小鼠呼吸狀態(tài)下晶狀皮質(zhì)層腦電波分析(附件)

1、晶須桶皮質(zhì)增量振蕩和伽瑪電在清醒小鼠都與呼吸現(xiàn)有的證據(jù)表明增量振蕩（0.5-4赫茲）在大腦中被涉及皮質(zhì)和丘腦電路固 有的網(wǎng)絡(luò)機制產(chǎn)生。在這里，我們報告說，在尖峰和局部場電位（LFP）的活 性清醒小鼠的胡須桶狀皮層三角洲波段振蕩相位鎖定到呼吸。此外，LFP振蕩 伽馬頻帶（30-80赫茲）是振幅調(diào)制的相位與呼吸節(jié)律。去除嗅球消除呼吸鎖 定增量振蕩和*相振幅耦合。我們的研究結(jié)果表明這樣的呼吸鎖定嗅球活性 在清醒狀態(tài)下的胡須桶皮質(zhì)三角振蕩和伽瑪功率調(diào)制背后的主要驅(qū)動力。振蕩神經(jīng)元的活動是在哺乳動物大腦皮層的普遍現(xiàn)象，可在局部場電位 （LFP）和腦電圖（EEG）信號1很容易觀察到。振蕩發(fā)生在廣泛的頻率范

2、圍 內(nèi)，包括慢（0.5-8赫茲）增量/ theta和高頻伽馬射線波段（30-80赫茲） oscillations2。如何振蕩的腦活動產(chǎn)生和控制，特別是在低（三角形，0.5-4赫 茲）-頻率范圍，以及如何振蕩涉及行為僅部分understood3。在增量頻率范 圍（0.5-4赫茲）新皮層神經(jīng)元的振蕩被認(rèn)為是通過包括兩個新皮質(zhì)和丘腦神經(jīng) 元circuits4,5機制所產(chǎn)生的，并與慢波睡眠在人類和動物的通常相關(guān)聯(lián)。然 而，在LFP和尖峰活動三角形帶振蕩活動中的清醒，頭部固定mice6-8.At其余 晶須桶皮質(zhì)中也觀察到，小鼠呼吸節(jié)奏地在1和3HZ之間的頻率，其對應(yīng)于所 述差分頻率范圍神經(jīng)元振蕩。雖然已

3、經(jīng)示出在行為水平的呼吸和晶須的流動是 動態(tài)鎖相在這個頻率band9-11，在桶皮質(zhì)神經(jīng)節(jié)律是否與呼吸仍未得到研究。為了檢驗清醒小鼠呼吸休息時呼吸頻率桶皮質(zhì)三角振蕩之間可能存在的聯(lián) 系，我們同時測量呼吸節(jié)奏和神經(jīng)元的活動在清醒的頭固定小鼠的胡須桶狀皮 層。我們發(fā)現(xiàn)，在胡須桶狀皮層2的增量帶神經(jīng)元振蕩。/WVV3AV1G11 田1B31B4tied gj/vwvwmFln-LFP HBJ338 BJS42J3 D D D o D2 D 4 n 牝工IltuBntsLtD圖1 |振蕩神經(jīng)元的活動相鎖了呼吸。在清醒小鼠呼吸道和局部場電位（LFP） 信號sin桶狀皮層之間的相關(guān)性和一致性。從一個鼠標(biāo)數(shù)據(jù)

4、顯示，但結(jié)果是轉(zhuǎn) 載于5出5只小鼠。（一）呼吸節(jié)律（黑色）和兩個LFP信號同時記錄在晶須桶皮層（紅色和藍 色），處于靜止?fàn)顟B(tài)。拍攝地點是300毫米分開。（二）自相關(guān)函數(shù)（左）呼吸和LFP信號和LFP-呼吸交叉相關(guān)（右）。曲線 的顏色對應(yīng)于一個。（三）同作為錄音的，反而加速呼吸引起的短暫暴露于缺氧的空氣中。 呼吸（四）自相關(guān)函數(shù)（左）和LFP信號和LFP-呼吸交叉相關(guān)（右）。曲線的顏色對應(yīng)于一個。（五）瞬時 呼吸頻率（上）和LFP-呼吸相關(guān)性（底部）在正常加速的呼吸通過暴露于低氧空氣引出。呼吸頻 率和一致性在5-S的時間窗口進行了計算，移動2.5的腳步。相干繪制在右側(cè) 顯示一個偽彩色代碼。在頂部

5、面板灰色背景顯示暴露于空氣中缺氧時間。在a 和c所示的數(shù)據(jù)是在電子商務(wù)中所示的完整數(shù)據(jù)且具有兩個3-S段（時間軸在 a和c共同與1中的E）。分別為相位鎖定到呼吸節(jié)律，并主要由嗅球活性驅(qū)動。此外，相位振幅耦合分析表明，LFP振蕩伽馬頻帶進行振幅調(diào)制的相位與呼吸 節(jié)律。因此，我們的研究結(jié)果表明，呼吸活動直接調(diào)制慢（1-4赫茲），有節(jié) 奏的體感晶須桶狀皮層神經(jīng)元的活動，并通過相位幅度耦合機制間接調(diào)節(jié)伽瑪 帶電源。幾項研究發(fā)現(xiàn)，西塔-yPHAS -amplitude耦合，感覺，運動和認(rèn)知 processes12-15。我們的研究結(jié)果表明這樣一個可能的神經(jīng)機制，嗅覺和觸覺 晶須sensation9-11

