《基因組學(xué)》課件課程總結(jié)

1、第1章 基因組學(xué)概論1. 基因(Gene)基因(gene)是1909年丹麥植物學(xué)家W.Johannsen 根據(jù)希臘文單詞genos(birth,給予生命）創(chuàng)造的。現(xiàn)代分子生物學(xué)的基因概念： 基因是儲(chǔ)存和表達(dá)某一多肽鏈信息或RNA分析信息所必需的全部核苷酸序列，即一個(gè)基因不僅包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列，還應(yīng)包括為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列。 2. 基因組（genome）基因組(genome)一詞系由德國(guó)漢堡大學(xué)H. Winkles教授于1920年首創(chuàng)，從GENe和chromosOME組成。用于表示生物的全部基因和染色體組成的概念?；蚪M（genome）：生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)的總

2、和,是指生物細(xì)胞中所有的DNA，包括所有的基因和基因間區(qū)域。人的核基因組：30億bp（最新資料說(shuō)28.5億） 22.5萬(wàn)個(gè)蛋白編碼基因3. 基因組學(xué)（genomics） 由美國(guó)科學(xué)家Thomas Roderick于1986年首創(chuàng)?；蚪M學(xué)（genomics）：研究基因組結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)，其內(nèi)容包括基因的結(jié)構(gòu)、組成、存在方式、表達(dá)調(diào)控模式、基因的功能和相互作用等。（二）基因組學(xué)分支1、根據(jù)研究對(duì)象：動(dòng)物基因組學(xué)、植物基因組學(xué)、腫瘤基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué)等。2、根據(jù)研究重點(diǎn)：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)-序列功能基因組學(xué)-分析比較基因組學(xué)-比較1. 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)概念：通過基因組作圖、核苷酸序列分析，

3、研究基因組結(jié)構(gòu)，確定基因組成、基因定位的科學(xué)。目的：建立高分辨的遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜和序列圖譜。研究?jī)?nèi)容：基因組測(cè)序、基因組作圖 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究常用方法1. 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 2. 毛細(xì)管電泳3. 基因芯片技術(shù)4. 全基因組隨機(jī)測(cè)序2. 功能基因組學(xué)概念：利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息，以高通量，大規(guī)模實(shí)驗(yàn)方法及統(tǒng)計(jì)與計(jì)算機(jī)分析為特征，全面系統(tǒng)地分析全部基因功能學(xué)科。研究包括：生物學(xué)功能、細(xì)胞學(xué)功能、發(fā)育學(xué)功能等。功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容:(1)進(jìn)一步識(shí)別基因以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息。(2)弄清所有基因產(chǎn)物的功能，這是目前基因組功能分析的主要層次。(3)研究基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，分析基

4、因產(chǎn)物之間的相互作用關(guān)系，繪制基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。功能基因組學(xué)常用技術(shù) RNA干擾技術(shù)（RNAi） 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 生物信息學(xué)研究等。3. 比較基因組學(xué)概念：基于基因組圖譜和測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)上，對(duì)已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較以了解基因的功能、表達(dá)機(jī)制和物種親緣關(guān)系的學(xué)科。分類：種間比較基因組學(xué)研究 種內(nèi)比較基因組學(xué)研究 研究?jī)?nèi)容：比較基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容:繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示進(jìn)化過程中最主要的變化所發(fā)生的時(shí)間及特點(diǎn)。據(jù)此可以追蹤物種的起源和分支路徑。(2)了解同源基因的功能。(3)對(duì)序列差異性的研究有助于認(rèn)識(shí)產(chǎn)生大自然生物多樣性的基礎(chǔ)。思考題1.基因組與基因組學(xué)的概念.2.基因組學(xué)包括哪些研究?jī)?nèi)容?3

5、.基因組學(xué)的歷史變革與發(fā)展趨勢(shì)?4.凡是疾病都與基因有關(guān) ?5.基因組學(xué)的發(fā)展與人類的生存、生活及健康的關(guān)系？ 基因組多態(tài)性 genome polymorphism第 2 章鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊 遺傳標(biāo)記是一類能夠穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)，同時(shí)通過一定的方法可以檢測(cè)其客觀存在，用以區(qū)分不同的個(gè)體和群體，或者能夠區(qū)分不同的染色體位點(diǎn)。遺傳標(biāo)記（genetic marker）基因組多態(tài)性(genome polymorphism):在不同群體或個(gè)體之間，基因組的某些位點(diǎn)上堿基的差異性。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）小衛(wèi)星DNA (minisatellite DNA)微衛(wèi)星DNA （microsatel

6、lite DNA）單核苷酸多態(tài)性（SNPs)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST）和序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）表觀遺傳修飾（epigenetic modification)基因組多態(tài)性的種類 一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）當(dāng)使用某種限制性內(nèi)切酶酶切不同個(gè)體的基因組DNA分子后，個(gè)體之間酶切片段長(zhǎng)度的差異性即限制性片段多態(tài)性（RFLP）?；赟outhern雜交的分子標(biāo)記方法。表現(xiàn)型的差異：顯而易見微觀差異：蛋白質(zhì)，DNA穩(wěn)定的差異：DNA RFLP的遺傳基礎(chǔ)：限制性內(nèi)切酶具有特異的識(shí)別序列和切點(diǎn)一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RF

7、LP)如：EcoRI 的識(shí)別序列和切點(diǎn)為：5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 BamHI的識(shí)別序列和切點(diǎn)為：5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5不同個(gè)體DNA分子存在個(gè)別堿基的差異，如果這種差異正好位于某種限制性內(nèi)切酶的特異性識(shí)別序列上，將會(huì)失去或增加一個(gè)酶切位點(diǎn)，從而改變酶切后形成的特定。人類基因組高變區(qū)（hyper variable region, HVR) 。高變區(qū)均由十多個(gè)到幾十個(gè)bp的短序列（重復(fù)序列）串聯(lián)重復(fù)而成，稱為小衛(wèi)星DNA，由不等交換、基因轉(zhuǎn)換或滑動(dòng)復(fù)制產(chǎn)生。小衛(wèi)星DNA本質(zhì)：串聯(lián)重復(fù)的短序列二、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)1.小衛(wèi)星DNA（minisate

