熱處理對(duì)放大及量化的轉(zhuǎn)基因和非自然和玉米DNA的影響

1、熱處理對(duì)放大及量化的轉(zhuǎn)基因和非自然和玉米DNA的影響Eva Bergerov & Zuzana Hrnrov &Monika Stankovsk & Miroslava Lopaovsk &Peter SiekelReceived: 6 May 2009 /Accepted: 2 October 2009 /Published online: 21 October 2009# Springer Science + Business Media, LLC 2009關(guān)鍵詞：GMO。熱治療，DNA降解，DNA擴(kuò)增，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)抽象處理植物原料的原因發(fā)生芮妮退化的DNA的食物。DNA的影響退化的放

2、大和量化反式-基因和非轉(zhuǎn)基因DNA在原材料和實(shí)驗(yàn)熱食品加工過(guò)程進(jìn)行了研究。DNA的程度退化被瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。十六烷基三甲基溴化銨的方法取得更好的DNA質(zhì)量,而Genespin和向?qū)Р惶线m?？驹?20C大大減少DNA的大小碎片。為了衡量amplifiable的長(zhǎng)度DNA引物對(duì)大豆和玉米的基因。小的DNA片段,從100年到200年英國(guó)石油公司在所有樣品放大。DNA片段超過(guò)kbp放大只有加熱在220C持續(xù)了不到30分鐘。烘烤面粉(220C)減少提取DNA的大小片段,擴(kuò)增子不再是1100個(gè)基點(diǎn)amplifiable,amplicons 913和1100個(gè)基點(diǎn)從烤面包。當(dāng)P

3、CR分析目標(biāo)玉米高機(jī)動(dòng)組和玉米蛋白的基因相同的條件下,取得了類(lèi)似的結(jié)果。量化的轉(zhuǎn)基因生物的內(nèi)容不會(huì)受到烤嗎介紹使用定量聚合酶鏈基于DNA的方法反應(yīng)(PCR)開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因植物材料(國(guó)際組織Standardiza -2005)。申請(qǐng)人的責(zé)任是提供方法探測(cè)和識(shí)別特定的反式-在歐盟形成事件提交授權(quán)的社區(qū)參考實(shí)驗(yàn)室的職責(zé)轉(zhuǎn)基因食品和飼料(CRL-GMFF)測(cè)試建立和驗(yàn)證所提供的方法。為了為應(yīng)對(duì)越來(lái)越多的應(yīng)用檢測(cè)和授權(quán),一些新的方法量化轉(zhuǎn)基因生物體(GMOs)最近通過(guò)CRL-GMFF也的成員GMO的歐洲網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室(阿奎萊拉等艾爾。2008年,2009;Bellocchi et al . 2008;羅斯et

4、al . 2008;elet al . 2008年)。當(dāng)前狀態(tài)和未來(lái)的發(fā)展最新的分析方法,描述instru -心理狀態(tài)和標(biāo)準(zhǔn)化的方法綜述了轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)測(cè)(埃爾南德斯等人2005;Rodrigues-Lazaro et al . 2007年)。由申請(qǐng)人是用于開(kāi)發(fā)的方法植物原料,沒(méi)有考慮的變化在加工過(guò)程分析成分的處理食物引發(fā)DNA降解,可能影響食物分析基于DNA cereal-derived食品(Gryson等艾爾。2002年肉類(lèi))和植物材料的產(chǎn)品(邁耶et al . 1996年)。烘焙引入限制而聞名大豆的pcr檢測(cè)小麥面包版(Straub寫(xiě)et al . 1999年)。另一方面,實(shí)時(shí)PCR已成功