6、之間的跨模態(tài)的相互作用。結(jié)果呼吸鎖定LFP振蕩桶皮質(zhì)。采用多電極細胞外記錄技術(shù)，我們測得的尖峰和局 部場電位（LFP）的活性清醒，頭部固定小鼠的體感晶須桶狀皮層。同時，呼 吸活性通過測量空氣溫度的波動，在鼻孔的前方（見方法）監(jiān)測非侵入。LFP 以及單層和多層單元秒殺活動進行了相關(guān)性節(jié)奏與呼吸（圖1,2）。影響對振蕩嗅覺bulbectomy的。Respirationlocked神經(jīng)元活動已知會發(fā)生在 嚙齒動物嗅球，通過嗅覺感覺神經(jīng)元的激活與從動每次呼吸通過nose16,17。Fontanini等al.18,19已經(jīng)表明，這些振動可以傳播 到嗅覺梨狀皮質(zhì)。在休息的平均呼吸率C57BL / 6J小鼠

7、是165呼吸min_1或 2.75赫茲（參考文獻20）。因此，小鼠呼吸在靜息率位于神經(jīng)元oscillations1 定義的1-4 Hz的頻率變化范圍內(nèi)。我們問是否在感官晶須筒呼吸鎖定神經(jīng)元三 角波段振蕩可以通過嗅球活動的推動。作為第一個實驗性的方法，我們手術(shù)切 除嗅球（以N？ 6）小鼠。嗅覺bulbectomies消除桶皮質(zhì)增量帶振蕩和呼吸和 個LFP （圖3）之間的相關(guān)性。我們在呼吸頻率的連貫性方面量化這種降低呼 吸和LFP之間的鎖定。這是由于bulbectomy減少了 LFP-呼吸相干對應(yīng)于平均 減少了 91 %（圖3），因此，高度顯著減少（Po0.001 （二側(cè)），曼-惠特尼 U檢驗）。

8、LFP振蕩與鼻腔氣流。要控制，如果不涉及到呼吸等作用是負(fù)責(zé)呼吸和LFP之 間的一致性的bulbectomized小鼠的損失，我們執(zhí)行了完整的，麻醉的小鼠氣 管切開術(shù)（N? 3）通過鼻子呼吸消除。這個操縱選擇性地阻止激活嗅球通過鼻 氣流，同時使燈泡完好無損。LFP的活動被記錄在晶須桶皮質(zhì)和呼吸活動是通 過胸部的運動監(jiān)測。此外，我們產(chǎn)生通過獨立于自發(fā)呼吸氣管（圖4）的鼻子 的人工節(jié)奏氣流。這是在三個不同的氣流的頻率和受控的體積中進行的 模仿的B0.15毫升（見法）鼠標(biāo)的休息潮氣量。被選擇的頻率為人工鼻氣流要 低（0.8HZ），高（3.2Hz）或相同（1.6Hz）作為平均麻醉的小鼠自發(fā)性呼吸頻率。在

9、氣管切開小鼠，呼吸和桶皮質(zhì)LFP活性之間的 相關(guān)性弱（圖4b，D，F(xiàn)，右，綠色），但LFP活性強烈的節(jié)奏鼻氣流（圖 4b，D，F(xiàn)相關(guān)，右，黑色）在所有三種測試的頻率。DJ315口m LnqHPJJa-0J3D5州明皿5嘩怕”廣1科心*用UWVAIIIII-inTE0J3OE1J3LagirnQ 圖2 |秒殺活動的節(jié)奏與相關(guān)呼吸。單（N? 3）和多單元（N? 9）秒殺活動被 記錄在兩個清醒小鼠的胡須桶狀皮層?；ハ嚓P(guān)值與呼吸尖峰活動是為三分之三 單個單元和九分之八多組錄音顯著。單機秒殺活動（一）跨尖峰時間間隔直方 圖記錄了在清醒小鼠的胡須桶狀皮層10分鐘。插圖示出了第一（左）和最后一 個（右）10

10、的動作電位的波形的疊加。（二）互相關(guān)的單單元尖峰活性與呼 吸（發(fā)病吸氣周期的時間）。藍線代表了原始的互相關(guān)。黑線代表代理相關(guān)的 分布的中值。頂部和底部的紅色線條描繪的代孕相關(guān)分配的第5和第95百分 位數(shù)分別為（見方法或細節(jié)）。生的相關(guān)性被認(rèn)為是顯著如果互相關(guān)值超過了 代理相關(guān)的分布的5或95百分位邊界。鼻腔氣流和LFP活動之間的相關(guān)性最高的發(fā)生在鼻腔氣流的1.6 Hz的節(jié) 奏。這可能是由于產(chǎn)生共振皮層主要神經(jīng)元，其中已示出的現(xiàn)象，以具有優(yōu)選 的亞閾值頻率接近1.6Hz （參見21頁）。LFP活動如下電嗅球刺激。通過鼻子有節(jié)奏的氣流可能會產(chǎn)生小的機械力對嗅 球可能導(dǎo)致由于對記錄電極的腦組織小運動