8、llite DNA）二、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)小衛(wèi)星DNA的特點(diǎn) 1）同一HVR的重復(fù)單位具有高度保守性。 2）在不同的個(gè)體或同一個(gè)體的同源染色體之間，重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同，構(gòu)成眾多等位基因。 3）經(jīng)酶切、電泳、印跡、重復(fù)序列雜交、顯影后表現(xiàn)為豐富多彩的RFLP。 4）同一個(gè)體不同組織來(lái)源的RFLP譜帶完全一樣；而不同個(gè)體的譜帶的位置千差萬(wàn)別，可稱為DNA指紋。 5）每一條譜帶的遺傳均遵循孟德爾遺傳規(guī)律。大部分譜帶以雜合狀態(tài)存在。 HVR譜帶在人與人之間的差異尤如商品條形碼，千差萬(wàn)別，就象人的指紋一樣，故將其稱為DNA指紋。 例如，用珠蛋白3HVR核心序列探針?biāo)@示的DNA指紋，個(gè)體

9、相關(guān)機(jī)率為410-12，意味著現(xiàn)今世界上除同卵雙生外沒有DNA指紋相同的人。二、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)二、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)多位點(diǎn)性DNA指紋的特點(diǎn)穩(wěn)定性高度變異性親代遺傳穩(wěn)定性：DNA指紋區(qū)帶遵循簡(jiǎn)單的孟德爾遺傳方式。體細(xì)胞穩(wěn)定性：同一個(gè)體不同組織的DNA指紋圖譜是一致的。DNA指紋區(qū)中的絕大多數(shù)區(qū)帶是獨(dú)立遺傳的，因此一個(gè)DNA指紋探針能同時(shí)檢測(cè)基因組中數(shù)十個(gè)位點(diǎn)的變異性。不同的個(gè)體或群體有不同的DNA指紋圖。英國(guó)遺傳學(xué)家杰弗里斯對(duì)白種人研究表明，兩個(gè)隨機(jī)個(gè)體具有完全相同的DNA指紋圖的概率為3000億分之一，兩個(gè)同胞個(gè)體具有相同圖譜的概率也僅僅為200萬(wàn)分之一。1.法醫(yī)

10、學(xué)方面?zhèn)€體識(shí)別現(xiàn)場(chǎng)檢材和嫌疑對(duì)象的DNA指紋條帶位置與強(qiáng)度一致，則為同一個(gè)體。DNA指紋的應(yīng)用：哪些是他們的孩子？2.親子鑒定如能從父母指紋中找到孩子的所有條帶，親子關(guān)系成立。二、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)微衛(wèi)星DNA與小衛(wèi)星DNA的區(qū)別指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中一種在群體中的頻率不小于1%的現(xiàn)象。三、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNPs)盡管遺傳密碼由四種堿基組成，理論上是四個(gè)等位基因，但SNPs通常是二等位基因的,或二態(tài)的遺傳變異。性狀影響：同義SNP 非同義SNP三、單核苷酸多態(tài)性SNP的特點(diǎn)二等位基因性分布

11、密度高位于基因編碼區(qū)的SNP能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可能代表疾病遺傳機(jī)理遺傳穩(wěn)定性高于微衛(wèi)星DNA可構(gòu)成SNP單倍型易于檢測(cè)自動(dòng)化，通過簡(jiǎn)單的“+/-”進(jìn)行基因分型。四、表達(dá)序列標(biāo)簽和序列標(biāo)簽位點(diǎn)表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tags, EST），是指從不同組織來(lái)源的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行測(cè)序后得到的部分cDNA序列。序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence tagged sites, STS），是EST序列的位點(diǎn)。五、表觀遺傳學(xué)（epigenetics）研究在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。機(jī)制：基因組含有兩類遺傳信息，一類

12、是指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的遺傳信息，另一類是表觀遺傳學(xué)信息，即何時(shí)、何地表達(dá)遺傳信息。內(nèi)容： X染色體劑量補(bǔ)償、DNA甲基化、基因組印記、表觀基因組學(xué)和人類表觀基因組計(jì)劃。X染色體的失活狀態(tài)需要表觀遺傳修飾，如DNA甲基化來(lái)維持。這種失活可以通過有絲分裂或減數(shù)分裂遺傳給后代。X染色體劑量補(bǔ)償五、表觀遺傳學(xué)（epigenetics） 在雌性哺乳動(dòng)物中,兩條X染色體有一個(gè)是失活的,稱為X染色體的劑量補(bǔ)償(dosage compensation) 。N-1法則甲基化是基因組DNA一種主要的表觀遺傳修飾形式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。DNA甲基化五、表觀遺傳學(xué)（epigenetics）來(lái)自雙親的某些等位基因

13、,在子代的表達(dá)不同,有些只有父源的基因有轉(zhuǎn)錄活性,而母源的同一基因則始終處于沉默狀態(tài),另一些基因的情況則相反。這一現(xiàn)象稱為基因組印記。這是由于源自某一親本的等位基因或它所在染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾，即本質(zhì)是DNA或蛋白質(zhì)的修飾，導(dǎo)致不同親本來(lái)源的兩個(gè)等位基因在子代細(xì)胞中表達(dá)不同。 基因組印記（genomic imprinting）五、表觀遺傳學(xué)（epigenetics）按大小分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。長(zhǎng)鏈非編碼RNA常在基因組中建立單等位基因表達(dá)模式，對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變發(fā)揮重要作用。短鏈RNA在基因組水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，介導(dǎo)mRNA的降解，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，決定細(xì)胞分化命運(yùn)

14、。短鏈RNA：小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)非編碼RNA五、表觀遺傳學(xué)（epigenetics）研究基因組水平上表觀遺傳修飾的科學(xué)稱為表觀基因組學(xué)。表觀基因組學(xué)(epigenomics) 五、表觀遺傳學(xué)（epigenetics）人類表觀基因組計(jì)劃(Human Epigenome Project,HEP)2003 年10月正式宣布開始實(shí)施人類表觀基因組計(jì)劃。繪制不同組織類型和疾病狀態(tài)下的人類基因組甲基化可變位點(diǎn)(MVP) 圖譜。1、什么是基因組多態(tài)性？2、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的遺傳學(xué)本質(zhì)是什么？3、小衛(wèi)星DNA與微衛(wèi)星DNA有什么共性和區(qū)別？4、單核苷酸多態(tài)性為什么具