5、用于肉類(lèi)在高度量化嗎加工過(guò)的肉類(lèi)。結(jié)果表明,amplicons多達(dá)351堿基對(duì)比小公司同樣適用; 此外,他們有更高的特異性的優(yōu)勢(shì)(Hird et al . 2006年)。歐洲議會(huì)需要標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因生物的內(nèi)容在食品,但原始的分析方法開(kāi)發(fā)植物材料只(2001年歐洲,2001)。食物的過(guò)程,荷蘭國(guó)際集團(tuán)(ing),和與它相關(guān)的DNA降解,可能影響分析結(jié)果的質(zhì)量。然后,宣布GMO的內(nèi)容加工食品可能低估或高估(Berdalholst - jensen 2001),這可能會(huì)誤導(dǎo)消費(fèi)者GMO的標(biāo)簽內(nèi)容是必須的,不是必需的這是不到0.9%的意外和技術(shù)不可避免的外加劑。統(tǒng)計(jì)上顯著的差異量化的轉(zhuǎn)基因原材料之間的內(nèi)容

6、試制加工食品被發(fā)現(xiàn)(飾等al . 2005年)。相反,其他結(jié)果顯示物理退化的DNA沒(méi)有影響檢測(cè)(赫斯特et al . 1999年)和相對(duì)量化的轉(zhuǎn)基因的內(nèi)容(Debode et al . 2007年)。在這個(gè)背景下,恩格爾et al .(恩格爾et al . 2006年)要求更多實(shí)驗(yàn)表明,無(wú)論是食品成分和處理相對(duì)quantifi的真實(shí)的影響轉(zhuǎn)基因食品的陽(yáng)離子。大豆和玉米是最突出的基因修改后的糧食作物(詹姆斯2008)。食品的檢測(cè)組件主要是基于典型的識(shí)別蛋白質(zhì)或DNA。蛋白質(zhì)是溫的,一般來(lái)說(shuō),不適合作為分子分析的目標(biāo)。的DNA檢測(cè)和量化的首選方法PCR(Michelini et al . 2008

7、年)。在我們的研究中,發(fā)酵大豆和玉米的影響在220C DNA和轉(zhuǎn)基因DNA的完整性?xún)?nèi)容的面粉和面包。一個(gè)溫度220C一般用于面包烘焙技術(shù)。一組引物的設(shè)計(jì)獲得不同大小的amplicons監(jiān)測(cè)DNA降解的能力大豆和玉米和他們的產(chǎn)品。材料和方法植物材料大豆(大豆l .美林)、玉米(玉米l .)內(nèi)核和面粉從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)布拉迪斯拉發(fā),斯洛伐克共和國(guó)。MON 810的樣品玉米和大豆抗農(nóng)達(dá)獲得Agrokomplex(Kunovice,捷克共和國(guó))和Merkanta國(guó)際(布拉迪斯拉發(fā),斯洛伐克共和國(guó)),分別為。大豆粉的通用內(nèi)容之前確定為96%。傳統(tǒng)的非轉(zhuǎn)基因大豆粉(克朗)被用來(lái)建立一個(gè)樣本范圍14%和0.8%

8、的轉(zhuǎn)基因成分。同樣的, 他玉米MON 810面粉含有的26%和2.1%轉(zhuǎn)基因組件使用非轉(zhuǎn)基因成立玉米面粉。干燥加熱的面粉和烤面包大豆和玉米面粉,包括準(zhǔn)備好大豆和玉米MON 810年干燥加熱100C和220C的面粉樣品上了每隔60分鐘,然后DNA提取和分析通過(guò)在1%瓊脂糖凝膠電泳(美國(guó)賽瓦,海德堡德國(guó))在1 xtae緩沖和溴化乙錠染色,其次是定性和定量PCR。大豆和玉米內(nèi)核被稱(chēng)其為好面粉。從傳統(tǒng)的餅餅制備與添加轉(zhuǎn)基因大豆和玉米抗農(nóng)達(dá)大豆和MON 810玉米面粉。修改后的加拿大短先進(jìn)配方面包生產(chǎn)使用(Shewry和Lookhart 2003)。的面團(tuán)是25克面粉做的,10 g大豆(或者玉米)面粉、