11、神經(jīng)元的反應(yīng)。因此，我們又進行 對照實驗中，我們通過進行氣管切開術(shù)消除鼻腔氣流，但現(xiàn)在調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動 在嗅球通過電刺激，同時記錄皮層每桶LFP活動。我們使用有節(jié)奏的電刺激， 包括當(dāng)前步驟簡要列車激活同側(cè)嗅球在用于人工鼻氣流刺激（0.8, 1.6和3.2 赫茲），在以前的實驗中相同的頻率。這些刺激引起的桶皮質(zhì)個LFP （圖5） 的刺激鎖定的節(jié)奏波動，確認(rèn)有節(jié)奏的嗅球活動節(jié)奏調(diào)節(jié)在晶須桶皮質(zhì)神經(jīng)元 的活動。圖3 |嗅球活動帶動皮質(zhì)振蕩。減少記錄在清醒，頭部固定條件不變，嗅覺 bulbectomized小鼠呼吸和局部場電位（LFP）信號之間的連貫性。（一）呼吸 （黑色）測量為在小鼠的鼻孔前的溫度和同

12、時記錄LFP信號（紅色和藍色）的 bulbectomized鼠標(biāo)的筒皮質(zhì)。該呼吸信號進行歸一化的平均的減法和除法由SD （二）自相關(guān)函數(shù)（左圖）的LFP的和中所示的呼吸信號和 crosscorrelations （右）的呼吸信號和任一 LFP信號之間。紅色和藍色曲線表 示從由相應(yīng)的顏色的繪制個LFP獲得的交叉相關(guān)。（三）呼吸信號和LFP信 號之間的一致性暗算呼吸頻率。單個數(shù)據(jù)點代表的呼吸和同時記錄LFP信號之 間的50個數(shù)據(jù)段內(nèi)的一致性。不同的符號代表不同的小鼠，白色和黑色的符號 代表完整，bulbectomized小鼠分別?？偣灿?2和1850-S段從五個完整和六 bulbectomized

13、小鼠進行采樣，分別為。多個相同的碼元代表多個平行LFP測 量（最多五個電極的晶須桶皮層）或多個LFP樣品中一只小鼠在相同的記錄部 位。沿x軸的每個碼元位置由平均呼吸速率對應(yīng)的50-S段期間確定。在C中 顯示的數(shù)據(jù)（四）總結(jié)。白色和黑色的方塊，并須圖表示的裝置（蟬內(nèi)側(cè)的 框），在第一和第三四分位數(shù)（底部和拖曳上端）和數(shù)據(jù)（晶須）的擴展區(qū)中 的白色和黑色的數(shù)據(jù)點C，分別。Y和呼吸節(jié)奏相振幅耦合。最近的研究表明，伽馬射線波段的幅度或功率調(diào)制 的相位增量波段振蕩，這一發(fā)現(xiàn)被稱為相位幅度coupling14,15,22。我們的數(shù) 據(jù)還表明這種類型的交叉頻率的互動。我們發(fā)現(xiàn)，伽馬振蕩（75赫茲）的晶須 桶

14、皮質(zhì)的功率被調(diào)制的相位與呼吸周期（圖6）。因此，不僅緩慢振蕩，而且 高頻率的活動中的晶須桶皮質(zhì)鏈接到呼吸。這樣的交叉頻率的耦合已經(jīng)牽涉在 空間和時間上的協(xié)調(diào)與高級腦functions14,23相關(guān)的神經(jīng)元的活性。通過使用 自舉統(tǒng)計方法，利用相位隨機化替代數(shù)據(jù)（見方法），我們表明，去除嗅球中 被淘汰電力的呼吸相關(guān)的調(diào)制各地的過渡，從伽瑪（30-80Hz）的頻率范圍為 快（80-200Hz）振蕩。發(fā)生相反的下面和上面的該頻帶的嗅覺bulbectomy 后，其中觀察到相位振幅耦合（圖6）中的頻率范圍。逆行追蹤。通過respirationlocked神經(jīng)元活動的途徑達到每桶晶須皮質(zhì)目前尚 不得而知。在

15、小鼠的嗅覺大或梨狀皮質(zhì)被稱為顯示呼吸鎖定神經(jīng)元 oscillations18,19，因而從主嗅球的桶狀皮層的通路一個似是而非的鏈接。以確 定晶須桶皮質(zhì)是否接收從梨狀皮層或其它嗅覺有關(guān)的領(lǐng)域的直接預(yù)測，如內(nèi)嗅 皮層，杏仁核或眶額cortex24,25,我們注入了逆行示蹤劑（熒光金）入桶皮質(zhì) （見方法）。前腦的神經(jīng)元投射到晶須桶皮質(zhì)的標(biāo)簽是與先前的研究一致（例 如，參考文獻26）。投射神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了腹后內(nèi)側(cè)丘腦（VPM），并在較小程 度上為以及在腹后外側(cè)丘腦（VPL）。標(biāo)記的神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)了一些皮質(zhì)區(qū)，包括對 側(cè)皮質(zhì)桶，以及相鄰的同側(cè)皮質(zhì)區(qū)，包括二級體感（S2），嗅和島葉皮質(zhì)和延 髓運動皮層。在軀

