DNA分子標(biāo)記技術(shù)在物種鑒定和系統(tǒng)分析中的應(yīng)用

1、DNA分子標(biāo)記技術(shù)在物種鑒定和系統(tǒng)分析中的應(yīng)用劉派（北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物技術(shù)系，北京市100083）摘要：隨機擴增多態(tài)DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）,是美國學(xué)者Williams和Welsh于1990年首先提出的該技術(shù)是通過分析DNA的PCR產(chǎn)物的多態(tài)性來推測生物體內(nèi)基因排布與外在性狀表現(xiàn)的規(guī)律的技術(shù)。RAPD技術(shù)是以8-10bp的隨機寡核苷酸片段作為引物，對基因組進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳或PAGE電泳檢測后顯色，分析擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性，此即反應(yīng)了基因組相應(yīng)片段由于堿基發(fā)生缺失、插入、突變、重排等所引發(fā)的

2、DNA多態(tài)性。至今，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究，作物遺傳多樣性分析，基因定位，找特定基因，如抗性基因、雄性不育恢復(fù)基因等可連鎖的標(biāo)記和物種識別，植物系統(tǒng)進化研究等多個領(lǐng)域，本文以草坪草為實驗對象進行RAPD標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：RAPD分子標(biāo)記；凝膠電泳；草坪草；隨機擴增；DNA引言RAPD技術(shù)一方面繼承了PCR率高、特異性強、樣品用量少以及檢測容易等特點。此外，與其它DNA多態(tài)性分析方法相比。RAPD技術(shù)還表現(xiàn)出很多獨特的優(yōu)勢和特點：（1）不必知道被測DNA特異性位點序列信息；（2）模扳DNA的量極少；（3）RAPD技術(shù)操作簡便快速；（4）RAPD所用引物均為人工定序合成；（5）基因型

3、的檢測自動化。本實驗在液氮環(huán)境下提取六種植物的DNA后，用實驗室編號為131-136的引物對六種DNA進行隨機擴增，接下來對其進行TBE凝膠電泳實驗操作，得到跑膠結(jié)果并對其進行分析。1RAPD標(biāo)記原理原理RAPD技術(shù)利用一系列隨機引物，以DNA為模板，通過基因放大器進行多態(tài)性DNA片段的隨機合成.如果某一引物與某一片段的模板DNA具有互補的核苷酸順序該引物就會結(jié)合到單鏈的模板DNA上，在具有4種游離dNTPs的情況下.通過DNA聚合酶連接.DNA鏈就會從引物的3OH端開始，某一引物可能會與單鏈DNA的許多地方結(jié)合.但只有在2000個堿基對以內(nèi).存在反向平行的某一引物互補的雙鏈DNA分子，才可能

4、將合成的新鏈作為下一次合成的模板.這個反應(yīng)由3個不同溫度的反應(yīng)步驟連續(xù)循環(huán)所組成.第一步.欲擴增DNA雙鏈的變性.DNA雙鏈在92941加熱變成單鏈，快速冷卻阻礙了單鏈DNA的重新結(jié)合.第二步，退火，隨機寡核苷酸引物互補地靠在DNA模板鏈的目標(biāo)位置上.退火溫度通常在35391.對于理想的RAPD技術(shù)條件按經(jīng)驗必須優(yōu)化.第三步.適溫延伸，共進行3545次循環(huán).擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色來檢測擴增片段的多態(tài)性.RAPD所用的一系列引物其序列各不相同.但對于任一特定的引物.它同基因組DNA有特定的結(jié)合位點.如果這些結(jié)合位點在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布符合PCR擴增的條件，就可

5、擴增出DNA片段.因此.如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生DNA片段插入、缺失、或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定位點分布發(fā)生相應(yīng)的變化.而使PRC產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變.因此通過對PCR產(chǎn)物的檢測即可測出基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性.由于進行RAPD分析時可用引物數(shù)量很大.雖然對每個而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的.但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組.因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測.RAPD技術(shù)的優(yōu)點RAPD技術(shù)一方面繼承了PRC效率高、特異性強、樣品用量少以及檢測容易等特點.此外.與其它DNA多態(tài)性分析方法相比.RAPD技術(shù)還表現(xiàn)出很多獨特的優(yōu)勢

6、和特點：第一，由于RAPD技術(shù)引物的設(shè)計是隨機的，因此可在不知道特異性位點序列信息的情況下，對各種生物進行DNA多態(tài)性分析構(gòu)建其基因指紋圖譜；第二，RAPD技術(shù)需模扳DNA的量極少.每個反應(yīng)僅需幾十納克DNA；第三，RAPD技術(shù)操作簡便快速.可免去其它DNA標(biāo)記中的克隆制備，多態(tài)性篩選，同位素標(biāo)記等步驟；第四，RAPD所用引物均為人工定序合成；第五，每個RAPD標(biāo)記就相當(dāng)于一個序列位點，故這種方法可以使基因型的檢測自動化。1.3影響RAPD的因素引物的合成是隨機的，但要滿足G+C的含量不低于40%，引物的長度以10bp為佳，引物太短(9bp)易從模板上脫落，聚合反應(yīng)難以進行;引物的濃度通常是0