9、1.4 g蔗糖,0.2 g麥芽、0.84克食鹽,1 g的烹飪?nèi)嗽禳S油,0.7 g酵母、0.035 g磷酸銨,0.0053 g抗壞血酸和21.7毫升的飲用水。三十分鐘后上升,面團(tuán)烤45分鐘在預(yù)熱220C烤箱(FN 032 - FN - 55120、Nuve安卡拉,土耳其)。DNA提取內(nèi)核和食品樣品被混合器單一化 AY47R1(Moulinex,巴塞羅那,西班牙)。面粉是已篩獲得粒徑范圍在0.2 - -0.8毫米,隨后,DNA提取。三種不同的方法和比較。每個(gè)面粉的分?jǐn)?shù)十六烷三甲基銨提取一式三份溴銨(CTAB)法(國(guó)際組織標(biāo)準(zhǔn)化2009),或GeneSpin工具包(Teltow基因檢測(cè),德國(guó))并通過(guò)

10、向?qū)Щ蚪MDNA純化工具包(美國(guó)Promega、麥迪遜、作業(yè)指導(dǎo)書(shū))。DNA濃度是確定UV-spectrophotometrically在260毫米提取;然后,手段和標(biāo)準(zhǔn)偏差沒(méi)把-遲來(lái)的。DNA分析electrophoretically的完整性1.0%瓊脂糖凝膠(美國(guó)賽瓦、海德堡、德國(guó))1 xtae緩沖區(qū)和溴化乙錠染色。100年,250 - bp梯(英杰公司)是用作DNA片段的大小標(biāo)準(zhǔn)。凝膠運(yùn)行1.5 h 75 V.cm1。PCR檢測(cè)的DNA降解在定性PCR是用于監(jiān)控的DNA退化。它是25l卷使用GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,培育美國(guó)城市,CA)或BioRad iCycl

11、er(熱循環(huán),Sergate、意大利)。PCR變性的定性PCR涉及40個(gè)周期在95C 30秒,退火60C。30秒和聚合為1分鐘。最初的72C變性在95C 5分鐘,最終擴(kuò)展72C 10分鐘。反應(yīng)混合物由1 x集中PCR緩沖(試劑盒、希爾登,德國(guó)),1.5 mmol.l1MgCl2,200年mol.l1dNTP(美國(guó)表達(dá)載體,卡爾斯巴德,CA),0.3mol.l1引物如表1所示,1 U HotStarTaq酶(試劑盒)和1l DNA的解決方案。的序列在基因庫(kù)(國(guó)家生物技術(shù)中心信息,馬里蘭州貝塞斯達(dá)美國(guó)),加入數(shù)字在括號(hào)中大豆凝集素(AY342212)epsps基因(AJ783418),玉米高機(jī)動(dòng)組

12、(郵政編碼;X72692)和玉米蛋白基因(AF465640)被用于引物的設(shè)計(jì)。這是由程序Primer3(懷特黑德美國(guó)劍橋?qū)W院,馬)。Amplicons進(jìn)行分析在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。量化在加工食品轉(zhuǎn)基因的內(nèi)容實(shí)時(shí)PCR用于量化的轉(zhuǎn)基因的內(nèi)容。它是25lvolumes使用GeneAmpPCR系統(tǒng)9700或BioRad iCycler。涉及的定量PCR 45 PCR的周期變性在95C 30年代,退火60C30年代和擴(kuò)展為1分鐘。最初的72C變性在95C 5分鐘,最終擴(kuò)展72C 10分鐘。反應(yīng)混合物由1 x集中PCRmmol.l緩沖區(qū)(試劑盒),2.51200年MgCl2mol.l1dNTP,0.