15、有很好的應(yīng)用價(jià)值。5、表觀遺傳修飾的種類和遺傳機(jī)理。思考題 基因組作圖 genomic mapping第 3 章鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊 應(yīng)用界標(biāo)或遺傳標(biāo)記對(duì)基因組進(jìn)行精細(xì)的劃分，進(jìn)而標(biāo)示出DNA的堿基序列或基因排列的工作。 主要有遺傳圖、物理圖、序列圖、基因圖?；蚪M作圖基因組作圖的基本構(gòu)想 在長(zhǎng)鏈DNA分子的不同位置尋找特征性的遺傳標(biāo)記，并將其定位在染色體的特定位置上，繪制基因組圖。 采用遺傳重組所得到的基因在具體染色體上的線性排列圖稱為遺傳連鎖圖，簡(jiǎn)稱遺傳圖。一、 遺傳圖譜（genetic map）遺傳圖譜的概念 通過計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)記之間的重組頻率，確定它們的相對(duì)距離，一般用厘摩(c

16、M，即減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來(lái)表示。cM值越大，兩者之間距離越遠(yuǎn)。一、 遺傳圖譜（genetic map）1、遺傳作圖的基礎(chǔ)連鎖分析 摩爾根總結(jié)了連鎖和交換定律。然而一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)是在實(shí)驗(yàn)工作的一名大學(xué)生(Sturtevant,1913)發(fā)現(xiàn)的：基因間交換（去連鎖）的概率與它們?cè)谌旧w上的距離成正比例。兩個(gè)基因距離越遠(yuǎn)，發(fā)生交換的機(jī)會(huì)越多。因而重組頻率是衡量?jī)蓚€(gè)基因間距離的單位。少數(shù)例外：重組熱點(diǎn)區(qū)域二、 物理圖譜（physical map） 用分子生物學(xué)方法直接檢測(cè)DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。物理圖更精細(xì)的圖譜。物理圖的構(gòu)建是基因組測(cè)序的基礎(chǔ)，有承上啟下的作用。

17、物理圖與遺傳圖比較：基因間關(guān)系更準(zhǔn)確（啤酒酵母3號(hào)染色體）。限制性酶切作圖：切成片段，根據(jù)重疊序列確定酶切片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離。熒光原位雜交（FISH）作圖：將分子標(biāo)記與完整染色體雜交來(lái)確定標(biāo)記的位置。序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）作圖：通過對(duì)基因組片段進(jìn)行PCR和雜交分析，來(lái)對(duì)短序列進(jìn)行定位作圖。二、 物理圖譜（physical map）（一）物理圖作圖方法兩個(gè)STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)取決于他們?cè)诨蚪M中的距離，彼此靠的越近，分離的幾率越小，彼此相隔越遠(yuǎn)，分離的幾率越大。兩個(gè)STS之間相對(duì)距離的估算與連鎖分析的原理一樣，它們之間的圖距根據(jù)它們的分離頻率來(lái)計(jì)算。二、 物理圖譜（p

18、hysical map）3.1 STS作圖的原理 二、 物理圖譜（physical map）3.1 STS作圖的原理 酶切和部分酶切的制作重疊DNA片段。分析兩個(gè)STS位點(diǎn)共存于一個(gè)片段的概率（位置越近，共存機(jī)會(huì)越大），計(jì)算STS位點(diǎn)的距離（分離率），繪制圖譜。二、 物理圖譜（physical map）3.2 STS作圖的方法 連鎖分析的圖距是根據(jù)交換率計(jì)算的；STS作圖的圖距是根據(jù)分離頻率來(lái)計(jì)算的。三、 基因組序列圖（sequence map）全基因組隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略（Celera公司）。以物理圖為基礎(chǔ)的，以大片段克隆為單位的定向測(cè)序戰(zhàn)略（公共領(lǐng)域測(cè)序）。兩種不同的基因組測(cè)序戰(zhàn)略:兩者的最大區(qū)別

19、在于是否依賴于基因組作圖。 先隨機(jī)將整個(gè)基因組打碎成小片段進(jìn)行測(cè)序，最終利用超級(jí)計(jì)算機(jī)根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系進(jìn)行排序和組裝，并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置。三、 基因組序列圖（sequence map）1、隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略全基因組鳥槍法從下至上的策略隨機(jī)法測(cè)序優(yōu)點(diǎn)：三、 基因組序列圖（sequence map）對(duì)高性能計(jì)算的方法和設(shè)備要求非常高。最終排序結(jié)果的拼接組裝比較困難，尤其在部分重復(fù)序列較高的地方難度較大。經(jīng)濟(jì)、快速、高效，成本較低。不需預(yù)先了解基因組的任何情況，即使缺少遺傳圖或物理圖也可完成整個(gè)基因組順序組裝。缺點(diǎn)：1、隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略全基因組鳥槍法對(duì)于大基因組而言，可以先將基因組DNA分解

20、為若干個(gè)較大的DNA片段，構(gòu)建基因組文庫(kù)。每個(gè)大片段克隆可以獨(dú)立進(jìn)行鳥槍法測(cè)序，亦可以組建重疊群后進(jìn)行鳥槍法測(cè)序。因此稱為克隆重疊群測(cè)序法。三、 基因組序列圖（sequence map）2、定向測(cè)序戰(zhàn)略逐個(gè)克隆法/克隆重疊群法對(duì)連續(xù)克隆系中排定的YAC克隆逐個(gè)進(jìn)行亞克隆測(cè)序并進(jìn)行組裝。遺傳圖-物理圖-亞克隆測(cè)序-計(jì)算機(jī)拼裝。理想狀況下，整條染色體就是由一個(gè)完整的重疊群構(gòu)成。三、 基因組序列圖（sequence map）又稱轉(zhuǎn)錄圖譜，在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上，繪制的有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜?；驁D譜制作方法: 通過基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。 用c