7、.2umol/L，這一濃度足以完成40個循環(huán)的擴增反應(yīng)，引物濃度過高可能導(dǎo)致錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率這兩者均可競爭酶、dNTP和引物。但如引物濃度不足，則PCR的效率極低，擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量太低。4種dNTPs在使用時必須以等當(dāng)量濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用效率。2實驗步驟實驗材料準(zhǔn)備一.配制1MTris-HCl(pH8.0)配方:1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0).稱量121.1gTris置于1L燒杯中。.加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需要的pH值。PH值濃HCI7.4約70ml7.6約60ml8.0約42m

8、l(4).將溶液定容至1L。(5).高溫高壓滅菌后，室溫保存。二配EDTA(0.5mol/1pH8.0)配方:EDTA(0.5mol/lpH8.0)稱取93.06克EDTA2Na2H2O，置于500mL燒杯中加入約400mLddH2O.用熱磁力攪拌器充分?jǐn)嚢栌肗aOH調(diào)節(jié)pH值到8，約用10克固體NaOH(4)在溶液冷卻后，再用NaOH調(diào)節(jié)至pH=8加ddH2O將溶液定容到500ml(6)高溫高壓滅菌后，室溫保存三.1XTEBuffer儲存液分裝至500mL錐形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。滅菌備用。配方組份濃度10mMTris-HCl，1mMEDTA(pH8.0).量取下列溶液，置于1L燒

9、杯中。1MTris-HClBuffer(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL.向燒杯中加入約800mL的去離子水，均勻混合。.將溶液定容至1L。.高溫高壓滅菌，室溫保存。將三種的溶液配好后，再統(tǒng)一滅菌，保存。準(zhǔn)備滅菌水(500mL藍(lán)蓋瓶裝)1瓶，黃槍頭，藍(lán)槍頭，白槍頭，進口1.5mL離心管2盒,普通1.5mL離心管2盒，普通4mL離心管2盒,PCR小指管200pl2盒，滅菌，保存。電泳緩沖液：5XTBE(貯存液/L室溫保存)54gTris堿27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.5XTBE(工作液)草坪草基因組DNA的提取草坪草提前兩至三周種

10、植，當(dāng)草坪草的生長到了比較茂盛的階段，即可進行基因組DNA的提取。使用天根新型植物基因組提取試劑盒(DP320)，操作步驟如下：1.處理材料：清洗研缽及研磨棒，晾干或烘干，液氮預(yù)冷。取草坪草新鮮葉子組織100mg加入液氮充分研磨。加入400pl緩沖液LP1和6plRNaseA(10mg/ml)，漩渦震蕩1min，室溫放置10min。加入130pl緩沖液LP2，充分混勻，漩渦震蕩1min。12000rpm(13400g)離心5min,將上清移至新的離心管中。加入1.5倍體積的緩沖液LP3(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，立即充分振蕩混勻15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都

11、加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（13400g）離心30s,倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700pl漂洗液PW（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（13400g）離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。注意：如果吸附柱呈現(xiàn)綠色，向吸附柱CB中加入500pl無水乙醇，12000rpm（13400g）離心30s,倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。重復(fù)步驟6將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（13400g）離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3助于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。（漂洗液中乙

12、醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)實驗）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100pl洗脫緩沖液TE,室溫放置2-5min,12000rpm（13400g）離心2min,將溶液收集到離心管中。將同種植物的4份混合至1個離心管中，標(biāo)號，封口處加貼封口膜。放入-20C冰箱中長期保存，或者直接進行下一步電泳鑒定。草坪草基因組DNA提取情況的電泳驗證對于已經(jīng)提取完畢的基因組DNA,需要對其進行TBE凝膠電泳實驗來驗證提取情況。在電泳實驗之前需要制作TBE膠板，每100ml的藥品用量如下：0.7gRegularAgarose,100ml0.5XTBE電泳緩沖液，7p1GoldView

13、。如需其他用量則按比例添加。稱取適量的RegularAgarose至錐形瓶中，加入0.5XTBE電泳緩沖液，在微波爐中加熱使之溶解。待稍冷卻后加入適量GoldView,搖勻。將溶液趁熱倒入已經(jīng)組裝好的制膠槽中，待膠板徹底冷卻后方可使用。將膠板放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩沖液直至沒過膠板。將草坪草基因組DNA提取液10pl到離心管中并與1plLoadingBuffer充分混合后逐個加入到膠板的泳道槽中。在第一個泳道槽內(nèi)加入規(guī)格為入DNA/Hindlll的DNAMarker5pl。最后一個泳道槽內(nèi)加入規(guī)格為入DNA/HindIII的DNAMarker10pl。將電泳槽正負(fù)極與電泳儀正負(fù)極