13、3mol.l1引物如表1所示,1 U HotStar250 nmol.l Taq酶(試劑盒)1探測(cè)器和2.5lof大豆和玉米DNA在TE緩沖溶液。大豆凝集素的序列在基因庫(kù)(AY342212)和epsps基因(AJ783418)和玉米郵政編碼(X72692)和玉米蛋白基因(AF465640)被用于引物設(shè)計(jì)。引物和探針合成操縱子(德國(guó)科隆)。探針標(biāo)記了記者染料FAM 5和冷卻器染料TAMRA結(jié)束3端。轉(zhuǎn)基因認(rèn)證包含5%的參考資料,2%、1%、0.5%、2%和0%的抗農(nóng)達(dá)大豆研究所或玉米MON 810質(zhì)量%的參考材料和測(cè)量(Geel、比利時(shí))。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)表現(xiàn)在96年好盤(pán)子由光學(xué)帽或光學(xué)電影(應(yīng)用

14、生物系統(tǒng))。盤(pán)子是centrifuged(Labofuge 400 r;3396g)消除氣泡的井。參考資料是用于建設(shè)校準(zhǔn)曲線。轉(zhuǎn)基因的DNA從樹(shù)葉中提取植物作為積極的控制。負(fù)控制樣品包括從主只和沒(méi)有DNA補(bǔ)充道。從大豆中提取的DNA或玉米(轉(zhuǎn)基因和非GMO)的CTAB法稀釋樣品40 ng.l1的DNA。2.5l DNA溶液的體積使用,所有的反應(yīng)都是在triplicates運(yùn)行。放大大豆凝集素基因的片段(78個(gè)基點(diǎn)),epsps -基于基因構(gòu)造(84個(gè)基點(diǎn)),玉米基因(79個(gè)基點(diǎn))和尿促玉米蛋白基因(92個(gè)基點(diǎn))被用于DNA量化。的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)了0.98 - -1.0的相關(guān)系數(shù)對(duì)應(yīng)于PCR9

15、9.2 - -99.7%的效率。轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)容未稀釋的樣品之前確定為96%,Ct值21.5是21.5 epsps基因和外源凝集素基因。自如此高的轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步內(nèi)容是不現(xiàn)實(shí)的實(shí)驗(yàn)中,傳統(tǒng)的非轉(zhuǎn)基因大豆面粉(克朗)是用來(lái)稀釋這個(gè)范圍的14%和0.8%。玉米MON 810樣本VUZV Kunovice(DXP 138 f和DKL 138 c)含有轉(zhuǎn)基因玉米的31%和4.2%。玉米蛋白基因的Ct值為25.0,25.0郵政編碼基因的轉(zhuǎn)基因玉米31%;28.5玉米蛋白基因,為21.8郵政編碼基因的轉(zhuǎn)基因玉米的4.2%。轉(zhuǎn)基因玉米面粉與傳統(tǒng)非轉(zhuǎn)基因稀釋(文斯,克朗)為了獲得一個(gè)更低的轉(zhuǎn)基因的內(nèi)容。這是確定為

16、26%和2.1%。結(jié)果與討論在我們的研究中,我們研究了粒子的組合效果面粉和熱處理溫度的大小DNA的DNA提取的有效性和完整性放大,發(fā)酵過(guò)程的影響相對(duì)量化轉(zhuǎn)基因DNA的面粉和面包。三種不同的方法被用于基因組DNA提取。使用通過(guò)CTAB CTAB(沉淀DNA解決方案),GeneSpin工具包(綁定DNA二氧化硅膜)和向?qū)Х椒?綁定DNA磁跳動(dòng))提取的DNA烘烤后的產(chǎn)品有不同的效率(表2)。高收益低質(zhì)量的DNAGeneSpin設(shè)備(A260/280A:1.3)。低產(chǎn)量的DNA提取(20 - 70g.ml1)是一個(gè)缺點(diǎn)向?qū)У姆椒?。CTAB方法同樣有效從原材料和熱處理材料進(jìn)行DNA提取(濃度160 -

