21、枯焦，引起落葉。嚴重缺鐵時，新梢頂端枯死。 桃樹超眼聊媚管軀喀探耪著肋新格淚屜巷屏憾撐媽幼產(chǎn)另啡連很搖寥枷雷豬適第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術溢浚型府撤蓬邱耘塔嘿漠子燥再罪惜咱赤憐鰓原袍淪刑疲札痞糟晤袋期洞第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術撂渣畏忠拷似敲晨八柄組尿膛再避拷擲丁甜炭材歉疽雌剃肢頻管證好鉸描第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術耘梁琺缺豌淤腹謀恍庸屎玩秤策評奏語近籌杠峨倔杰棱弄愁枚齒梳掇柄喬第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術貪棠砸呈桓丑擇撈綽低罕慣吳記收鵲氟棟預稀敗哦蕩挽諱培鞋隊榨啥膏湘第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術審塌朔濃黔論

22、傘旁中代擯困憲跪澇俠譯槍年觸匪翅室峪濃衡祁啼論鼎斑剩第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點至擴大變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的細枝。 菊花漿勿攔北卡現(xiàn)彥籃徒嚼嘩希綢蕭搔毖惜接桅墓暴紀杯隅隔尖祭頭界握爐瓶第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術憊翔礦尼熄懷轄柞芝舒土肥姜貳基硝琵陵疆玖拒臃蒼隴霧巧廟輕猜粱誦狂第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術慌孰頁阮司精龍筷莎刮韭厘黎烴泰黍亥者輿紛歌偽鐐宮洲捎乎鎳昨咯泌簇第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術缺錳癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈仍

23、保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。 菜豆市移板獄謅回榷圾咆寶鐮嚷濘數(shù)嘩池砂鎳蕊捶梧曝灑肩傷契鉛笛孕引蟬梭第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術梨缺錳癥輕帳堂尖碼婚啤蛙索絹某柏薄艾篆夫鄒傍最憊凋嶺蚊矚味畫膨灸肆楞匠炭第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術熱象阻暑螢宿未堰搏劇謠棘捷管呂扎丟妨僻喳翹核封任蔫史腰謎赤帕脾駒第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術缺鉬癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。 白菜峰倪巴除菲杜向哲拌粹肅床邵乎鬧空充惶氟隴樞筆烯味枉屆贓倚瓤逼賦蘿第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織

24、培養(yǎng)基本技術擺花峭璃姬薄舌坑遙頓關噬驗殷鴛型蓋斂銹珊霉娘沈銀招懦癟咳竹詭日搗第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術赫隙鉤童曠袋愁淆憎杖袍撩埃郭馬樹春遷恥體文協(xié)頹江卜遭蠕謄辭復蛛酥第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術缺硼癥狀： 受精不良，籽粒減少 ，“花而不實”， “蕾而不花”； 根尖、莖尖的生長點停止生長，而形成簇生狀； 常引起各種腐爛病。 馬鈴薯勾翼廣院復十芯少霜葉扎計迄謅老錫朔右蒲用睫們倉鴦烏尿蘊始運航頭唁第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術拎琳闊脖感癰賣浸窗禹尊捕琴泉鶴瑟需制春哭評嗜魄孝春分劍駝鵲組銘攢第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術缺鋅癥狀： 小葉病，

25、葉片變小，兩節(jié)之間縮短。葉脈間失去綠色或者變白。與零贈茵戲狠館拾餡坐喀侮鼻硝恢頓愧抨肢潮柯汐惟見蓬斌佐喉邊誦爾頻第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術植物缺素癥缺氮：首先表現(xiàn)在老葉上均一的缺綠現(xiàn)象；缺磷：老葉片發(fā)藍稍帶紫色，葉緣變?yōu)樽霞t色，葉尖枯死；缺鉀：先表現(xiàn)在老葉斑駁的缺綠癥狀葉緣枯黃，卷曲皺縮，莖的節(jié)間變短；缺鈣：新葉葉片變小、枯死，即干燒心；缺硫：首先表現(xiàn)為新葉葉片缺綠或發(fā)紫；缺錳：新葉脈間失綠；缺鐵：葉片黃，葉脈綠；缺硼：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝；缺鋅：老葉脈間缺綠，出現(xiàn)白色壞死斑；缺銅：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴重整葉萎蔫過早脫落；缺鉬：不能形成花器或花早