21、DNA或EST作為“探針”進(jìn)行分子雜交，鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因。四、 基因圖譜（gene map）1、什么是基因組作圖？2、基因組遺傳圖繪制的遺傳基礎(chǔ)是什么？3、基因組物理圖繪制的遺傳基礎(chǔ)是什么？有哪些作圖方法？4、人類基因組測(cè)序的兩個(gè)策略？5、人類基因圖譜有哪些主要特征？6、基因組單體型圖繪制的原理是什么？思考題52第4章基因組的序列注釋鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊53利用計(jì)算機(jī)分析基因功能實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能其他的基因功能研究方法二、基因功能的測(cè)定541、利用計(jì)算機(jī)分析基因功能二、基因功能的測(cè)定種間同源基因（直系基因）：不同物種之間的同源基因，來(lái)自物種分隔之前的同一祖先。種內(nèi)同源基因（平行基

22、因）：同一種生物內(nèi)部的同源基因，常是多基因家族的不同成員。平行同源基因直系同源基因551、利用計(jì)算機(jī)分析基因功能二、基因功能的測(cè)定同源基因一般不會(huì)有完全一致的核苷酸序列。當(dāng)一個(gè)新基因的序列被確認(rèn)后，根據(jù)同源性可以從數(shù)據(jù)庫(kù)中查找已知序列的同源基因。根據(jù)進(jìn)化的相關(guān)，可以根據(jù)已知的同源基因推測(cè)新基因的功能。同源性分析可以給出整個(gè)基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)信息。565758 酵母基因組大約含有6000個(gè)基因， 30是通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的， 另外70是用同源性分析獲得。1、利用計(jì)算機(jī)分析基因功能二、基因功能的測(cè)定同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用59基因失活在基因功能分析的作用基因的過表達(dá)用于功能

23、檢測(cè)2、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能二、基因功能的測(cè)定基因剔除RNAi轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)60傳統(tǒng)的遺傳分析是從表型出發(fā)最終到達(dá)基因（正向遺傳學(xué)），而在基因組計(jì)劃中研究基因功能則是從基因出發(fā)，最終到達(dá)表型（反向遺傳學(xué)）?；蚴Щ钍腔蚬δ芊治龅闹饕侄巍?、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能 基因失活在基因功能分析的作用二、基因功能的測(cè)定611)基因敲除（knock-out）最簡(jiǎn)單的基因失活方法，用一段無(wú)關(guān)的DNA片段來(lái)取代目標(biāo)基因。主要原理：用一段無(wú)關(guān)的核苷酸序列取代目標(biāo)基因的中間序列，并將其導(dǎo)入生物體內(nèi)或目的細(xì)胞內(nèi)，如果該基因所控制的表型變化了，就從反面驗(yàn)證了目標(biāo)基因的功能。2、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因失活二、基因功能

24、的測(cè)定62利用同源重組法使基因失活2、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能二、基因功能的測(cè)定1)基因剔除（knock-out）632、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因失活二、基因功能的測(cè)定2）RNAi技術(shù) RNA干擾是通過雙鏈RNA的介導(dǎo)，特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。64RNAi 作用機(jī)理：dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer把dsRNA切割成21-25bp的RNA鏈;這些小干擾RNA(siRNA)的一條鏈與靶mRNA堿基配對(duì)，隨后被RDE-1核酸酶降解，從而導(dǎo)致目標(biāo)基因沉默。2、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因失活二、基因功能的測(cè)定652、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因失活二、基因功

25、能的測(cè)定3）轉(zhuǎn)座子插入突變 轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入功能基因內(nèi)，使其失活，也可以用于基因功能研究。 缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)座或多或少是一種隨機(jī)事件，轉(zhuǎn)座后不可能預(yù)測(cè)其具體位置。 66 在正常情況下，基因產(chǎn)物的數(shù)量是有限制的，必須與其它基因的產(chǎn)物平衡，某一基因產(chǎn)物的過量和不足都會(huì)破壞這種平衡，造成生長(zhǎng)和發(fā)育的異常。 有兩種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)： -增加基因的拷貝數(shù)； -采用強(qiáng)啟動(dòng)子2、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因的過表達(dá)二、基因功能的測(cè)定672、實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因的過表達(dá)二、基因功能的測(cè)定基因過表達(dá) 通過增加基因的拷貝數(shù)和采用強(qiáng)啟動(dòng)子促使基因超表達(dá)，致使受體表現(xiàn)出生長(zhǎng)與發(fā)育的異常,來(lái)研究基因的功能.6869 許多蛋白

26、質(zhì)必須與其他蛋白質(zhì)互作，才能表現(xiàn)其功能，當(dāng)鑒定了這類蛋白質(zhì)的某些成員，則可采用某些方法分離與之互作的其他蛋白質(zhì)。噬菌體展示 （phage display）酵母雙雜交（yeast two-hybridization）3、其他的基因功能研究方法二、基因功能的測(cè)定70噬菌體展示 將外源DNA片段與噬菌體外殼蛋白基因融合后，以融合蛋白的形式定位在噬菌體表面。 被展示在噬菌體的表面的多肽或蛋白可保持相對(duì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。3、其他的基因功能研究方法 之 噬菌體展示二、基因功能的測(cè)定71酵母菌雙雜交原理： 真核生物中，轉(zhuǎn)錄因子與基因上游的特定DNA序列結(jié)合，然后激活RNA聚合酶，起始RNA的轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄

27、因子有2個(gè)重要的功能區(qū)域，一個(gè)與啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列結(jié)合，另一個(gè)與RNA聚合酶的激活有關(guān)。有些轉(zhuǎn)錄因子中的這2個(gè)片段即使分割開來(lái)，仍然可以在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)相互作用，裝配成一個(gè)完整的、有功能的轉(zhuǎn)錄因子。3、其他的基因功能研究方法 之 酵母菌雙雜交二、基因功能的測(cè)定7273酵母菌雙雜交系統(tǒng)中，將編碼這2個(gè)功能域的DNA分別構(gòu)建在2個(gè)獨(dú)立的表達(dá)載體上。在一個(gè)表達(dá)載體中，DNA結(jié)合功能域的基因片段與待測(cè)蛋白質(zhì)的基因連接成融合基因。在另一個(gè)載體中，RNA聚合酶激活功能域的基因片段與未知蛋白質(zhì)的DNA序列連接成融合蛋白基因。將這2個(gè)表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化一個(gè)細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，如果DNA結(jié)合功能域蛋白與同RN

