香菇多糖提取工藝

1、香菇多糖提取工藝1、香菇多糖(1) 香菇多糖結(jié)構(gòu)式分子式： C42H72O36 n分子量：n (2) 香菇多糖性質(zhì) 香菇多糖（lentinan;LNT）是從香菇中分離純化的一種葡聚糖，是以增強(qiáng)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能為主的免疫增強(qiáng)劑。 密度：3；沸點(diǎn)：1472 at 760 mmHg。 溶于堿溶液或甲酸，微溶于熱水或二甲亞砜，不溶于冷水、醇、乙醚、氯仿、吡啶或六甲基磷酰胺。對(duì)硫酸和鹽酸穩(wěn)定。 (3) 香菇多糖的功能 香菇多糖具有激活細(xì)胞免疫、調(diào)節(jié)多種體液免疫因子、誘導(dǎo)-干擾素生成，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)白細(xì)胞對(duì)腫瘤浸潤(rùn)，導(dǎo)致腫瘤部位血管擴(kuò)張、出血、壞死，阻止病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，提高SOD超氧

2、化物歧化酶活性，抑制MDA丙二醛 生成，抗脂質(zhì)氧化，降低膽固醇，調(diào)節(jié)糖代謝、改善糖耐量、擴(kuò)張胃腸道產(chǎn)生飽腹感而減輕食欲，降低血糖等功能。(4) 香菇多糖的應(yīng)用、香菇多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 香菇多糖在治療胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等方面具有良好療效。作為免疫輔助藥物，香菇多糖主要用來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，改善患者的身體狀況，延長(zhǎng)其壽命。 香菇多糖與化療劑聯(lián)合使用，有減毒、增效的作用。 香菇多糖配合其他藥物治療慢性乙型肝炎，可提高乙肝病毒標(biāo)志物的轉(zhuǎn)陰作用，減少抗病毒藥物的副作用。此外，香菇多糖可用于治療結(jié)核桿菌感染。、香菇多糖在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用 香菇多糖是一種特殊的生物活

3、性物質(zhì)，是一種生物反應(yīng)增強(qiáng)劑和調(diào)節(jié)劑，它能增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能。香菇多糖的抗病毒作用機(jī)制可能在于其提高感染細(xì)胞免疫力，增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞病變，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)等功能。同時(shí)，香菇多糖還具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性。因此，香菇多糖是一種有待開(kāi)發(fā)的抗流感的保健食品。2、香菇多糖的發(fā)展歷史(1) 誕生與發(fā)展過(guò)程 1968年GoroChihara首先從香菇子實(shí)體中浸提出6種香菇多糖,并證明其中一種具有明顯的抗腫 瘤作用,定名為L(zhǎng)entinan 1970 年Chihard 和Sasaki 用熱水浸提結(jié)合有機(jī)溶劑沉淀從香菇中提取到另外4 種多糖。 1986年獲日本厚生省批準(zhǔn)生產(chǎn)并外銷。 1988年我國(guó)衛(wèi)

4、生部批準(zhǔn)進(jìn)口，現(xiàn)今我國(guó)已有幾家國(guó)產(chǎn)LNT上市(如南京振中和福州梅峰等)。香菇多糖由于是單一組分，質(zhì)量易于控制，且具有療效高，劑量低，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，受到醫(yī)生的青睞。 自此,世界各地掀起了一股從大型真菌中尋找抗腫瘤藥物的熱潮。有關(guān)香菇多糖的研究尤其活躍,包括提取工藝及分離純 化研究,香菇多糖理化性質(zhì)及藥用價(jià)值研究 。但對(duì)多糖理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、藥效、藥理等方面仍無(wú)定論,仍須繼續(xù)深入研究。(2) 各種生產(chǎn)方法比較 主要的多糖提取方法有如下幾種: 熱水浸提法、 酸（堿）浸提法、 微波提取法、超聲波提取法、復(fù)合酶解法等等。 香菇多糖提取的工藝流程 多糖提取的常規(guī)工藝 原料預(yù)處理水(或酸)浸提浸提物真空濃