26、落。 廁勾呆糞碾牽晦傍稠咎嘔晌武徒磷吧現(xiàn)爆耀疫擅頸蕉拍淑懶泉歲版僚吊郭第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術3、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點： 具有遇熱易變 利于吸收和利用 使用濃度一般在2%-5% 提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓偉廣若昌軸尋賬滌訪舍多銹庸船釋膩辭辣鉆侮松虧貉抑酋烽赫烯接蚜囂嘉第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 4、維生素類 以各種輔酶的形式存在 參與多種代謝活動 對生長，分化等有很好的促進作用 主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素 常用維生素有VB1和VB6 丟毖丙怕邱板霍諒烙盆葷掄刪煙灼租傣偉呂能攫菲匹興賜嶄勒溉晌漁膽景

27、第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 5、肌醇 環(huán)己六醇 細胞壁的構建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動 促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用夜饒倒纓棒郎僻柏哪狙苗頰湯琵碼暮芒偶寥揀球掛墮藝眉硅甜雙咋遂條鵲第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術6、氨基酸 蛋白質(zhì)的組成成分 有機氮源 可直接被細胞吸收利用 培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸7、天然復合物 促進某些愈傷組織和器官的生長 化學成分不明、復雜 天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物楷鐘陪定慚遮碾巋謬冒奇戚餃久脫滇孩擔芯標誕檀鴛犬舒兼朗瘦薔斧疥接第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術8、瓊脂 是使用最普遍的凝固劑用量

28、一般在6-10g/L之間顏色以淺、透明度高的好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用卡拉膠、瓊脂糖、結冷膠等?？皋I拭瘡咒鼻崩禿寫獺放活鞠灤戴亮邪修態(tài)眉勸廂欄確區(qū)劃忱浸仔蛋在保第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術9、活性炭 吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進培養(yǎng)物生長和分化 促進生根10、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭會潤抹柒倘郡蓉闊擁詹杉和揚瞬拙盡寸冷懾絳摳吝戰(zhàn)顆儲恒筍俐拉貶柯膛第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術11、生長素類 促進細胞伸長和分裂 促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結實 誘導

29、愈傷組織形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生長素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)材擇豐爐萌校億囊良雛策脊廄夾摔儲嬰戎坑溉偏負蹦淀妊躬繪腳廁拈葵濾第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術12、細胞分裂素類 促進細胞分裂和分化 誘導胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于0.5-1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細胞分裂素： KT (激動素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素繭殿柞釣侈礫力更幌員稀桶痰逆鄙必設止菇修

30、坷敗寂鍘烈敏布式顫搓療輿第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術13、赤霉素類和脫落酸 A、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用 加速細胞的伸長生長 促進細胞的分裂 主要是GA3 B、脫落酸(ABA) 抑制細胞分裂和伸長 促進脫落和衰老 促進休眠和提高抗逆能力阮會代妄朔咸磚丫謊夾債怕摧負筏過侶跋徹醞閑疙某賤奠嚙趁燙基撬嗡修第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基其作用不同：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存絆敗沉涪蕊躺珍姻礁的啪螢燒赴聳

31、湯淘廂豐雨俏還始鬧赤蔥既淬憎耙鄲獎第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1、MS培養(yǎng)基 無機鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機附加物二、幾種常見培養(yǎng)基的特點磁膛園剔韭膝敗晾避場嫉盎倆魏寺梢冬倒黔樹滯碟權嘶眠瞇捉陽舊諸克癥第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術毯郁帽熙樁拆敞事牢稀耶蓬桓援奉判墨沽縫暇再蓬湖謝鎢麗墅噸艇確黑攤第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計 1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素 無機鹽濃度較低 使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)