17、320g.ml1A260/280A:1.9 - -2.00)顆粒大小和沸騰的影響DNA提取被發(fā)現(xiàn)是重要的。原材料的顆粒大小煮食物樣本(100C)效果的影響DNA提取如表3所示。較小的粒子顯示更好的可萃取性。這可能是heoretically預(yù)期和對(duì)應(yīng)的結(jié)果早些時(shí)候發(fā)表(Moreano et al . 2005年)。DNA提取性ncreased沸騰,達(dá)到最大30分鐘,800 - 1400年g.ml的收益率1DNA,根據(jù)顆粒大小。更好的可萃取性的原因可能是不同降解的高分子-重量DNA在熱處理后的開(kāi)始更嚴(yán)厲的退化60分鐘后,當(dāng)金額提取出的DNA的100年g.ml下降1甚至ess。支持這個(gè)解釋的證據(jù)泡利

18、et al。(2000)。他們顯示,但不能xplain,至少處理小麥產(chǎn)品(谷物)了最低數(shù)量的DNA。這是(Moreanot。2005),事先準(zhǔn)確地量化djusted GMO內(nèi)容(1%)是唯一可能的樣本有類(lèi)似的粒度。如果DNA提取lours不同粒度的顯著差異他決心GMO的出現(xiàn)導(dǎo)致其內(nèi)容低估或高估從0.2%上升到4.3%Moreano et al . 2005年)。PCR分析烘焙的面包(220C)顯示減少的時(shí)間提取DNA的大小依賴(lài)的方式。在大豆DNA的完整性樣品烤45分鐘在220C,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和PCR,明顯降低時(shí)間,雖然大型DNA的DNA降解面包沒(méi)有完全完成,經(jīng)放大的1100個(gè)基點(diǎn)擴(kuò)增子(

19、無(wú)花果。1和2)。大的擴(kuò)增子(1100個(gè)基點(diǎn))面包烤amplifiable 220C,而相同的擴(kuò)增子不是amplifiable烤面粉顯然更好的傳熱和更高級(jí)的DNA降解在面粉面包。類(lèi)似的烘烤對(duì)DNA完整性的影響也是前面描述的(Kollaroviet al . 2005;Moreano et al . 2005;Gryson et al。2007年,2008;Hrnirova et al . 2008年)。Hird et al。(2006)沒(méi)有顯示或者在放大的小差異煮或烤的肉樣品相比原始樣本amplicons從81到240個(gè)基點(diǎn)。然而,更嚴(yán)酷的治療,如罐裝或高壓滅菌、明顯所有amplicons c

20、antly增加CT值,是最高大的(Hird et al . 2006年)。通用內(nèi)容的相對(duì)量化的面包餅被進(jìn)一步研究。定義的綜述準(zhǔn)備好大豆或玉米MON 810添加了面粉面團(tuán)和烤在預(yù)熱烤箱220C。的樣本分析來(lái)自不同地區(qū)的大豆面包:從上地殼,地殼和底部從中間的面包。烤在量化測(cè)定的影響實(shí)時(shí)PCR(表4)。這是證明不同發(fā)酵時(shí)間60分鐘的面粉和45分鐘面包沒(méi)有顯著影響的量化抗農(nóng)達(dá)大豆成分。類(lèi)似的結(jié)果是通過(guò)使用玉米粉(表5)。Moreano et al。(2005)強(qiáng)調(diào),需要平等的長(zhǎng)度GMO的amplicons轉(zhuǎn)基因和參考基因量化的目的。如果轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增子是25個(gè)基點(diǎn)大于參考基因,轉(zhuǎn)基因的內(nèi)容低估了,反映出退