16、體感覺皮層區(qū)域，投射神經(jīng)元分別在層2,3和5中，而不是 在層1或4稀疏，大標(biāo)神經(jīng)元主要存在被發(fā)現(xiàn)在基底前腦核，這些都是已知的 項目的基底核可能膽堿能神經(jīng)元多個皮質(zhì)區(qū)。Time (s)Lag sLag sC 有思EN ELIOE)CL當(dāng)80610283Time (s)Lag (s)Cross (5眼 1 00 s)Lag (s)e詢 _籍 標(biāo)里oE)CLLL_JIsII140149150151Time (s)1 u1e_uloup101布仁oQE-npoLUCLLL1V*Stlm.artlf.SllTht liWM1 sO.e Hz, 50 gA O.e Hz, eo pA圖5 |嗅球的電刺激夾

17、帶的皮質(zhì)活性。（一）平均每桶皮質(zhì)LFP回應(yīng)同側(cè)嗅球與0.8 Hz的有節(jié)奏的刺激，電刺激。刺激包括 了重復(fù)每1.25秒10毫秒當(dāng)前步驟（50 MA）50赫茲的火車（？ 0.8赫茲）的。箭頭指 向的刺激列車的發(fā)作。電刺激的文物（標(biāo)標(biāo)stim.artif大括號）出現(xiàn)密集的垂直線截斷 在底部。LFP信號在全國30個刺激的火車平均。該 由電池驅(qū)動的刺激隔離單元（A380，世界精密儀器，美國）軟件生成和D/土木工程署 1401的輸出（包括劍橋電子設(shè)計，英國）和刺激電流。（五）平均LFP反應(yīng)中所描述的三種不同的刺激頻率在兩個不同的刺激電流測量。響 應(yīng)于每個刺激frequencycurrent組合測定中三只小

18、鼠。響應(yīng)幅值進行歸一化到每個動 物的到0.8赫茲/80毫安刺激的最大響應(yīng)和跨三只小鼠的平均值。響應(yīng)幅值為刺激電流，刺激頻率的函數(shù)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。uo-lRI-dsoB .dEcoka)SBk-$Tima (s)圖6 |電源的高頻振蕩呼吸調(diào)制。呼吸鎖定6和Y波段振蕩的一個完整的清醒和 清醒bulbectomized鼠標(biāo)桶皮質(zhì)LFP活動之間的相位振幅耦合，其次是人口的 統(tǒng)計數(shù)據(jù)。（一）呼吸系統(tǒng)的活動（上圖），伽瑪波段振蕩（中間曲線）和增量振蕩（淺 綠色底曲線）和相位（墨綠色下部曲線）在一個完整的鼠標(biāo)幅度。伽馬振蕩（75赫茲）的振幅峰值節(jié)奏地相位鎖定到增量周期。（二）伽馬振蕩幅度為三角洲相（紅

19、色）的函數(shù)。固體和虛線的黑線表示平均 值，并從1000相位隨機化的代理人所估計的替代振幅分布的2.5和97.5%的 界限。伽瑪調(diào)幅是在三角洲周期階段0顯著。（C, D）同A, B分別，但對于一個bulbectomized鼠標(biāo)。去除嗅球后，伽馬 波段振蕩的幅度調(diào)制是不再相位鎖定到呼吸。（五）通過呼吸道（增量）的頻率的相位和頻率范圍從1到256赫茲的的幅度 之間的平均向量的長度（MVL的實黑線）相振幅耦合的定量分析（對數(shù)比 例）。灰色和白色背景的描繪常用頻段boundaries固體和點綴灰色線表示 的均值和95個百分點，分別代孕是指從1000相位隨機代用品估計向量長度 值。（F）與呼吸LFP相位振

20、幅耦合的完整和bulbectomized老鼠人口統(tǒng)計。MVL 值來自同一組的LFP段被計算為在圖1中的相干性分析中使用。2c中（從5 完好52樣品和來自六個bulbectomized小鼠18個樣品）。的曲線圖代表樣品 超出代理MVL值分布在完整的（黑色）95百分位邊界的分?jǐn)?shù)和bulbectomized 小鼠（灰色）繪制為振幅頻率（對數(shù)換算）的函數(shù)。相位頻率被固定在呼吸頻 率。對晶須桶皮質(zhì)呼吸鎖定嗅球活性的影響并不限于三角形帶振蕩相位振幅耦合的 分析表明，在晶須桶皮質(zhì)伽馬波段振蕩活動的功率進行調(diào)制的相位與呼吸鎖定 三角形帶活動呼吸作為鏈接到嗅覺和活性晶須運動觸覺探索行為之間的相互作 用已提出的W

21、elker，基于早期行為觀察大鼠。最近的研究證實，呼吸道和胡須 的觸覺行為協(xié)調(diào)，mice9和ratsl0，提示嗅覺和觸覺感官收購的協(xié)調(diào)互動。事實上，這兩個感覺系統(tǒng)都不是獨立被研究顯示進一步支持這一之一的結(jié)果的損失 增加的靈敏度，在其他感覺形式。攪打和呼吸運動的小鼠與動態(tài)相關(guān)性是在緩慢的晶須（5HZ）特別強的相關(guān) 性。因此，緩慢地攪拌過程中，從晶須感覺輸入是可能有助于在晶須桶皮質(zhì)的 呼吸-LFP的連貫性，除了嗅球感覺輸入。然而，晶須感官反饋呼吸，LFP 一致 性的貢獻不能超過最大相干的10%時，由于bulbectomy實驗證明，嗅球活 動占90%LFP呼吸的連貫性。由于皮質(zhì)活動三角形帶振蕩也存在