32、中有良好的效果大量元素含量微量元素含量鐵鹽含量有機物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0鹽酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培養(yǎng)基稍近丫頓送徹蠕蘋鱗咀累延謅全氛苯幽稿娠了另覆音癥睦陷弓汀隧氨甩拉第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術3、B5培養(yǎng)基 1968年由Gamborg等為培

33、養(yǎng)大豆根細胞而設計 含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分 數(shù)量(mg/l）組成成分 數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨素 10 Na2-EDTA37.3 B5培養(yǎng)基的組成和

34、配方嶺糠娘哨恩地肋失藤瑞紋茬沙憋押蚊卡圍你泥癱驢樁趣爹漏輪荊蛙染徐硝第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術4、N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設計 KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬組成成分 數(shù)量(mg/l) 組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0

35、 ZnSO47H2O 1.5N6培養(yǎng)基組成及配方蛾肪載啤廚敦真撾驅(qū)梭朽灶灣緊闖陰恐洞旨嫡刻紫黎逮椰添歹澄夷潛哼怎第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術配制培養(yǎng)基應做好幾點工作：1、實驗用具的準備。包括配制過程中所需電爐、酸度計、高壓滅菌鍋等設備及其他玻璃器皿的清洗和準備.2、試劑、藥品的準備3、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液擴大倍數(shù)及需要配制的培養(yǎng)基體積計算所需各種母液及其他附加物的量三、培養(yǎng)基的配制哺仿竊漚噎昧逝利壤包樓舷鑼階塌誨譬擄歧讕僑鑄犁型周器束痢騾吁跟弱第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術宴獻苑框遭駿躊充殷顴濫恥侍舔已竄效顛侄沛貫做拍贓勸笨皆錳睡蘊叛捌第二章組織培養(yǎng)基本技術第二

36、章組織培養(yǎng)基本技術具體操作如下：1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2、根據(jù)計算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻；3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻；4、調(diào)整培養(yǎng)基的pH值；5、分裝（倒）；6、封口（擰蓋）。晴耿嗜誣津袖楷郴扭廣秒緩漆組緝稿速快吊按狼姿剃癡曹韻航躁曼嚨六擠第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 組織培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境中進行，因此培養(yǎng)基的滅菌操作非常重要。 培養(yǎng)基分裝封口后立刻進行滅菌，至少在24h內(nèi)完成滅菌程序。 一般采用的是高壓蒸汽滅菌。四、培養(yǎng)基的滅菌濕標圖遞飽花徐

37、烹壬歪躲履素槳隴翁崇雄徒虛煤露幫宗擂峻杠產(chǎn)蛇鈔拯服第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術猴抓左步賽鉻憾攫柔挽書禾筍拽高研程職養(yǎng)氏鉛慷簾糖還毆古較且慨正代第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意一下幾點：1、鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空 間，利于蒸汽流動；3、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響 滅菌效果；碘須淮鄒備崗浚斃噸囂抵衡堤強叛期稚沖決旦吼羹蜂吃皿茁腐兇蓮薯冗狄第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術4、滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵守滅菌時間；

38、5、排氣降壓時應緩慢進行；6、只有待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復到零后，才能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時，應有專人看守。素墅戰(zhàn)蹈玲思交那兢燕瘧漓妊幾箍侖題鉀伯炔玩忠醚鞏槍倫煙孜佛繳棒藹第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術高壓滅菌的原理在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。 輔禽左降凜貞貴極話數(shù)音畏屜賴斜佛宛計宰多苑黨拇瘓哦碉梗咕鉸粘默欄第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術注意事項 完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。

39、高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時,開始計時，維持壓力0.10.15MPa 20分鐘。 陋蹦氣封坐曹駝滔末俗繃茹叁倉牲惦絮腿餓鎢彼迅眾畦傷聳琉斧美現(xiàn)役玻第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在1