14、正確相連，注意電泳方向從負(fù)極到正極。設(shè)定恒定電壓為110V,電泳1h。取出已經(jīng)電泳完畢的TBE凝膠放入凝膠成像儀（118室）拍攝圖像，記錄電泳結(jié)果。2.4基因組DNA的定量為方便下一步的RAPD-PCR時的加入的樣品劑量符合要求，需要將DNA濃度稀釋到約100ng/pl,根據(jù)TBE凝膠電泳的條帶明暗程度確定相應(yīng)稀釋倍數(shù)。2.5草坪草DNA的RAPD擴增RAPD引物的稀釋將RAPD引物稀釋至10pM/pl。即從100pM儲備液中吸取20pl引物溶液，分別加入180pl的超純水，并且標(biāo)號作為反應(yīng)用引物。RAPD-PCR反應(yīng)混合物的制備將以下溶液逐一加入滅過菌的規(guī)格為200pl的PCR專用管中，標(biāo)號

15、。草坪草基因組DNA（20ng-100ng/pl）1plRAPD引物（10pM/pl）1pl2*PCRMix12.5gl超純水10.5pl總體積25plRAPD-PCR程序94C反應(yīng)3min后開始如下循環(huán)：94C變性反應(yīng)1min36C退火反應(yīng)1min72C延伸反應(yīng)2min經(jīng)過以上循環(huán)45個以后，最后一個循環(huán)72C增加5min,循環(huán)結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物置于4C保存，如需長期保存則要放入-20C冰箱中保存。對PCR產(chǎn)物進行TBE凝膠電泳：制膠：同前，注意膠濃度：1.5%瓊脂糖凝膠加樣量：第一個泳道槽內(nèi)加入規(guī)格為D2000的DNAMarker10pl,其他每個泳道槽加入10pl反應(yīng)產(chǎn)物+1plloadi

16、ngbuffer電泳：設(shè)定恒定電壓為110V,電泳時間40min左右。取出已經(jīng)電泳完畢的TBE凝膠放入凝膠成像儀（118室）拍攝圖像，記錄電泳結(jié)果。3實驗結(jié)果及分析植物總DNA的提取草坪草提取DNA電泳圖D2000-zwobpDP一750bp一5*30bp一250bp-100bp（從左到右依次為：DNAmarker，黑麥草，小麥，將軍菊苣，荊車草，白三葉，雜三葉，后面的泳道重復(fù)前述順序）抵莪長10cm.電壓&v/cm.0.5TEE本人提取的植物DNA為白三葉DNA,位于第六道和第十三道，從電泳結(jié)果來看，DNA提取濃度markD2000電泳圖入DNA/HindIIIbpng/gg23130*47

17、7941619455571154361*SO23224820274256411采用131-136六種引物在PCR儀進行擴增，得到如下凝膠電泳圖：較高，經(jīng)過估計，稀釋七倍后用于后續(xù)多態(tài)性PCR擴增處理。6pl加樣，凝膠長度10cm,電壓6v/cm,0.5XTBEBuffer標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker片段電泳結(jié)果植物DNA的多態(tài)性擴增markD2000D電泳圖如下：從左到右看，第1，8，15道為markerD2000，本人所提白三葉DNA位于第6，13道。在引物為131的情況下，白三葉DNA在第6道跑膠，隨機擴增效果較好，可以看到六個條帶，從上往下看，第一個和第二個條帶顏色較淺，含量較少，其中第一個條

18、帶為500-750bp之間，第二個條帶在500bp左右；第三個和第四個條帶比前兩個條帶亮，但是不及后兩個條帶亮，含量介于兩者之間，其中三號條帶略低于250bp，四號條帶位于100-250bp之間；第五號和第六號條帶很亮，擴增最多，其中，第五號條帶略高于100bp，第六號條帶低于100bp?？偠灾?，引物131比較適合白三葉植物的RAPD。在引物為132的情況下，白三葉DNA在第13道跑膠，隨機擴增效果過強，條帶很亮，可以看到三個明顯條帶，但是其余條帶未明顯分離。從上往下看，第一個條帶為500bp左右，第二個條帶在250bp左右；接下來，從250bp到低于100bp，均有條帶出現(xiàn)，但是基本上是連續(xù)的，未有明顯分離。其中在150bp左右出現(xiàn)最大亮度，明顯高于周圍，說明此條帶擴增最多?？偠灾?，引物132作為引物時，擴增量大，但是分離不明顯，故不太適合白三葉植物的RAPD。參考文獻：西學(xué)院學(xué)報.1RAPD標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用進展白生文.2008.河2生物實驗室系列DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用.周延清2005.北京化學(xué)工業(yè)出版社P79-130上面一排，從左到右看，第1,8,15道為markerD2000,本人所提白三葉DNA位于第6,13