28、A聚合酶激活功能域蛋白之間能夠互作，就會(huì)啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。74思考題哪些DNA序列組成特點(diǎn)可作為判別基因的依據(jù)？舉例說(shuō)明基因功能分析有哪些手段？75第5章基因組的進(jìn)化與分子系統(tǒng)學(xué)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊76一、基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)基因突變：基因組中小區(qū)域內(nèi)核苷酸序列的改變。染色體重排：又稱染色體重組，基因組中染色體發(fā)生斷裂與別的染色體相連構(gòu)成新的染色體，也就是發(fā)生重新組合的區(qū)段?；蚪M是隨時(shí)間不斷變化的動(dòng)態(tài)物質(zhì)。突變和重組是導(dǎo)致基因組不斷變化的分子基礎(chǔ)和主要因素。77一、基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)1. 突變：基因組中小區(qū)域內(nèi)核苷酸序列的改變。突變的類型：點(diǎn)突變轉(zhuǎn)換：指一種嘌呤變成另一種嘌呤，或一

29、種嘧啶變成另一種嘧啶。 嘌呤 嘌呤(A-G) 嘧啶 嘧啶(C-T)顛換：指嘌呤變?yōu)猷奏?，或嘧啶變?yōu)猷堰省?嘌呤 嘧啶78突變的機(jī)制一、基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)1. 突變復(fù)制錯(cuò)誤 錯(cuò)配突變、誤導(dǎo)摻入、滑序復(fù)制物化因素引起的損傷 電離輻射、紫外線、熱誘變等 烷化劑、堿基類似物、嵌入試劑等79一、基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)2.重組 染色體區(qū)段或DNA分子之間的交換與重組，涉及染色體區(qū)段或DNA序列之間新的連鎖關(guān)系。（1）同源重組：發(fā)生在同源染色體之間。（2）非同源重組：發(fā)生在非同源染色體之間，如染色體移位。80一、基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)2.重組重組擴(kuò)大了基因組變異的范圍，增加了進(jìn)化的潛力。重組可使基因不斷洗牌（

30、shuffling），淘汰不利的突變。81一、基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)3.轉(zhuǎn)座：是基因組進(jìn)化的一種重要方式，幾乎出現(xiàn)于所有生物中。轉(zhuǎn)座不屬于重組，但是利用了重組。結(jié)果：DNA片段從基因組中的一個(gè)位置移到另一個(gè)位置。特征：轉(zhuǎn)移片段兩端具有一段短正向重復(fù)序列。82二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生主要途徑基因倍增之后的趨異-新基因產(chǎn)生的主要方式。外顯子洗牌從其他物種中獲得基因（外源基因轉(zhuǎn)移） 還有逆轉(zhuǎn)錄、基因裂變與融合、非編碼序列轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a序列等途徑二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 基因倍增單個(gè)基因的倍增單條或部分染色體倍增整個(gè)基因組的倍增84二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 基因倍增基

31、因倍增選擇壓力作用于兩個(gè)基因選擇壓力只作用于一個(gè)基因兩個(gè)基因保持相似一個(gè)拷貝降解一個(gè)拷貝獲得了新功能基因倍增的三種結(jié)果單個(gè)基因的倍增85二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 基因倍增有袋類哺乳動(dòng)物祖先真哺乳動(dòng)物86二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生單條或部分染色體倍增之 基因倍增三體： 對(duì)生物體來(lái)說(shuō)通常是致死的或引起疾病的 如人類21三體導(dǎo)致唐氏綜合癥 原因：某些基因拷貝數(shù)的增加可能導(dǎo)致基因產(chǎn)物不平衡以及細(xì)胞生化反應(yīng)被破壞。87二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 基因倍增整個(gè)基因組的倍增88二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 外顯子洗牌 指來(lái)源于不同基因的兩個(gè)或多個(gè)外顯子異位性地被

32、組合在一起，或是一個(gè)相同的外顯子通過復(fù)制產(chǎn)生了一個(gè)新的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)由結(jié)構(gòu)域組成，結(jié)構(gòu)域編碼片段的重排會(huì)產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)功能。89二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 外顯子洗牌結(jié)構(gòu)域倍增結(jié)果：使基因變長(zhǎng)（高等生物大于低等生物） 可能是有利的，如使蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。 倍增的結(jié)構(gòu)域可能因?yàn)槠渚幋a序列突變而逐漸改變，產(chǎn)生新的活性。90二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 外顯子洗牌結(jié)構(gòu)域重排（外顯子洗牌）結(jié)果：產(chǎn)生雜合或嵌合蛋白 這種蛋白可能是具有不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的新的組合體，并可能使細(xì)胞具有全新的生化功能91二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 外顯子洗牌結(jié)構(gòu)域重排（外顯子洗牌）例：組織

33、血纖維蛋白溶酶原激活物纖維結(jié)合素組織血纖維蛋白溶酶原激活物纖維蛋白溶酶原表皮生長(zhǎng)因子92體外蛋白質(zhì)進(jìn)化：根據(jù)外顯子洗牌理論設(shè)計(jì)，產(chǎn)生具有新活性的蛋白質(zhì)。 通過易錯(cuò)PCR、DNA改組、隨機(jī)引發(fā)重組、交錯(cuò)延伸等技術(shù)將外顯子按希望的方式重新組合，獲得人工創(chuàng)新編碼基因。二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 外顯子洗牌結(jié)構(gòu)域重排（外顯子洗牌）93二、基因組進(jìn)化的模式2.新基因的產(chǎn)生之 從其他物種獲得新基因細(xì)菌的接合、轉(zhuǎn)化不同物種的異源多倍化逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座元件94二、基因組進(jìn)化的模式3.非編碼序列的擴(kuò)張真核生物中，非編碼序列所占比例很大（如人類，97%），非編碼序列的組成主要為3種類型：高度重復(fù)序列轉(zhuǎn)座