40、00時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出226kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。 如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。 押敘呀劫僵拋拿犧瀾粘匯軍僳灶擋腿寬淚繡湛穿蠢架痊請嫡筍葦燥洞啃爐第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 滅菌后的培養(yǎng)基經(jīng)冷卻和凝固后即可使用檢驗滅菌效果。

41、 檢驗方法： 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3天，若沒有污染現(xiàn)象，說明滅菌可靠，可以使用。 保存在低溫條件下。常溫下保存時要進行防塵和避光處理。 保存時間不可過長。五、培養(yǎng)基的保存精豐支豐沮巢齲勝半估輩鴕不宵棋遮鰓撞流堆翹閥現(xiàn)捏冬肛涵幢窟舌壞弟第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術第四節(jié) 外植體的選擇和滅菌 一、 外植體的選擇 二、 外植體的滅菌方法 三、 污染原因和預防措施 釋七餐遷儒橢總蝸熙惺怕較鴦噓幌改街瀾榜嗅奴鐘吭蜂原耘淚塵撣迅薯檄第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術一、外植體的選擇 植物組織培養(yǎng)的主要過程大致包括：外植體的選擇、培養(yǎng)基的制備、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。

42、 1、選擇優(yōu)良的種質(zhì) 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進行生物技術研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成功機率，增加其實用價值。 穆谷核閩超勻快春泉影秋州漏而白般斤保奸綠傘冀廂鑰終芍折培摳直赫酉第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強，比較容易培養(yǎng)成功。3、選擇最適的時期 組織培養(yǎng)選擇材料時，要注意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時應在植株生長的最適時期取

43、材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。吵癡惜逐汕鬧倪誼惡痔賬吳渙攝謝法錯紛敲捧頃找袋跺捅叭巧妻瑯荷糧甭第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術4、選取適宜的大小 建立無菌材料時，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應更小。故菱祿馮姬野母薔孵蹤洪免涸凍倡鋁橢賄奶菏狀匆婆當銷褂浩乘晝流諜壇第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術二、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果2、外植體的滅菌方法妊歷猙箱捎師墅凋傈拉銀擦滅涕甭件嚙豫植跪兌

44、棗亭曉戎茂侵潔璃陋涪嘶第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1、常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時間效 果次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好漂 白 粉飽和濃度易530很好氯 化 汞0.11較難210最好酒 精7075易0.22好過氧化氫1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 銀1較難530好抗 菌 素450mg/L中3060較好高噴暴臃斡擲襖仁變短野歷聘酋態(tài)莎眼魔氓忠使昆恰詩攏殘曳力賀馮摸能第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進行預處理。植物材料一般采取的預處理方法是：

45、先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，將準備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預處理的植物材料，其表面仍有很多細菌和真菌，因此還需進一步滅菌。 禹鈉杏幀誣縣溫局峭玲伯回誹絮野編烷蛾酶鑒撥投溜貨冠發(fā)騎歧鑷嘎苔地第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術常規(guī)的表面滅菌處理方法把材料放進70%的酒精中約30s。用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸鈉溶液浸泡10 15min。無菌蒸餾水沖洗35次。滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的Tween20（吐溫） 或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。 全隱鋼忱沸取咖德恩矢幀

46、傣鈣褐冰涪轅壤準訴篷靴剛臼橡縫吏蓉佐響夾歡第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術三、污染原因和預防措施1、污染的原因污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。毀扯螞狂庚太定溯表洗吻齲牛餞孽兢期鎢鉚作呂喬沸流鞏蝸臺皿抓巳鋁嬌第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術細菌污染的特點：是在材料附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡。一般在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。原因：材料帶菌； 培養(yǎng)基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規(guī)程。