22、于哺乳動物中誰呼吸比小鼠更慢（例如， 人類），很可能涉及丘腦回路并聯(lián)神經(jīng)元機制的存在產(chǎn)生增量振蕩獨立的呼吸 節(jié)律的。我們的研究結(jié)果表明，但是，呼吸可能導(dǎo)致軀體感覺皮層活動的有節(jié) 奏的調(diào)制在物種特異性的呼吸速率。取出嗅球減少的呼吸頻率91%的呼吸， LFP的連貫性。因此，在小鼠嗅球活動負(fù)責(zé)大部分的呼吸鎖定神經(jīng)元振蕩，但 其他呼吸與感覺輸入，例如從三叉鼻腔氣流傳感器，上呼吸道傳感器和胸部的 肌肉，很可能也貢獻。這些可能是負(fù)責(zé)剩余呼吸鎖定調(diào)制bulbectomized小鼠 中觀察到，也可以存在于動物不佳或沒有意義的嗅覺，像海豚。我們的發(fā)現(xiàn)提供了一個潛在的神經(jīng)機制在清醒，表現(xiàn)小鼠嗅覺和晶須觸覺之間 的

23、相互作用。行為的研究顯示，呼吸和晶須的動作的時序是動態(tài)的，協(xié)調(diào)的。 結(jié)果曹等A1。表明通過活性氣味和觸感嗅探和高頻攪打可以在小鼠中獨立地發(fā) 生，同時研究通過Deschenes等人提出的連續(xù)強相大鼠兩個節(jié)奏之間的鎖定。 伽馬振蕩大鼠的桶狀皮層已被證明能增加馬上探索攪打行為前，后機械地攪拌刺激.無論這些變化，y放射性活度分別與 呼吸的這些研究并沒有解決。我們的研究結(jié)果表明，每桶皮質(zhì)伽瑪帶電源相位 調(diào)制與呼吸可以在協(xié)調(diào)嗅覺和觸覺感覺處理的作用。關(guān)于呼吸鎖定振蕩的晶須 感覺處理的潛在功能作用的其他線索可能來自不同的物種進行了比較研究。鼠，沙鼠，倉鼠和龍貓，誰也有桶皮質(zhì)和能動的胡須，也有增量頻帶內(nèi)休息呼

24、 吸頻率（1.2，1.4, 0.7和0.7Hz，分別）。我們的研究結(jié)果為基礎(chǔ)的物種可 以預(yù)期，顯示呼吸鎖定伽瑪功率調(diào)制的桶狀皮層，類似于鼠標(biāo)。相比之下， Guniea豬擁有晶須桶皮質(zhì)，但有immotile mystacial胡須，因而缺乏積極晶須 感應(yīng)的行為。如果伽馬功率的呼吸鎖定調(diào)制并起到呼吸與晶須觸覺傳感的協(xié)調(diào) 作用，也可能是不太明顯的，甚至不存在于動物沒有存活觸感。綜上所述，在嗅球呼吸鎖定神經(jīng)元振蕩落后于小鼠的體感皮層三角洲帶神經(jīng)振 蕩的主要動力。此外，y波段振蕩，這已被廣泛地涉及在更高的皮層處理，是 振幅調(diào)制的相位隨呼吸。因此，生活配套呼吸行為，圖桶皮質(zhì)傳入7逆行追蹤。代表圖像顯示在腦

25、注射后逆行示蹤劑（熒光金）到 每桶皮質(zhì)逆行標(biāo)記。在S1BF （一）注射部位（桶皮質(zhì)）。（二）逆行標(biāo)記細 胞沒有在梨狀皮層（PC）的實測值。逆標(biāo)神經(jīng)元主要是在層對側(cè)皮質(zhì)桶（T），同側(cè)腹后內(nèi)側(cè)（VPM），丘腦（D），同側(cè)相鄰S2 （體感）皮層（E）2,3和5中找到。還有神經(jīng)元在同側(cè)基底前腦（BF）核（F）的稀疏的標(biāo) 簽。集成電路，內(nèi)囊；LH，下丘腦外側(cè);VPL，腹后外側(cè)丘腦;VL，腹外側(cè)丘 腦。比例尺（一），400pm。（B-F），100m的。圖片A-T和D-的票價從不同的小鼠。認(rèn)為是由腦干中心大多控制，具有對小鼠高階大腦活動意想不到的，間接的影 響，通過嗅覺系統(tǒng)。無論是類似的影響于大腦活動的呼吸

26、也存在于其他皮層區(qū)域也可能在人類中，其嗅球中相對于新 皮層大小已大大減少，仍有待所示。方法動物。實驗是在成年雄性C57BL/ 6J（B6）小鼠中進行（48周齡，18 25克 體重）。雄性小鼠被用來避免變性相關(guān)的動情周期行為生理措施。小鼠飼養(yǎng)在 繁殖地，具有12小時光照/標(biāo)準(zhǔn)籠深循環(huán)住房與最大隨意獲得食物和水只成年 小鼠。光周期（在1200至1700小時）期間進行的所有實驗。無小鼠經(jīng)過任何 以前的實驗過程。所有的動物實驗程序遵守經(jīng)田納西州健康科學(xué)中心動物護理 和使用委員會的大學(xué)指南。實驗室動物護理（NIH出版號86-23，修訂版1996 年）的原則隨訪。準(zhǔn)備清醒，頭部固定記錄。對于手術(shù)，小鼠被麻