34、因子基因間隔區(qū)和內(nèi)含子區(qū)大多數(shù)非編碼DNA是以相當(dāng)隨意的方式進(jìn)化的。但是轉(zhuǎn)座元件和內(nèi)含子例外。95二、基因組進(jìn)化的模式3.非編碼序列的擴(kuò)張 之 轉(zhuǎn)座元件 轉(zhuǎn)座子（TE）是轉(zhuǎn)座元件中的一種，具有完整轉(zhuǎn)座元件的功能特征并能攜帶內(nèi)、外源基因組片段在基因組內(nèi)移動(dòng)或在生命體之間傳播并可表達(dá)新的表型。96二、基因組進(jìn)化的模式3.非編碼序列的擴(kuò)張 之 轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)座元件對(duì)于基因組進(jìn)化的影響是多方面的。1）啟動(dòng)重組事件，導(dǎo)致基因組重排。轉(zhuǎn)座子之間的重組可以導(dǎo)致基因組片段的丟失97二、基因組進(jìn)化的模式3.非編碼序列的擴(kuò)張 之 轉(zhuǎn)座元件2）轉(zhuǎn)座也會(huì)引起基因表達(dá)方式的改變3）轉(zhuǎn)座子插入基因也可引起剪接方式的改變轉(zhuǎn)座子

35、插入基因上游區(qū)域，會(huì)影響 DNA結(jié)合蛋白激活轉(zhuǎn)錄的能力98三、基因組與生物進(jìn)化1.分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)DNA系統(tǒng)發(fā)生樹： 同源DNA序列中核苷酸取代的比率是物種之間進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)近的指標(biāo)。根據(jù)DNA代換的比率構(gòu)建的進(jìn)化樹即為DNA系統(tǒng)發(fā)生樹，與傳統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)生樹生命之樹相對(duì)應(yīng)。99三、基因組與生物進(jìn)化1.分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分子鐘：?jiǎn)挝粫r(shí)間（百萬(wàn)年）內(nèi)同源蛋白質(zhì)氨基酸順序或DNA核苷酸取代的比率。人猩猩取代的堿基個(gè)數(shù)=x每個(gè)譜系的個(gè)數(shù)=x/2 每百萬(wàn)年每個(gè)譜系取代的個(gè)數(shù)=x/(2*13)該同源基因的分子鐘速率為x/(2*13)100三、基因組與生物進(jìn)化1.分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)生物界沒有一個(gè)統(tǒng)一的分子鐘。構(gòu)建遠(yuǎn)古年代的

36、系統(tǒng)發(fā)生樹，應(yīng)選擇進(jìn)化慢的基因；構(gòu)建起源較晚的系統(tǒng)發(fā)生樹，應(yīng)選擇進(jìn)化快的基因。101三、基因組與生物進(jìn)化3.1 生物多樣性的遺傳基礎(chǔ)-基因組的變異 結(jié)構(gòu)域洗牌產(chǎn)生新基因 基因重復(fù)產(chǎn)生基因家族 基因表達(dá)具有時(shí)空特異性 特定組織細(xì)胞啟動(dòng)不同基因的表達(dá) 基因生物學(xué)的擴(kuò)展102三、基因組與生物進(jìn)化3.2 生物多樣性的分子機(jī)制 生物大分子的多樣性 蛋白質(zhì)編碼序列中簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列的擴(kuò)張與快速的形態(tài)變異有關(guān)103思 考 題1.基因組進(jìn)化的分子基礎(chǔ)？2.基因組可通過哪些方式產(chǎn)生新基因？3.DNA系統(tǒng)進(jìn)化樹和分子鐘？4.非編碼序列的功能？5.生物多樣性的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制？6.分子系統(tǒng)學(xué)的概念？7.哪些證據(jù)說(shuō)

37、明現(xiàn)代人起源于非洲古人類？8.SNP在基因組中的分布有何特點(diǎn)？104三、基因組與生物進(jìn)化2.3 現(xiàn)代人的起源現(xiàn)代人起源的兩種假說(shuō)105三、基因組與生物進(jìn)化2.3.1 線粒體夏娃-走出非洲假說(shuō)所有現(xiàn)代人線粒體都來(lái)自一個(gè)祖先的線粒體，它存在于14萬(wàn)至29萬(wàn)年前之間。因?yàn)檫@個(gè)祖先基因組可能位于非洲，因此將提供這個(gè)線粒體的先祖稱為線粒體夏娃(線粒體只能通過母性遺傳)，她也一定在非洲。線粒體夏娃的發(fā)現(xiàn)改變了有關(guān)現(xiàn)代人起源的看法。與多區(qū)域所主張的全世界人類平行進(jìn)化的觀點(diǎn)不同，走出非洲 (out of Africa) 假說(shuō)主張，智人(Homosapiens)起源于非洲，其成員在10萬(wàn)至5萬(wàn)年前遷徙(qian

38、xi)進(jìn)入舊世界，最終取代了他們所遇到的直立人。三、基因組與生物進(jìn)化2.3.2 Y染色體追蹤-父系的起源人類Y染色體多態(tài)性數(shù)據(jù)也支持線粒體夏娃的假說(shuō)。和線粒體DNA一樣，Y染色體的非重組區(qū)也是典型的單倍型，其中所含有的SNP中隱藏著大量有關(guān)人類進(jìn)化的線索： Y染色體非重組區(qū)在二倍體細(xì)胞中不存在同源拷貝，因而不發(fā)生交換重組事件。 由于避免了重組事件的干擾，位于Y染色體非重組區(qū)的SNP集中了曾經(jīng)發(fā)生過的所有變異。 SNP突變率較低，能忠實(shí)地記錄進(jìn)化事件。 Y染色體以單倍體形式存在，其有效群體遠(yuǎn)小于二倍體常染色體，較易產(chǎn)生人群特異性單倍型。第6章重組DNA技術(shù)及其應(yīng)用鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊108

39、一、重組DNA技術(shù)概述1.1 重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念克隆: 作名詞時(shí)指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無(wú)性繁殖系。 作動(dòng)詞時(shí)是指基因的分離與重組過程。重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組構(gòu)建雜種DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。109一、重組DNA技術(shù)概述供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件 供體：靶基因的提供者 載體：靶基因的交通工具 受體：靶基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄和翻譯的場(chǎng)所（生產(chǎn)車間） 重組DNA分子：靶基因與載體分子以共價(jià)鍵連接所