21、化的青睞時(shí)間序列用于轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。在相反,如果重組擴(kuò)增子bp小于16歲基因,轉(zhuǎn)基因的引用內(nèi)容被高估了(Moreano et al . 2005年)。在我們的實(shí)驗(yàn)裝置,沒(méi)有熱處理后監(jiān)控的重要影響60分鐘兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的內(nèi)容比例(26%水平和14%)觀察(表4和5)是很重要的注意,使用高百分比的轉(zhuǎn)基因DNA。這可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性結(jié)果,作為商業(yè)上可用的參考資料最終在5%。在與我們的研究結(jié)果相反,飾等人建議PCR產(chǎn)物的大小有一個(gè)關(guān)鍵的角色量化的轉(zhuǎn)基因生物加工食品。它可能的情況下如果amplicons轉(zhuǎn)基因和不同的大小taxon-specific植物基因被用于量化(飾et al . 2005 b)。他們

22、也提出了這個(gè)問(wèn)題GMO原料的轉(zhuǎn)基因含量反映如何加工食品中的內(nèi)容。這個(gè)問(wèn)題的答案是獨(dú)特的因?yàn)镈NA降解可能不是嗎轉(zhuǎn)基因的平等與taxon-specific DNA,因?yàn)镚C含量的差異反映了原核的起源轉(zhuǎn)基因。在我們的實(shí)驗(yàn)中,DNA量化結(jié)果不會(huì)受到熱處理。的不同大小的矩陣粒子用于食品DNA提取更相關(guān)的可能來(lái)源差距在GMO原料和加工食品的內(nèi)容,早些時(shí)候發(fā)表的類(lèi)似結(jié)果(Moreano et al . 2005年)?？紤]到這些發(fā)現(xiàn),其他結(jié)果(Moriuchiet al . 2007;Debodeetal。2007)和我們的結(jié)果,我們得出這樣的結(jié)論量化的原始和烘焙食品轉(zhuǎn)基因含量可比,在實(shí)踐工作。DNA監(jiān)測(cè)粒

23、子大小和PCR表明降解矩陣依賴(lài)于時(shí)間的熱處理有顯著的影響從食物中提取DNA的數(shù)量矩陣。我們也表明,加熱減少DNA的完整性對(duì)應(yīng)的時(shí)間。的最大amplicons獲得烘焙顯示大小相似溫度依賴(lài)性研究矩陣。的最大尺寸的PCR獲得的產(chǎn)品反映了DNA水平退化由于處理。面粉的顆粒大小用于DNA提取負(fù)面影響食物的量化組件,而熱處理的程度和時(shí)間的處理是微不足道的。結(jié)論DNA是由熱降解處理面包(220C),盡管碎片一樣大的1100個(gè)基點(diǎn)保持不變,烘烤后通過(guò)PCR可以放大的面包。在描述的條件下,PCR放大的大豆和玉米的成分在任何面包的一部分總是可行。DNA在細(xì)矩陣,如面粉、退化的速度,amplicons小于1100個(gè)基點(diǎn)可能被放大。的部分面包條,用于抽樣沒(méi)有影響在烤轉(zhuǎn)基因成分的量化面包。我們和其他人(范德Colff和Podivinsky2008)認(rèn)為沒(méi)有heat-processing參數(shù)轉(zhuǎn)基因的實(shí)際后果量化含量的食物。確認(rèn)本研究支持的研究農(nóng)業(yè)部項(xiàng)目”的發(fā)展進(jìn)步持續(xù)質(zhì)量改進(jìn)的方法和實(shí)踐食品生產(chǎn)和過(guò)程監(jiān)控”和雙邊斯洛伐克,捷克項(xiàng)目”的方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證有效應(yīng)用程序和控制農(nóng)業(yè)和轉(zhuǎn)基因生物的食品生產(chǎn)以滿(mǎn)足歐盟立法和國(guó)家規(guī)范”APVV-SK-CZ-0 055 - 2007。引用阿奎萊拉米、Querci米,Balla B,普洛斯彼羅,Ermolli M,Van den