27、醉了3%異氟醚（百特醫(yī)藥產(chǎn) 品，迪爾菲爾德IL）中氧氣的孵化室，轉(zhuǎn)移到立體定位頭安裝和麻醉是通過喉 舌繼續(xù)1-2.5%異氟醚氧。異氟烷濃度控制用蒸發(fā)器（高地的醫(yī)療設(shè)備，CA） 中。麻醉深度調(diào)整，直到小鼠沒有表現(xiàn)出對后爪的反射撤退到一個強大的壓 力。鈍耳棒被用來防止損壞耳膜。核心體溫，用直腸溫度計測量，維持36.5和38.0 度 C 之間有 feedbackcontrolled 加熱墊（金控公司，Bowdoinham,ME）。手術(shù)技術(shù)的詳細elsewhere34,35進行了描述。簡單地說，一個小的開 顱手術(shù)（直徑1-2毫米）中提出了合適的晶須桶皮質(zhì)1毫米后到前囟和3.5mm 的橫向中線。暴露的，

28、但完整的硬腦膜上覆蓋著三重抗生素（沃爾格林，美 國），以保持濕潤，減少感染的風(fēng)險。一個圓柱形的塑料腔（0.45厘米直徑的 到8mm高）被放置在顱骨開放和充滿三重抗生素。三個小螺釘（1/80圓頂 頭，直徑0.8毫米，長2mm，小零件公司，邁阿密湖，佛羅里達州）分別固定 在顱骨，以及金屬頭后是安裝前至前囟門。該腔室，頭后和頭骨螺釘被固定到 位的牙科丙烯酸類，如前面所述。小鼠皮下注射5毫克kg_1鎮(zhèn)痛Torbugestic （堡Doege，USA），以減輕疼痛和0.5ml乳酸林格氏液作為補液手術(shù)的第一 個24小時內(nèi)兩次。電生理記錄和清醒小鼠呼吸監(jiān)測。使小鼠的頭部手術(shù)后的安裝和錄音室后3-4 天的恢復(fù)

29、期，在0900和1500適于頭部約束的實驗情況，期間在同一天進行 15分鐘時長的頭固定兩會前小時。在這些會議上，頭部保持固定和身體上覆蓋 著寬松的塑料半管（直徑5厘米，長10厘米），以限制運動。小鼠通常適于 將頭部固定在2-3會話與第三會話期間判斷通過顯著減少行走和跑步動作與上 述第一或第二比較。在實驗設(shè)置中，頭部保持裝置和記錄程序已經(jīng)詳細的技術(shù) publication34說明?？傊?，頭部固定夾緊涉及金屬頭后固定在鼠標(biāo)的頭骨的金 屬固定裝置，使用機器螺釘。三重抗生素糊劑然后從記錄室中取出，并在腔室 沖洗和填充用無菌生理鹽水溶液。在每次實驗前，小鼠被允許容納在頭部固定的情況為30分鐘的記錄之前。

30、 對于外記錄，一個計算機控制的微驅(qū)動（MiniMatrix，托馬斯錄制，德國）的導(dǎo) 向管中下降進入鹽水填充的錄音室，以小于從大腦硬腦膜表面2毫米的距離。 的不銹鋼導(dǎo)向管也用作參考電極和被折衷連接到經(jīng)由鹽溶液的腦組織。然后， 2-5電極（玻璃隔熱鎢/鉑，阻抗：3.5-5.0MO）分別為通過完整的硬腦膜進入晶須桶狀皮層慢慢前進。電極升降控制了用微米的分辨 率和數(shù)字化監(jiān)控。局部場電位和尖峰信號通過帶通濾波器在0.1到200 Hz和 200 Hz至8 kHz的分離，分別使用硬件濾波放大器（FA32;多通道系統(tǒng)）。濾 波和放大電壓信號進行數(shù)字化，并存儲在計算機的硬盤（16位A/ D轉(zhuǎn)換器， 采樣率，42

31、0千赫的動作電位，41千赫個LFP）采用CED power1401和的 Spike2軟件（包括劍橋電子設(shè)計）?；谂c暖空氣的呼氣相關(guān)的溫度變化的呼吸行為進行監(jiān)控。熱敏電阻 （Measurement Specialties 公司，波士頓，MA，USA）被放置在一個鼻孔 （或下降氣管切開的一些實驗）的前面，以及呼吸循環(huán)能可靠地計量時溫度升 高，呼氣時下降，分別為吸氣動作。升高的溫度表示為熱敏電阻的電壓信號的 正偏差，這因此對應(yīng)于呼氣動作（圖1,2）。生熱敏電阻的電壓信號進行數(shù)字 化，在1千赫，并與電生理信號一起存儲。在每個記錄會話完成后，林格氏溶液去除，錄音室充滿了三聯(lián)抗生素和小鼠回到了自己的家籠