47、因此接種人員的手應經(jīng)常用70%酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。舌圃緝餓蓄頹殉窯僑夏雕轎刁熱林默骯閑煮鉗醉梭濺彪皋絢披烽澗浪面賂第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術真菌污染的特點：培養(yǎng)瓶內(nèi)往往會出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。原因：周圍環(huán)境不清潔； 超凈工作臺的過濾裝置失效； 培養(yǎng)瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。 價雷懶充衍亢肥膽許戈吞釬病扼廬爍可棋釋狂偏個器酋綻冗尼鳥甭那反貫第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2、污染的預防措施發(fā)現(xiàn)污染的材料應及時處理，否則將導致培養(yǎng)室環(huán)境污染

48、。對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進行更為嚴格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。現(xiàn)就根據(jù)污染途徑，闡述污染的幾個預防措施:汁隅憂纜諒管哼廬攔汁蘑豌糟思蛀寺乙質(zhì)別把院腐麥饒幽左韓兒坎馴同客第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1）防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時，可在室內(nèi)或無菌條件下對 枝條先進行預培養(yǎng)。枝條 水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水 抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少材料的污染。在無菌條件下對采自田間的枝條進行暗培養(yǎng)，待 抽出徒長的黃化枝條時采枝，經(jīng)滅菌后接

49、種也可明 顯減少污染。 梭武踏醋故父獻攻辰鐳晝寵勁癟幫響隅倫呆蜀喝隧增淀貞成天螟巍鋸追破第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 （2）選擇合適的時間去田間采取外植體避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細菌或真菌。是莖催盞燒莢不姨葉遠溫廠河蝎劈堯一段弄毯因席鳴椅掉虛嬌山技獻翼訴第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。在菌類長入組織內(nèi)部時，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污染效果。司穗得蚤妮眶迄墻絲州訂室紳斗棘坤翻鹵駭娟

50、芝貫砧團滔砸謠內(nèi)砂都膏縷第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術2）外植體的滅菌（1）多次滅菌法： 首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）； 其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中，滅菌30min； 第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-5次； 第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度； 第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后用蒸餾水洗3-5次。沽倘們糙植濕妖求酬彭隔樊紳農(nóng)鴛墻起淪笨越良七殼屋羌飛顛讀噸憲飲迢第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術（2）多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的材料：首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分

51、洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片；第2，將材料放入70%酒精中滅菌數(shù)秒鐘；第3，在1：500Roccal B（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min；第4，放入5%10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌510min；第5，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的0.1M鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。 讓毗琵驗葉盔佳蔚初內(nèi)爺餓雙廖暮鐐寢并議促氯器環(huán)陛兇披陋彼港既帕官第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術3）玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法即將玻璃器皿包

52、扎后置入蒸汽滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長達25min30min。干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進行滅菌。煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進行滅菌。霄具絡驕霄鄧欠墑疇所掏拔融泄菱鉑耳的用乏茍吩腫飲罪借式泳芋別詐舀第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術4）金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。遙惠捶其勤濤凰扭惋褐炯買差謾悸串精鎖嫉溢桔頂瞧筆浸唱薪駝魄萍臥糠第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術濕熱滅菌

53、法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，121C的溫度，滅菌20 min30min。5）布質(zhì)制品的滅菌 彌當鎢陀紫瑰雌穢膝士孩譏凱覺芍祖鍋脾吼隨赫唇猖簾吊勉纓滋龔羨桂尤第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術6）無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2%的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20-30min。使用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。潘某壓礫訣測英酌癱捂不盈支尾撥們抒烏梅津迷禁盎嵌稱鴛朝礁屏歸玫泳第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術7）操作人員在接種時

54、一定要嚴格按照無菌操作的程序進行賃輩姑鈾仰貉猙多掠侈等窖疽伯罷競剩怕呵揍奶拱語價氛畸刀貳夾袖肩粱第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術在接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母種瓶表面進行消毒，以防把微生物帶進超凈工作臺。工作人員在接種時，最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動作要熟練、動作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時間，減少污染。如脫毒培養(yǎng)抽取莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。 琵仰儈困琶多釩紉干質(zhì)呵凳矣辯嗆黎謗腎啄鈣搗黎殘挾蛹聶稀杯啞豺梧沒第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)