40、形成的雜合分子（載乘客的“BMW”）110二、重組DNA技術(shù)的基本步驟（1）獲得目的基因（2）酶切與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳（4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定（5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物111112二、重組DNA技術(shù)的基本步驟1. 目的基因的獲取已知基因的獲取： PCR、化學(xué)合成法未知基因的獲取： 基因文庫(kù)分離法、直接分離法目的基因即準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因，也就是研究或應(yīng)用所需要的基因。113二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體載體：vector

41、，由DNA構(gòu)成的遺傳成分，并能夠在相應(yīng)細(xì)胞中自主復(fù)制，又叫復(fù)制子。功能：攜帶外源DNA（目的基因）進(jìn)入指定的受體細(xì)胞，并能夠在其中復(fù)制或轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。目的基因的轉(zhuǎn)運(yùn)工具-載體“Shuttle bus114二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體載體必須具有的特性：具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性（可轉(zhuǎn)移性）具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，便于插入外源基因具有較高的外源DNA的裝載能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有合適的篩選標(biāo)記(抗性基因)安全，不含有有害基因克隆載體：其產(chǎn)物是目的基因的大量復(fù)制品轉(zhuǎn)錄載體：其產(chǎn)物是目的基因轉(zhuǎn)錄的RNA表達(dá)載體：其產(chǎn)物是目的基因編碼的蛋白質(zhì)（其除具有

42、克隆載體的基本元件ori, Amp, MCS等，還要具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等）二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2.1 載體分類-按功能分原核載體: 以原核細(xì)胞（細(xì)菌）為受體細(xì)胞或宿主細(xì)胞(host cell)真核載體：以真核細(xì)胞為受體細(xì)胞穿梭載體（shuttle vector）：含原核和真核生物的復(fù)制子，能夠在原核和真核細(xì)胞中存在和復(fù)制的載體，因而可以運(yùn)載目的基因穿梭往返于兩類生物之間真核基因通常是先在原核細(xì)胞中擴(kuò)增，再在真核細(xì)胞中表達(dá)二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2.1 載體分類-按受體細(xì)胞類型分二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定1)抗藥性篩選 2

43、)插入失活篩選法 4)限制性核酸內(nèi)切酶分析3)顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法) 5)Southern Blotting6)菌落原位雜交法7) PCR篩選法8) 核苷酸序列測(cè)定法118二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定1)抗藥性篩選: 這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。119 2)插入失活篩選法 經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了進(jìn)一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行再次篩選。 二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定120二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定3)顯色反應(yīng)選擇

44、法(-互補(bǔ)法) 原理：基因載體上含有-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，當(dāng)外源DNA插入到載體的LacZ基因上后將造成-半乳糖苷酶失活，就不能分解培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在含有X-gal-IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）培養(yǎng)基的顏色變化直接觀察出來(lái)。121二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定3)顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法) 將含有-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個(gè)氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細(xì)胞中，可使各自無(wú)活性的片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，產(chǎn)

45、生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱為-互補(bǔ)（藍(lán)白斑篩選）。122顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法)顯色反應(yīng)選擇法的結(jié)果圖轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長(zhǎng)成白色菌落。124 4)限制性核酸內(nèi)切酶分析 當(dāng)載體與外源基因進(jìn)行連接時(shí)，都需要對(duì)其進(jìn)行酶切，而且這些內(nèi)切酶都是已知的; 因此可以從初步篩選出來(lái)的陽(yáng)性重組菌中提取質(zhì)粒DNA，酶切，電泳，如果出現(xiàn)與預(yù)知的大小一致的電泳片段，就證明已經(jīng)有目的基因插入到載體中。二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定1251.空質(zhì)粒（線性化）2.

46、重組質(zhì)粒（線性化）3.重組質(zhì)粒（雙酶切）4.目的片段（PCR產(chǎn)物） M 1 2 3 4 二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定M 1 2M.DNA Marker；1.重組質(zhì)粒（雙酶切）2.重組質(zhì)粒（線性化）126二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定 5)Southern Blotting 將轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA經(jīng)過酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上； 用目的基因的標(biāo)記探針同固定在膜上的DNA片段雜交，經(jīng)放射自顯影或其它顯色方法確定出與探針互補(bǔ)的電泳帶。127 1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測(cè)重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)

47、原理，對(duì)Southern印跡技術(shù)作了一些修改，提出了菌落原位雜交技術(shù)。二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定6)菌落原位雜交法128二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定 通過對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析，確定目的基因是否插入到載體中。7) PCR篩選法普通PCR（質(zhì)粒為模板）菌落PCRM 1 2 3M: DNA Marker1：陽(yáng)性對(duì)照2：樣本3：陰性對(duì)照二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定7) PCR篩選法130二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定8) 核苷酸序列測(cè)定法最終鑒定，精確131思 考 題1.什么是重組DNA技術(shù)？2.載體必須

48、具有的特性。3.重組DNA技術(shù)的基本操作流程是什么？4.重組子篩選與鑒定方法。5.舉例說(shuō)明重組DNA技術(shù)的用途。6.重組DNA技術(shù)在提高人類生存質(zhì)量和維護(hù)生態(tài)環(huán)境方面的潛在價(jià)值？132第7章PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊133二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）反向PCR（inverse PCR）巢氏PCR（nesting PCR）原位PCR（in situ PCR）突變PCR（mutation PCR）多重等位基因PCR（multiplex allele PCR）不對(duì)稱PCR（asymmertric PC

49、R）實(shí)時(shí)定量PCR（real time PCR）134二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR) RT-PCR是擴(kuò)增RNA的PCR反應(yīng)，包括兩個(gè)步驟：在單引物的介導(dǎo)下以RNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA，即逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，在特異性引物引導(dǎo)下，擴(kuò)增合成靶DNA分子，即普通PCR。135二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)136二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR的應(yīng)用測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRN

50、A多態(tài)性,克隆mRNA的5和3末端序列，從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)。137二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)4.突變PCR 突變是改變DNA序列的最基本的方法，用以鑒定一個(gè)基因或DNA片段的功能，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。主要分為： 隨機(jī)突變：在目的基因的任意位點(diǎn)引入點(diǎn)突變，建立突變文庫(kù)。 定點(diǎn)突變：在選定的位點(diǎn)對(duì)DNA序列進(jìn)行修改，主要通過引物點(diǎn)突變、堿基或小片段的插入或刪除。138（1）隨機(jī)突變：應(yīng)用：構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體策略：易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）。利用Taq DNA聚合酶等耐熱DNA聚合酶不具有35校對(duì)功能的特性，在P

51、CR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，從而產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)4.突變PCR139（2）定點(diǎn)突變A. 5端引入突變：通過修飾上游引物的5端，即可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。B. 序列中的單位點(diǎn)突變：采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR)二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)4.突變PCR140（A）為5端引入突變 （B）為單堿基突變二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)（B）Site-directed Mutagenesis (Kit)142大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒99發(fā)生甲基化；PCR產(chǎn)

52、物是去甲基化的產(chǎn)物；DpnI識(shí)別甲基化位點(diǎn)并切割DNA，而去甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)被降解；經(jīng)過轉(zhuǎn)化，PCR產(chǎn)物鏈經(jīng)過修復(fù)形成環(huán)狀，從而完成突變 143 實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過軟件對(duì)PCR反應(yīng)中起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。 系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。 三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理145 PCR擴(kuò)增時(shí)，通過熒

53、光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理146三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2. 常用熒光標(biāo)記試劑和方法非特異性熒光染料標(biāo)記 SYBR Green I特異性熒光探針標(biāo)記 TaqMan Probe147三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.1 熒光染料 SYBR Green I是目前定量PCR最常用的一種熒光染料。SYBR Green I是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA雙螺旋小溝中具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大

54、增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA分子的數(shù)量有關(guān)，因此可根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR反應(yīng)體系中雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green I148熱 變 性引物退火延伸反應(yīng)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.1 熒光染料-作用機(jī)理149三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.2 熒光探針（1）Taqman探針原理 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q) 探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光;R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探針150熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR三、實(shí)時(shí)

55、熒光PCR技術(shù)（1）Taqman探針工作機(jī)理151三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)3.實(shí)時(shí)定量PCR常用的三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線 熒光閾值 Ct值熒光基團(tuán)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)A、擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線的兩種形式.左圖反映的是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)的變化量的對(duì)數(shù)與PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。153在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。三、實(shí)時(shí)熒光P

56、CR技術(shù)B、閾值線154 PCR擴(kuò)增過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)C、Ct值155橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)Ct值的重現(xiàn)性156Ct值與初始模板含量 Ct值與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系 初始模板量越多，C(t)值越小10610510410310210三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)157定量原理初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值）；利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得位置樣品的Ct

57、值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)（模板量）。確定初始模板的濃度三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)158思 考 題1.PCR技術(shù)的核心思想是什么？2.除了PCR技術(shù)，還有哪些核酸體外擴(kuò)增的技術(shù)，了解其原理，比較其與PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。3.熒光定量PCR的定量原理是什么？4.舉例說(shuō)明PCR技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用。第8章分子雜交與印跡技術(shù)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊探針(已知核酸片段，單鏈)待測(cè)核酸序列(單鏈)一、分子雜交與印跡技術(shù)簡(jiǎn)介分子雜交：核酸分子在變性后再?gòu)?fù)性的過程中，來(lái)源不同但互補(bǔ)配對(duì)的DNA或RNA單鏈相互結(jié)合形成雜合雙鏈的特性或現(xiàn)象。雜交的雙方是已知的探針和待檢測(cè)的核酸。1、分子雜交一、分子

58、雜交與印跡技術(shù)簡(jiǎn)介印跡技術(shù)：將核酸或蛋白質(zhì)等生物大分子通過一定方式轉(zhuǎn)移并固定到尼龍膜等支持載體上的一種方法（轉(zhuǎn)印技術(shù)）。印跡之后通常還要通過核酸雜交或免疫技術(shù)進(jìn)行生物大分子的檢測(cè)。2、分子印跡（blot、bloting）一、分子雜交與印跡技術(shù)簡(jiǎn)介2、分子印跡常用轉(zhuǎn)印介質(zhì)：硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜等。一、分子雜交與印跡技術(shù)簡(jiǎn)介2、分子印跡 轉(zhuǎn)印方法：毛細(xì)管虹吸法利用毛細(xì)管的虹吸作用由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動(dòng)核酸分子轉(zhuǎn)移至濾膜上。DNA片段由液體攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并聚集于薄膜表面。液體通過毛細(xì)管作用抽吸通過凝膠，借助于一疊干的吸水紙巾產(chǎn)生并維持毛細(xì)管作用。轉(zhuǎn)移的速度取決于DNA片段的大小和凝膠中瓊脂糖

59、的濃度，小片段DNA（1kb）1h內(nèi)就能夠從0.7%瓊脂糖上幾乎定量地轉(zhuǎn)移，而較大片段的DNA轉(zhuǎn)移較慢且效率較低。一、分子雜交與印跡技術(shù)簡(jiǎn)介2、分子印跡轉(zhuǎn)印方法：真空轉(zhuǎn)印法一、分子雜交與印跡技術(shù)簡(jiǎn)介2、分子印跡轉(zhuǎn)印方法：電轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)印法示意圖“三明治結(jié)構(gòu)” 即DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)待測(cè)DNA的一種方法。 三、常用分子雜交技術(shù)簡(jiǎn)介1、Southern 印跡雜交(1) DNA制備、酶切, 凝膠電泳分離,然后原位變性。 (2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 (3) 預(yù)雜交濾膜,封閉濾膜上非

60、特異性位點(diǎn)。(4) 制備探針，然后讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 (5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。 操作步驟三、常用分子雜交技術(shù)簡(jiǎn)介1、Southern 印跡雜交Southern Blotting的過程1.分離DNA2.轉(zhuǎn)膜3.預(yù)雜交4.雜交、洗膜 5.結(jié)果檢測(cè)(放射性和熒光檢測(cè))放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交1、Southern 印跡雜交應(yīng)用：遺傳病診斷DNA圖譜分析PCR產(chǎn)物分析Northern印跡雜交是指將待測(cè)RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固液相雜交，以檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法。 其基本原理和基本過程