5、縮濃縮液酒精沉淀沉淀物sevage法脫蛋白水相丙酮洗滌多糖粗制品 采用復(fù)合酶解工藝 原料預(yù)處理復(fù)合酶解酶解液真空濃縮濃縮液酒精沉淀沉淀物丙酮洗滌多糖粗制品 復(fù)合酶解、 酸處理結(jié)合熱水浸提法提取香菇多糖的改進(jìn)工藝 原料預(yù)處理復(fù)合酶解酶解液水浸提酸浸提浸提物空濃縮濃縮液酒精沉淀沉淀物sevage法脫蛋白水相丙酮洗滌多糖粗制品 操作要點(diǎn)的對(duì)比 熱水浸提法 向香菇處理物中加入 20倍體積的蒸餾水,并在 40 水浴恒溫下浸泡 4h。放置冰箱冷凍柜中冷凍過(guò)夜。將香菇浸泡液從冰箱中取出, 解凍后在恒溫水浴箱內(nèi)分別抽提 30min、 60min、90min ,用4層紗布過(guò)濾后收集濾液。向?yàn)V渣中加入20倍體積的

6、蒸餾水再抽提一次, 沸煮時(shí)間同上用 4層紗布過(guò)濾后收集濾液,合并兩次濾液。 酸浸提法 向香菇處理物中加鹽酸溶液使其最終濃度分別為 mol/L、mol/L、 mol/L , 置于60恒溫水浴中浸提 8h , 加適量的NaOH中和至中性,過(guò)濾,濃縮。 微波提取法 向香菇處理物中按1:25加入去離子水浸泡過(guò)夜,粉碎,在一定微波條件下提取,冷卻后離心,從上清液中取樣測(cè)定其中多糖含量。 超聲波提取法 向香菇處理物中加入蒸餾水，進(jìn)行超聲波處理浸提。8000r/min離心五分鐘，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1020ml，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，進(jìn)行醇沉。放置過(guò)夜后再次離心，留取沉淀物，干燥至恒重。 復(fù)合酶浸

7、提法 向香菇處理物的中加 纖維素酶和果膠酶,目的是為了酶解細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間連接物,使其部分糖類物質(zhì)的溶出。往酶解后的香菇處理物中加入 20倍體積的蒸餾水,并在40水浴恒溫下浸泡80min 。迅速升溫沸騰90min ,后過(guò)濾得濾液。離心沉淀,上清液濃縮,乙醇沉淀。 復(fù)合酶解,酸與熱水相結(jié)合浸提法 向香菇處理物中加 纖維素酶和 果膠酶,目的是為了酶解細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間連接物, 使其部分糖類物質(zhì)的溶出。加 20倍體積的水在 40 水浴恒溫下浸泡 80min。后再迅速升溫煮沸 60min,用 4層紗布過(guò)濾后收集濾液, 再調(diào)節(jié) pH分別為 、5.5 ,進(jìn)行酸浸提, 然后再用 4層紗布過(guò)濾后收集濾液

8、。合并兩次濾液。濃縮。(3) 現(xiàn)在常用的生產(chǎn)方法 以上幾種方法均有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，而現(xiàn)如今也都在被使用！3 、生產(chǎn)技術(shù) (1)生產(chǎn)原理: 多糖溶于熱水,不溶于60%以上乙醇,也不溶于氯仿正丁醇.熱水浸提時(shí)，香菇組織膨脹破裂，多糖成分浸出，所以用熱水提取,乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質(zhì);因?yàn)闊崴部梢詫⒌鞍最愇镔|(zhì)提取出來(lái),所以用氯仿正丁醇萃取除去提取液中的蛋白。(2) 原料及要求: 將香菇清洗干凈，除去其根部，將剩下的菌傘擠壓，切小塊放入真空干燥箱干燥，待香菇恒質(zhì)量，放入粉碎機(jī)中粉碎，將粉碎后的香菇粉依次通過(guò)40，60，80，100目的篩子，得到40目以下、4060目、6080目、80100目、100目

9、粒度以上的樣品，過(guò)篩之后把各級(jí)香菇粉分別裝到清潔干燥的燒杯中，編號(hào)貼上標(biāo)簽，置于真空干燥箱中待用。 (3) 工藝流程： 熱水法提取香菇多糖工藝流程圖 【sevage法脫蛋白】 正丁醇、氯仿混合溶液（正丁醇：氯仿=1：4或1：5）和樣物提取液混合并且振蕩，不需要加熱，利用離心機(jī)離心，直到離液面交界處無(wú)白色混懸，也就是蛋白質(zhì)介于提取液與試劑交界處即可，最后分別提取即可。(4) 工藝流程說(shuō)明及主要工藝參數(shù)： 熱水浸提 向香菇處理物中加入 20倍體積的蒸餾水,并在 40 水浴恒溫下浸泡 4h。放置冰箱冷凍柜中冷凍過(guò)夜。將香菇浸泡液從冰箱中取出, 解凍后在恒溫水浴箱內(nèi)分別抽提 30min、 60min、