32、。每只動物通常參與實驗1-2周。氣管切開術(shù)和鼻氣流控制。為了進一步探討這個問題神經(jīng)元的活動是否被鎖定 到呼吸的運動行為或鼻腔氣流，從而嗅球的激活，我們就從鼻腔氣流打開了氣 管麻醉小鼠獨立呼吸。當(dāng)鼠標(biāo)可以通過降氣管自發(fā)呼吸，我們能夠通過升氣管 流動的空氣，以獨立地調(diào)節(jié)鼻氣流。對于氣管切開術(shù)的電生理記錄之前的表現(xiàn)，小鼠（n？ 3）麻醉用阿佛?。?00 毫克kg_1）。該氣管切開術(shù)完成后，麻醉下繼續(xù)用1-2%異氟烷在通過下行氣 管的開口吸入的氧氣。利用壓電薄膜接觸胸壁自主呼吸監(jiān)測。升氣管連接到 Picospritzer三（派克漢尼汾公司，克利夫蘭，俄亥俄州，美國）通過使空氣（模仿B0.15ml潮氣量

33、）進氣管來調(diào)節(jié)鼻腔氣流。鼻氣流被調(diào)節(jié)奏的一半，同 樣加倍的自主呼吸頻率（1.6赫茲）。鼻氣流被調(diào)制為0.8, 1.6或3.2赫茲和 使用熱敏電阻作為下面詳細描述的放置在鼻孔的前面進行了監(jiān)測。嗅球的電刺激。調(diào)查是否在晶須桶皮質(zhì)局部場電位的活性可以通過在沒有鼻氣 流的嗅球的電刺激來調(diào)節(jié)，我們在麻醉，tracheomotized小鼠中進行的實驗（N +3）。下阿佛丁麻醉下進行氣管切開手術(shù)，以消除鼻腔氣流，因此與呼吸 相關(guān)的延髓活動。麻醉，然后繼續(xù)使用異氟醚通過肺吸入氣管。小鼠被安裝在 立體框架，與顱骨右側(cè)晶須桶皮質(zhì)和嗅球以上被打開了。記錄電極插入晶須桶 皮質(zhì)。同心雙極刺激電極被降低到嗅球的完整硬腦膜

34、。我們電刺激與節(jié)奏刺激 模式組成的刺激與間列車間隔為1.25，0.62和0.28的S50Hz的列車的燈泡， 對應(yīng)于0.8，1.6和3.2赫茲，分別刺激節(jié)奏。刺激的列車包括了使用50或80 毫安刺激電流10毫秒當(dāng)前步驟。我們保留了列車次數(shù)步驟持續(xù)時間恒定，同時 改變脈沖的數(shù)目，以產(chǎn)生不同的刺激frequencies.The刺激列車有30個，15個 和8的電流的步驟為0.8，1.6和3.2Hz刺激 節(jié)奏，分別為。創(chuàng)造低氧條件。我們通過使老鼠1分鐘至缺氧（B10%氧）的空氣，同時連續(xù) 地記錄所述局部場電位增加的呼吸活動的頻率。為此，定制設(shè)計的塑料蓋被放 置在鼠標(biāo)離開進入到錄音室和頭部后通過的開口的頂

35、部。呼吸行為，如上所述 與一個熱敏電阻進行了監(jiān)測。的空氣在腔室中的組合物是通過在1/0的比率混 合的大氣用氮氣控制常氧和半缺氧條件。氣以1 lmin_1的速率流入所述腔室。一個氧氣分析儀（GB-300，Teledyne公司的分析。INSTR。，工業(yè)城，CA，USA的）連續(xù)監(jiān) 測腔室中的O 2濃度。以下至少5分鐘穩(wěn)定LFP記錄的，將小鼠暴露于缺氧空 氣（10%O2） 1分鐘，接著在常氧的空氣。呼吸頻率，血氧飽和度和心臟率使 用MouseOx （斯塔爾生活Sci.Corp。美國匹茲堡）測定，并與電生理數(shù)據(jù) 前，中，暴露在空氣中缺氧后，一起記錄。分析局部場電位。LFP數(shù)據(jù)收集在清醒，頭部固定條件從五

36、個完整和六嗅覺 bulbectomized小鼠。初步分析鑒定涉及的LFP活動的respiratoryactivity的相 關(guān)性和靜止呼吸節(jié)律的頻率。被選擇用于進一步分析的穩(wěn)定的靜息呼吸節(jié)律（5Hz）期間。相干分析主要集中在靜息呼吸的頻率范圍（1-3赫茲），不包 括與嗅探的短暫發(fā)作相關(guān)的較高的呼吸速率。分別計算各對同時記錄呼吸和LFP信號，以及每個信號的自相關(guān)（圖1）的交 叉相關(guān)。呼吸頻率被確定為從呼吸信號后0.5和10赫茲（第4階Butterworth 濾波器）之間的帶通濾波來計算功率譜的峰值頻率。相位的呼吸節(jié)律或鼻氣流和LFP振蕩之間的鎖定通過計算這兩個信號之間的相 干性評估。一致性譜估計以

37、下列方式：靜息呼吸的50-S段和LFP信號服役的 呼吸，LFP連貫性的估計。這些細分市場的進一步細分19子段5 sduration有 2.5秒的重疊。為每個子段，計算theautospectrum每個信號和所述與呼吸 LFP信號的交叉譜的分開。的自相關(guān)和互譜進行平均在50-S段，平均交叉頻 譜進行歸一化的平方根的呼吸和LFP信號的平均值autospectra的。比較正常 和bulbectomized小鼠呼吸，LFP 一致性的程度，我們從每個相關(guān)頻譜帶的連 貫性值在相應(yīng)的呼吸頻率和測試的區(qū)別在相干值兩組與曼的意義Whitney U檢 驗。當(dāng)我們進行的時間分辨方式的相干性分析，我們采樣的9 - S