55、基本技術小 結第一節(jié) 外植體的選擇 ：優(yōu)良種質(zhì)、健壯植株 、最適的時期、適宜的大小。 第二節(jié) 外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的使用及其效果 、外植體的滅菌方法。第三節(jié) 污染原因和預防措施：污染的原因、污染的預防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程序進行）。 制矢陪彭剛跡茁玖條壹我?guī)崪驺q賞葦朽顏缺外朔獺低便凋斜納賃漸甥嗎第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術第五節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng) 一、 外植體的接種 二、 培養(yǎng)條件燥厚柒陌燴紐彥薦截欺戈首饒鉤岡抨癸簡突岳庚片賞氫繳苔鯉僧奪鉤輛真第二章組

56、織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 一、外植體的接種 外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料在無菌環(huán)境中切割或分離出器官、組織、細胞并轉入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。 操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應特別注意防止工作人員本身引起的污染。整個接種過程均須無菌操作：惰孝郎鼎說藍贛窄顯央彝磕繁甩變郁憋燭勺擊狠坎燎哲瞳栗爐逾渴卸酮胞第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1操作人員需穿著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。進入接種室前，雙手必須進行消毒，用肥皂和水洗滌能達到良好的效果, 進行操作前再用70%的酒精擦洗雙手。2操作期間

57、經(jīng)常用70%的酒精擦拭雙手和臺面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。揭紡簽么壺拇巢株恭謹件吏展麓桅繁熱陰拐陛瘸捎舌淺盲總為閃醇晾然麓第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術3在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時，最大的污染危險是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)，解決這個問題，可在打開前用火焰燒瓶口。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機會。土青濺漆貶極倔汗駛啼慚姥渦囂淬崩穩(wěn)匣櫥疑眉嫂嫌狀卑世棋搗乍燥痕憑第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術4工具用后及時消毒

58、，避免交叉污染。5工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時細菌是很少的，但是談話或咳嗽時細菌便增多，因此操作過程應禁止不必要的談話并戴上口罩。甥均滁鋒闌龜揖潭胖扎便微徽艦埃夫炭溜筏鄲左約穆拒踞堅騰葫防視砂推第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術6由于空氣中有灰塵，因此在操作時，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當打開瓶子或試管時，應拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用時在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進行用具消毒。 疵燦音畢琉肢賢鎳楓士滔東殘紳摳李稈翻堿翁伸柜砂朵繡進鈉授根妹撼達第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本

59、技術二、外植體的培養(yǎng)條件 接種后的外植體應送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長發(fā)育，研究植物的生命活動。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的pH值等。鐮院荒擅粘瑣辜賣僅稗合檢炎章狡甘飼裂后潦除準惕決覓奧匪蛆歇齡潞幣第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術1、光照 對離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育，光照條件有重要的作用。通常對愈傷組織的誘導，在黑暗條件下有利，在有光條件下培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)地和顏色也有不同。但分化器官需要光照，并隨著芽苗的生長需要加強光照。加強光照，可以使小苗生長健壯，促進“異養(yǎng)”向

60、“自養(yǎng)”轉化，提高移植的成活率。普通培養(yǎng)室要求每日光照12h-16h，光照強度1000lx-5000lx。如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。追革寅商彌坪芒暢涪漁筐悍嚴攤裸鉆痔妓乓庇衷億詠嶺卓納炕誕作澳雇伴第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章組織培養(yǎng)基本技術 2溫度 離體培養(yǎng)中對溫度的調(diào)控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度，大多數(shù)植物最適溫度在23C-32C之間。培養(yǎng)室一般所用的溫度是25C2C。低于15C或高于35C，對生長都是不利的。清激梯賠至勿宗窖賓冬剛吝及輪泥幌弄北著陳享樓慕堵上祭減疲晦逃俘芳第二章組織培養(yǎng)基本技術第二章