10、90min ,用4層紗布過(guò)濾后收集濾液。向?yàn)V渣中加入20倍體積的蒸餾水再抽提一次, 沸煮時(shí)間同上，用 4層紗布過(guò)濾后收集濾液,合并兩次濾液。 真空濃縮 將上述濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在大氣壓下進(jìn)行濃縮, 收集濃縮液。并用高速離心機(jī)在 6000rpm離心 15min , 目的是去除蛋白質(zhì)和雜質(zhì),得上清液。 酒精沉淀分離 在濃縮液中加入 4倍體積的 95%乙醇, 使香菇多糖呈絮狀凝膠物沉淀析出,而大部分蛋白質(zhì)和其它成分保留在溶液中, 再用高速離心機(jī)在 7000rpm下離心 15min得沉淀。 sevage法脫蛋白 將上述沉淀溶于適量的蒸餾水中,分別加入 20% 體積的氯仿和 7% 體積的異戊醇生成絮狀凝聚

11、物, 用高速離心機(jī)在5000rpm離心15min得沉淀。重復(fù)上述操作, 直至無(wú)凝聚物生成。 丙酮洗滌脫水 將酒精沉淀物用丙酮洗滌脫水兩次, 倒入放有干燥濾紙的培養(yǎng)皿中 (濾紙重0.98g) ,然后將培養(yǎng)皿放在 50 的烘干箱中進(jìn)行干燥 3h ,得到香菇多糖粗制品。 粗多糖純化 Sephadex G-100凝膠充分溶脹后裝柱，用蒸餾水平衡48h。取上述香菇多糖提取物溶于蒸餾水中，離心除去不溶物，上清液上柱分離，用蒸餾水洗脫，洗脫速度5mL/20min，200nm波長(zhǎng)紫外檢測(cè)，收集主要峰部分，冷凍干燥的白色香菇多糖，并稱重。(5) 主要生產(chǎn)設(shè)備： 燒杯（若干），玻璃棒，溫度計(jì)，錐形瓶（若干），漏斗

12、，水浴鍋，稱量天平，臺(tái)式恒溫振蕩器,臺(tái)式離心機(jī)，紫外線分光光度計(jì) (6) 關(guān)鍵過(guò)程與關(guān)鍵技術(shù) 多糖的提取 取香菇10g，于組織搗碎機(jī)內(nèi)粉碎，加入20倍量水，90 水浴加熱30min，抽濾，得濾液，加活性炭（1mg/mL），攪拌吸附1h，抽濾，得濾液，用氯仿萃取（3次）以除盡蛋白質(zhì)，萃余液中加無(wú)水乙醇，使其乙醇最終濃度為80%，沉淀12h后，于離心機(jī)中離心（4000r/min）30min,沉淀物分別用無(wú)水乙醇，丙酮，乙醚洗滌三次，既得香菇多糖提取物。多糖純化 凝膠柱層析原理：所謂層析，就是利用樣品中各組成成分的理化性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相兩相中，由于各組分隨流動(dòng)相前進(jìn)的

13、速率不同，從而把它們分離開(kāi)來(lái)的技術(shù)。 操作步驟： Sephadex G-100凝膠充分溶脹后裝柱，用蒸餾水平衡48h。取上述香菇多糖提取物溶于蒸餾水中，離心除去不溶物，上清液上柱分離，用蒸餾水洗脫，洗脫速度5mL/20min，200nm波長(zhǎng)紫外檢測(cè)，收集主要峰部分，冷凍干燥的白色香菇多糖，并稱重。香菇多糖分析檢測(cè) 定性分析苯酚-硫酸法 酚-硫酸試劑：酚3g，濃硫酸5mL，溶于95mL無(wú)水乙醇中，噴后，110,加熱幾分鐘，糖顯棕色。 定量分析分光光度法 A 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取60 干燥至恒重的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，至于100mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，用移液管量取對(duì)照品溶液0、容量瓶中，加蒸餾水至刻度，再各精密吸取1mL，至于具塞試管中，準(zhǔn)確移取8%苯酚溶液1mL，快速加入濃硫酸5mL，至于水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，橘黃色由溶度從小到大而逐漸加深，將溶液于490nm波長(zhǎng)的可見(jiàn)分光光度計(jì)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 B 樣品多糖測(cè)定 精密城區(qū)香菇多糖，加水溶解，定量轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。準(zhǔn)去吸取，按上述實(shí)驗(yàn)方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算香菇多糖含量。 (7) 該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：有可靠的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，不易招致雜菌污染。 缺點(diǎn): 能耗高，設(shè)備要求高，提取