38、的重疊連續(xù) 10秒的段（即，步長為1秒的變化），并采用上述的相干譜估計到每個10秒 的段與1-S子段0.5-S重疊。研究了 LFP活動的交叉頻率相位振幅耦合，我們從LFP提取錄像的振蕩相位 FFP ETT和振幅詠ETT在時間t，并在兩個不同的頻率，分別，也就是說，相 位頻率fp和振幅頻率fa。用于該提取中，我們所用的子波變換與在時間t和頻 率定義的 F 之類 pffifffiffi_ EXP 2PF eu_tT_ exp_eu_tT2_= e2s2T_AMorlet 小波。的參數(shù)s被設(shè)置為10/（1207米），使得小波包含振蕩約10個周期。 將所得到的振幅除以它的均值，以使絕對振幅值，這依賴于

39、頻率，不影響即將 舉行的相位-幅度耦合分析的結(jié)果。頻率發(fā)和FP之間的相位-幅度的耦合程度，測定與平均向量長度MVL? 1T RT0 XFA; FP etTdt（式（1），其中T是信號和XFA的持續(xù)時間，F(xiàn)P是指XFA復(fù)合信號；FP ETT_詠ETT EXP iffpETTI （公式（2）。相位頻率fp被固定在呼吸頻率，推定為呼吸信 號的功率譜的峰值頻率。幅頻發(fā)是不同的取值范圍為1256 Hz之間的頻率，均 勻采樣對數(shù)刻度。要測試的平均向量長度的意義，是從原始信號施加隨機相移 為原始信號的每個傅立葉系數(shù)在頻域，然后反比傅立葉變換的隨機信號返回到 生成千相位隨機化的替代物時域。平均向量長度是完全相

40、同的方式對原始信號 計算出的每個人。原來的平均矢量的長度被認(rèn)為是顯著高，如果它超過了 95百 分位的替代平均向量的長度。平均向量長度計算從人工制品的免租期抽樣錄音的50-S段。對于每個正常小 鼠，獲得了 2-3個樣品，例如人造體的無段。對于每個bulbectomized小鼠中 的50 - S的一個段被采取。分析扣球活動。二清醒，頭部固定小鼠，記錄扣球活動晶須桶皮質(zhì)，同時監(jiān)測呼吸的行為?？矍蚧顒愉浀霉?2個站點，每個鼠標(biāo)6。秒殺活動采用固定閾值 提取。如果信號尖峰信號的信噪比是大于四間尖峰時間間隔有一個不應(yīng)期 45MS，我們把它作為一個獨立的單元伽瑪分布（N？ 3）。所有其他秒殺列車 被視為多單

41、元的信號（N？ 9）。該脈沖序列進行卷積，以單位面積的高斯和 S2.5毫秒，并且將得到的函數(shù)率與呼吸信號（即，熱敏電阻器電壓輸出）。為 了確定穗呼吸相關(guān)的重要意義，我們通過隨機移動的相對時間秒殺列車呼吸時 間產(chǎn)生的替代關(guān)系。穗列車可以通過0秒和記錄的完整時間之間的任意值轉(zhuǎn)移 的時間。所有尖峰時間是由相同的值移位，保留峰值間隔序列。該過程重復(fù) 100次，每次計算移位脈沖序列的相關(guān)性，并節(jié)省了相關(guān)值。從這些100的替 代關(guān)系，我們計算出的中值相關(guān)系數(shù)的分布在每個延遲時間的第5和第95百 分位數(shù)。相關(guān)性被認(rèn)為是顯著如果原始相關(guān)系數(shù)的值超過了替代分布的第五或 第95百分位數(shù)（圖2）。跟蹤研究。五只大鼠

42、麻醉（腹腔注射）與氯胺酮/甲苯噻嗪（100/10毫升 kg_1），并放置在一個立體框架（Stoelting，Wood Dale 的，IL，USA）。頭 皮被打開了中線切開，腦袋被調(diào)整咬欄前囟和lambda之間夷為平地。體溫維 持在35度C使用加熱墊。玻璃微吸管填充5%熒光金（FG，熒光染料，有限 責(zé)任公司，科羅拉多州丹佛市，美國）下降到每桶皮質(zhì)和示蹤劑（正位_1.0毫 米，正中側(cè)面3.8毫米，背腹_0.3毫米？ ？）通過離子導(dǎo)入（精密電流源， Stoelting有限公司伍德戴爾，IL，USA）注射，在2毫安（周期8秒開和8秒 關(guān)），共20分鐘。注射移液管留在原處的前和注射后10分鐘。補充麻醉給予 必要在整個手術(shù)保持在深度麻醉的動物。經(jīng)過5天的存活期，小鼠用磷酸鹽緩沖鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注。取出大 腦并放入4%多聚甲醛中1天，然后轉(zhuǎn)移到30%緩沖蔗糖溶液，并儲存在4_C 為至少1周。冠狀切片（40毫米，每一個其他部分）中連續(xù)使用冷凍切片機切 割。FG可以使用熒光顯微鏡觀察，所以沒有進一步的組織學(xué)處理是必要的。